Diese Dissertation behandelt die Synthese, photophysikalische Charakterisierung und Anwendung von photochromen G-Protein gekoppelten Rezeptor-Liganden.
Kapitel 1 beschreibt die Einbindung der bereits gut untersuchten Klassen der photochromen Dithienylethene und Fulgide in bekannte Dopamin-Rezeptor-Liganden wie 1,4-disubstituierte aromatische und Hydroxybenzoxazinon-Piperazine sowie Aminoindane. Es gelang, subtyp und funktionell selektive photochrome Liganden zu synthetisieren, welche mittels NMR-Spektroskopie und UV/VIS-Absorptionsspektroskopie charakterisiert wurden. Die photophysikalischen Eigenschaften der Dithienylethen Dopamin-Liganden wiesen eine hohe Ermüdungsresistenz in DMSO auf. Diese konnte in wässrigen Lösungen aufgrund des bekannten Twisted intramolecular charge transfer (TICT) jedoch nicht bestätigt werden. Einige Cyclopenten-Dithienylethene zeigten hohe photostationäre Zustände. Sie formten jedoch ein irreversibles Nebenprodukt, was den Abbau des Photoschalters zur Folge hatte. Bei Betrachtung der Fulgide konnten hohe photostationäre Zustände und eine Schaltbarkeit in polaren Lösungsmitteln festgestellt werden. Fulgimide mit Isopropyl-Rest wiesen ausschließlich eine Isomerisierung zwischen der offenen E-Form und der geschlossenen C-Form auf. Bei einer Konzentration von 1 nM zeigte ein offenes Isomer eines Cyclopenten-Dithienylethens eine 10-fach höhere Aktivierung des pharmakologisch bedeutenden D2S-Rezeptors als das geschlossene Isomer. Als alternativer Photoschalter wurde ein Indolyl-Fulgimid-Isomerenpaar (offen/geschlossen) entdeckt, dessen inverse Aktivierungs-eigenschaften im geschlossenen Zustand eine vierfach höhere Aktivität zeigte. Um die GPCR-regulierenden Photoschalter weiter zu optimieren und weitere biologische Erkenntnisse bezüglich des lichtinduzierten Schaltens am Rezeptor in vivo zu erhalten, müssen weitere Untersuchungen durchgeführt werden.
Das Kapitel 2 handelt von peptidischen photochromen Neuropeptid Y4-Rezeptor (NPY Y4-Rezeptor) Liganden. Der NPY Y4-Rezeptor ist ein G-Protein Protein-gekoppelter Rezeptor und bindet als natürlichen Liganden das pankreatischen Polypeptid, ein Homolog des NPY. Selektive Y4-Rezeptor Agonisten wurden zur Behandlung von Fettleibigkeit vorgeschlagen. Hochpotente dimere peptidische Y4-Rezeptor (Y4R)-Agonisten, die aus zwei durch einen aliphatischen Linker verbundenen Pentapeptid-Einheiten bestehen, repräsentieren eine interessante Klasse an Y4R-Liganden. Basierend auf dieser Ligandenklasse wurden photoempfindliche Y4R-Liganden mit Azobenzolen, Azopyrazolen, Dithienylethenen und Fulgimiden synthetisiert, um strukturelle Anforderungen solcher Y4R-Agonisten bezüglich der Y4R-Bindung zu untersuchen. Die synthetisierten Y4R-Liganden beinhalten einen starren nicht aliphatischen, photochromen Linker, der ein reversibles Schalten in wässrigem Puffer ermöglicht und durchwegs hohe Y4R-Affinitäten aufweist. Dies zeigt, dass der Austausch des hochflexiblen aliphatischen Linkers durch einen weniger flexiblen photochromen Linker bezüglich der Y4R-Bindung gut toleriert wird. Unterschiede in der Affinität und Aktivierung des Y4R zwischen den jeweiligen Photoisomeren, welche sich in der räumlichen Orientierung und Flexibilität unterscheiden, waren nur gering. Dies lässt vermuten, dass die verbindende Einheit in dimeren Liganden bezüglich der Adaptierung von hoch affinen Bindungsmodi am Rezeptor eine weniger wichtige Rolle spielt. Da einige der photochromen Peptide einen schwächeren Partialagonismus als das Musterpeptid aufwiesen, könnten die vorliegenden Ergebnisse bei der Entwicklung von Y4R Antagonisten helfen.
Die Synthese und biologische Untersuchung von kovalent bindenden photochromen GPCR- Liganden für die Einzelmolekülspektroskopie ist in Kapitel 3 dargestellt. Für Untersuchungen bezüglich kovalent gebundenen Photoschaltern wurden der ß2-adrenerge Rezeptor (ß2-AR) sowie der µ-Opioid-Rezeptor (µOR) betrachtet. Als hoch potente Agonisten für ß2-AR wurde BI-167107, für µOR Fentanyl verwendet. In beide Liganden wurden Azopyrazole eingebaut und kovalente Ankergruppen angefügt. Das Azopyrazol stellt die photochrome funktionale Einheit zwischen dem Pharmakophor und der Ankerposition dar. Die Änderung der Geometrie des kovalent gebundenen Liganden sollte die Bindung und Aktivierung beeinflussen. Es wurden verschiedene Synthesewege der pharmakologischen Kopfgruppe und der photochromen Einheit mit einer kovalenten Struktur, wie einem Disulfid oder einem Maleimid, entwickelt. Als entscheidender und letzter Schritt der Synthese der ß2-AR-Liganden wurde eine reduktive Aminierung durchgeführt, welche den kovalent bindenden Photoschalter mit der pharmakologischen Kopfgruppe verbindet. Die µOR-Liganden wurden mit einer Disulfid-Schutzgruppe oder durch post-Funktionalisierung eines Azopyrazol-Fentanylazides synthetisiert, wobei eine Maleimid- und N-Hydroxysuccinimidester-Funktion mittels Click-Reaktion installiert wurde. Die Untersuchung der photophysikalischen Eigenschaften der photochromen Liganden ergab eine sehr gute Ermüdungsresistenz und große thermische Halbwertszeiten der Azopyrazole. Erste biologische Untersuchungen zeigten hohe Bindungsaffinitäten für beide kovalente ß2-AR-bzw. µOR-Liganden am jeweiligen Wildtyp-Rezeptor und deutlich höhere Affinitäten an den verwendeten Mutanten der Rezeptoren. Hohe intrinsische Aktivitäten zeigten die synthetisierten Liganden in Experimenten mit ß-Arrestin-Assays (für ß2-AR) bzw. G-Protein-Aktivierung (für µOR). Letztendlich waren die Unterschiede in der Wirkung und Bindung zwischen den jeweiligen Photoisomeren nur gering. Da diese ersten Untersuchungen noch nicht die kovalente Bindung der Liganden berücksichtigten, sollten weitere Untersuchungen zur irreversiblen Bindung und der damit verbundenen Auswirkungen auf die Funktionalität durchgeführt werden, um ein besseres Verständnis der kovalenten Natur der Liganden zu bekommen
