Rational Design in Photopharmacology with Molecular Photoswitches

Photopharmacology is an attractive approach for achieving targeted drug action with the use of light. In photopharmacology, molecular photoswitches are introduced into the structure of biologically active small molecules to allow for the optical control of their potency. Going beyond trial and error, photopharmacology has progressively applied rational drug design methodologies to devise light-controlled bioactive ligands. In this review, we categorize photopharmacological efforts from the standpoint of medicinal chemistry strategies, focusing on diffusible photochromic ligands modified with photoswitches that operate through E-Z bond isomerization. In the vast majority of cases, photoswitchable ligands are designed as analogs of existing compounds, through a variety of approaches. By analyzing in detail a comprehensive list of instructive examples, we describe the state of the art and discuss future opportunities for rational design in photopharmacology.</p

Molecular photoswitches in aqueous environments

Molecular photoswitches enable dynamic control of processes with high spatiotemporal precision, using light as external stimulus, and hence are ideal tools for different research areas spanning from chemical biology to smart materials. Photoswitches are typically organic molecules that feature extended aromatic systems to make them responsive to (visible) light. However, this renders them inherently lipophilic, while water-solubility is of crucial importance to apply photoswitchable organic molecules in biological systems, like in the rapidly emerging field of photopharmacology. Several strategies for solubilizing organic molecules in water are known, but there are not yet clear rules for applying them to photoswitchable molecules. Importantly, rendering photoswitches water-soluble has a serious impact on both their photophysical and biological properties, which must be taken into consideration when designing new systems. Altogether, these aspects pose considerable challenges for successfully applying molecular photoswitches in aqueous systems, and in particular in biologically relevant media. In this review, we focus on fully water-soluble photoswitches, such as those used in biological environments, in both in vitro and in vivo studies. We discuss the design principles and prospects for water-soluble photoswitches to inspire and enable their future applications

Photochromic G-Protein Coupled Receptor Ligands

Diese Dissertation behandelt die Synthese, photophysikalische Charakterisierung und Anwendung von photochromen G-Protein gekoppelten Rezeptor-Liganden. Kapitel 1 beschreibt die Einbindung der bereits gut untersuchten Klassen der photochromen Dithienylethene und Fulgide in bekannte Dopamin-Rezeptor-Liganden wie 1,4-disubstituierte aromatische und Hydroxybenzoxazinon-Piperazine sowie Aminoindane. Es gelang, subtyp und funktionell selektive photochrome Liganden zu synthetisieren, welche mittels NMR-Spektroskopie und UV/VIS-Absorptionsspektroskopie charakterisiert wurden. Die photophysikalischen Eigenschaften der Dithienylethen Dopamin-Liganden wiesen eine hohe Ermüdungsresistenz in DMSO auf. Diese konnte in wässrigen Lösungen aufgrund des bekannten Twisted intramolecular charge transfer (TICT) jedoch nicht bestätigt werden. Einige Cyclopenten-Dithienylethene zeigten hohe photostationäre Zustände. Sie formten jedoch ein irreversibles Nebenprodukt, was den Abbau des Photoschalters zur Folge hatte. Bei Betrachtung der Fulgide konnten hohe photostationäre Zustände und eine Schaltbarkeit in polaren Lösungsmitteln festgestellt werden. Fulgimide mit Isopropyl-Rest wiesen ausschließlich eine Isomerisierung zwischen der offenen E-Form und der geschlossenen C-Form auf. Bei einer Konzentration von 1 nM zeigte ein offenes Isomer eines Cyclopenten-Dithienylethens eine 10-fach höhere Aktivierung des pharmakologisch bedeutenden D2S-Rezeptors als das geschlossene Isomer. Als alternativer Photoschalter wurde ein Indolyl-Fulgimid-Isomerenpaar (offen/geschlossen) entdeckt, dessen inverse Aktivierungs-eigenschaften im geschlossenen Zustand eine vierfach höhere Aktivität zeigte. Um die GPCR-regulierenden Photoschalter weiter zu optimieren und weitere biologische Erkenntnisse bezüglich des lichtinduzierten Schaltens am Rezeptor in vivo zu erhalten, müssen weitere Untersuchungen durchgeführt werden. Das Kapitel 2 handelt von peptidischen photochromen Neuropeptid Y4-Rezeptor (NPY Y4-Rezeptor) Liganden. Der NPY Y4-Rezeptor ist ein G-Protein Protein-gekoppelter Rezeptor und bindet als natürlichen Liganden das pankreatischen Polypeptid, ein Homolog des NPY. Selektive Y4-Rezeptor Agonisten wurden zur Behandlung von Fettleibigkeit vorgeschlagen. Hochpotente dimere peptidische Y4-Rezeptor (Y4R)-Agonisten, die aus zwei durch einen aliphatischen Linker verbundenen Pentapeptid-Einheiten bestehen, repräsentieren eine interessante Klasse an Y4R-Liganden. Basierend auf dieser Ligandenklasse wurden photoempfindliche Y4R-Liganden mit Azobenzolen, Azopyrazolen, Dithienylethenen und Fulgimiden synthetisiert, um strukturelle Anforderungen solcher Y4R-Agonisten bezüglich der Y4R-Bindung zu untersuchen. Die synthetisierten Y4R-Liganden beinhalten einen starren nicht aliphatischen, photochromen Linker, der ein reversibles Schalten in wässrigem Puffer ermöglicht und durchwegs hohe Y4R-Affinitäten aufweist. Dies zeigt, dass der Austausch des hochflexiblen aliphatischen Linkers durch einen weniger flexiblen photochromen Linker bezüglich der Y4R-Bindung gut toleriert wird. Unterschiede in der Affinität und Aktivierung des Y4R zwischen den jeweiligen Photoisomeren, welche sich in der räumlichen Orientierung und Flexibilität unterscheiden, waren nur gering. Dies lässt vermuten, dass die verbindende Einheit in dimeren Liganden bezüglich der Adaptierung von hoch affinen Bindungsmodi am Rezeptor eine weniger wichtige Rolle spielt. Da einige der photochromen Peptide einen schwächeren Partialagonismus als das Musterpeptid aufwiesen, könnten die vorliegenden Ergebnisse bei der Entwicklung von Y4R Antagonisten helfen. Die Synthese und biologische Untersuchung von kovalent bindenden photochromen GPCR- Liganden für die Einzelmolekülspektroskopie ist in Kapitel 3 dargestellt. Für Untersuchungen bezüglich kovalent gebundenen Photoschaltern wurden der ß2-adrenerge Rezeptor (ß2-AR) sowie der µ-Opioid-Rezeptor (µOR) betrachtet. Als hoch potente Agonisten für ß2-AR wurde BI-167107, für µOR Fentanyl verwendet. In beide Liganden wurden Azopyrazole eingebaut und kovalente Ankergruppen angefügt. Das Azopyrazol stellt die photochrome funktionale Einheit zwischen dem Pharmakophor und der Ankerposition dar. Die Änderung der Geometrie des kovalent gebundenen Liganden sollte die Bindung und Aktivierung beeinflussen. Es wurden verschiedene Synthesewege der pharmakologischen Kopfgruppe und der photochromen Einheit mit einer kovalenten Struktur, wie einem Disulfid oder einem Maleimid, entwickelt. Als entscheidender und letzter Schritt der Synthese der ß2-AR-Liganden wurde eine reduktive Aminierung durchgeführt, welche den kovalent bindenden Photoschalter mit der pharmakologischen Kopfgruppe verbindet. Die µOR-Liganden wurden mit einer Disulfid-Schutzgruppe oder durch post-Funktionalisierung eines Azopyrazol-Fentanylazides synthetisiert, wobei eine Maleimid- und N-Hydroxysuccinimidester-Funktion mittels Click-Reaktion installiert wurde. Die Untersuchung der photophysikalischen Eigenschaften der photochromen Liganden ergab eine sehr gute Ermüdungsresistenz und große thermische Halbwertszeiten der Azopyrazole. Erste biologische Untersuchungen zeigten hohe Bindungsaffinitäten für beide kovalente ß2-AR-bzw. µOR-Liganden am jeweiligen Wildtyp-Rezeptor und deutlich höhere Affinitäten an den verwendeten Mutanten der Rezeptoren. Hohe intrinsische Aktivitäten zeigten die synthetisierten Liganden in Experimenten mit ß-Arrestin-Assays (für ß2-AR) bzw. G-Protein-Aktivierung (für µOR). Letztendlich waren die Unterschiede in der Wirkung und Bindung zwischen den jeweiligen Photoisomeren nur gering. Da diese ersten Untersuchungen noch nicht die kovalente Bindung der Liganden berücksichtigten, sollten weitere Untersuchungen zur irreversiblen Bindung und der damit verbundenen Auswirkungen auf die Funktionalität durchgeführt werden, um ein besseres Verständnis der kovalenten Natur der Liganden zu bekommen

Bifunctional chemical tools for the conditional control of targeted protein degradation

The ubiquitin-proteasome system (UPS) is a key pathway involved in protein homeostasis via the regulation of intracellular protein levels. The application of proximity-induced biology to the UPS has given birth to proteolysis targeting chimeras (PROTACs), which are bifunctional molecules able to co-opt an E3 ligase for the ubiquitination and proteasome-dependent degradation of a selected protein. Targeted protein degradation (TPD) with PROTACs is now established as a disruptive modality both in chemical biology and drug discovery as it allows the efficient knockdown of an intracellular protein with a small molecule in a catalytic manner. With their unique mode of action and modular synthesis, PROTACs are being developed as therapeutics for various human diseases. In order to enable discrete control over PROTACs function, our first investigation used light as a precision tool for the spatiotemporal activation of caged and photoswitchable degraders. The design, synthesis, photochemistry, and cellular activity of novel light-activated PROTACs is reported. Furthermore, with the ambition to apply such tools in vivo, non-conventional light sources were explored to activate the degraders and overcome the limitations of ultraviolet and visible light. In a second approach, variation in intracellular oxygen concentration was used as a means to selectively activate PROTACs. Incorporation of a bioreductive unit on a degrader followed by testing in a hypoxic environment is presented. In summary, this thesis describes our investigation towards the conditional control of TPD with newly designed bifunctional degraders which may help better study and tackle disease-relevant proteins.Open Acces

Functionalized Photochromic Scaffolds for Biological Applications

The major part of this thesis (Chapter 1 – 3) focuses on the functionalization of different photochromic scaffolds for biological applications. Chapter 4 deals with a modified dye for purification of triplex DNA. Chapter 1 describes different synthetic routes to photochromic dithienylmaleimides functionalized either at each of the thiophene moieties or at the maleimide nitrogen. A Perkin-type condensation of two independently prepared thiophene precursors was successfully employed as the key step to assemble the maleimide core for non-symmetric diarylmaleimides. Thus, a photoswitchable amino acid was obtained and a variety of aromatic substituted dithienylmaleimides were synthesized by applying a Suzuki coupling strategy prior to the condensation. A different synthetic approach gave access to photochromic labeled natural amino acids as well as maleimide protected dithienylmaleimides by the reaction of a dithienylmaleic anhydride with amines or hydrazines. All prepared photoswitchable compounds exhibited reversible photochromism in polar organic solvents. Photoswitchable histone deacetylase (HDAC) inhibitors are presented in Chapter 2. These inhibitors were gained by equipping dithienylethenes (DTEs) and fulgimides with hydroxamic acids to enable binding to zinc dependent HDACs. The control of these enzymes is of high biomedical interest in anticancer research and epigenetics due to their crucial role in numerous biological processes. While the photochromic performance of the two prepared classes of DTEs was only moderate in polar solvents the fulgimides featured excellent reversible photochromism even in aqueous buffer with very high photostationary states. All synthesized target compounds showed the anticipated inhibitory effect on the tested hHDAC1, hHDAC6, hHDAC8 and smHDAC8 with best IC50 values in the low nanomolar range. However, the corresponding photoisomers showed only a maximum four-fold difference in inhibitory ability. The differences in activity observed in the in vitro experiments could be rationalized by molecular dockings. Chapter 3 reports the synthesis and biological evaluation of photochromic ligands for modulation of γ-aminobutyric acid (GABA) and glycine-receptors by light. Therefore, photochromic ligands were synthesized by merging structural elements of nitrazepam and nicardipine, which are well-known pharmacophores for ion channels, with photoswitchable azobenzenes. The photochromic properties of the ligands were outstanding with very good fatigue resistance and high photostationary states. Initial in vitro electrophysiological investigations identified one azo benzodiazepine as very promising ligand. This compound acted not only as a UV sensitive blocker of GABAA-receptors, but also as subtype specific photoswitchable modulator of glycine-receptors. Preliminary molecular dockings could partly explain these experimental effects. Furthermore, in vivo investigations of the photochromic ligands were performed and another azo benzodiazepine showed photoswitchable influence on the activity of zebrafish larvae. The attempt to purify triplex DNA with a biotinylated thiazole orange derivative, which was synthesized by azide-alkyne click chemistry, is described in Chapter 4. Biological investigations of the functionalized compound could prove that the prepared thiazole orange kept the ability to stabilize triplexes against competitor oligonucleotides. However, a loss of overall affinity and specificity to triplex DNA was observed, which disqualified the biotinylated thiazole orange for a utilization to purify triplexes. Overall, this thesis presents functionalized synthetic compounds for biological applications. In particular, the contributions of this work are relevant for the future development of novel molecular tools to light-control cellular processes or living organisms

Synthese und Charakterisierung E/Z-photoisomerisierbarer Inhibitoren zur reversiblen Modulation der Deacetylase-Aktivität von Sirtuinen

Sirtuine stellen eine Familie der Lysin-Deacetylasen dar, die sich durch Verwendung des Kofaktors NAD+ auszeichnen und an der Regulation zentraler zellulärer Prozesse, wie beispielsweise der Gentranskription, der Apoptose und des Energiestoffwechsels, beteiligt sind. Basierend auf einer mäßig aktiven, stilbenoiden Leitstruktur mit schwach ausgeprägter Isoenzym-Selektivität wurden verschiedene Strukturanaloga synthetisiert und deren Einfluss auf die Deacetylase-Aktivität der humanen Sirtuine Sirt1–3 ermittelt. Azologisierung der Leitstruktur führte weiterhin zu Phenylazopyridinen sowie Azobenzenen, deren Eignung als molekulare Sirtuin-Photoschalter anhand der photophysikalischen Eigenschaften und des photochemischen Verhaltens in wässriger Umgebung bestimmt wurde. Einige Verbindungen zeigten eine submikromolare inhibitorische Aktivität im thermischen Gleichgewicht, welche durch Bestrahlung mit UV-Licht um das Vierfache verringert werden konnte. Langkettige Fettsäure-Derivate führten hingegen zu hochselektiven Sirt2-Inhibitoren, deren biologische Aktivität sich durch eine lichtabhängige Steigerung der wässrigen Löslichkeit induzieren ließ.Sirtuins refer to a family of NAD+-dependent lysine deacetylases that is involved in the regulation of crucial cellular processes as gene transcription, apoptosis and energy metabolism. Based on a moderately active but unselective lead structure, a small set of analogous stilbenoid compounds was synthesized and examined for their influence on the deacetylase activity of the human sirtuins Sirt1–3. Furthermore, azologization yielded several phenylazopyridines and azobenzenes, whose performance as molecular photoswitches was examined in an aqueous environment. For some compounds, inhibitory activity reached the sub-micromolar range in the thermal equilibrium and could be reduced by a factor of four, when irradiated with UV-light. Interestingly, derivatization with long-chain fatty acids yielded potent Sirt2 inhibitors, whose biological activity could be induced by a light-mediated increase in aqueous solubility

Synthesis and Characterization of photoswitchable Kinase Inhibitors

In den letzten Jahrzehnten haben Projekte, potente Inhibitoren für Kinasen zu entwickeln, stetig zugenommen. Aktuell sind über vierzig verschiedene Kinaseinhibitoren, meist zur Behandlung verschiedener Krebsarten, als Medikament genehmigt. Jedoch zeigen viele dieser Inhibitoren eine mäßige Selektivität, welches zu einer Vielzahl an Nebenwirkungen führt. Das Ziel dieser Arbeit war Design, Synthese und Charakterisierung von reversibel photoschaltbaren Kinaseinhibitoren, die durch Bestrahlung mit Licht orts- und zeitaufgelöst in ihrer Aktivität kontrolliert werden können. Das hat potentiell den Vorteil, dass Nebenwirkungen und auch Resistenzbildung reduziert werden können. Außerdem können reversibel photoschaltbare Inhibitoren zur Aufklärung des Inhibitionsmechanismus auf molekularer Ebene beitragen. Dazu wurden 4,5-Diarylthiazol- und -imidazol-Derivate als Leitstrukturen verwendet, welche schon auf ihre pharmakologische Aktivität untersucht wurden. Es konnten insgesamt vier azobenzol-haltige und drei diazocin-funktionalisierte Inhibitoren erhalten werden. Es konnte zwar nur ein marginaler Unterschied zwischen den jeweiligen Isomeren der Inhibitoren festgestellt, aber unter anderem durch Protein-Inhibitor- Kristallstrukturen wichtige Rückschlüsse zur Charakteristik photoschaltbarer Inhibitoren gezogen werden, womit das Design in Zukunft optimiert werden kann.In recent years protein kinases have become one of the most employed group of drug targets. Today, there are more than forty different kinase inhibitors on the market used mostly against a variety of different cancer types. However, a fair number of kinase inhibitors exhibit poor kinome selectivity. Our goal is to design, synthesize and characterize a reversible photoswitchable kinase inhibitor, which can be spatially and temporally controlled by light to minimize side effects as well as the development of resistances. In addition, these photoswitchable inhibitors could be of great interest to investigate the mechanism of inhibition on a molecular level. Therefore, we used 4,5-diarylthiazol and -imidazole units as core structures which already have been proven to be inhibitors of Casein kinase 1 and p38 MAPK. Four azobenzene-containing and three different diazocine-functionalized inhibitors could be successfully synthesized and characterized. Unfortunately, only minor differences in activity between the cis and trans isomers could be observed, but nevertheless, important conclusions based on ligand-protein crystal structures could be achieved for the improvement of the design of future photoswitchable inhibitors