Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria

Successful treatment of human tuberculosis requires 6–9 months' therapy with multiple antibiotics. Incomplete clearance of tubercle bacilli frequently results in disease relapse, presumably as a result of reactivation of persistent drug-tolerant Mycobacterium tuberculosis cells, although the nature and location of these persisters are not known. In other pathogens, antibiotic tolerance is often associated with the formation of biofilms – organized communities of surface-attached cells – but physiologically and genetically defined M. tuberculosis biofilms have not been described. Here, we show that M. tuberculosis forms biofilms with specific environmental and genetic requirements distinct from those for planktonic growth, which contain an extracellular matrix rich in free mycolic acids, and harbour an important drug-tolerant population that persist despite exposure to high levels of antibiotics

GORAB scaffolds COPI at the trans-Golgi for efficient enzyme recycling and correct protein glycosylation

COPI is a key mediator of protein trafficking within the secretory pathway. COPI is recruited to the membrane primarily through binding to Arf GTPases, upon which it undergoes assembly to form coated transport intermediates responsible for trafficking numerous proteins, including Golgi-resident enzymes. Here, we identify GORAB, the protein mutated in the skin and bone disorder gerodermia osteodysplastica, as a component of the COPI machinery. GORAB forms stable domains at the trans-Golgi that, via interactions with the COPI-binding protein Scyl1, promote COPI recruitment to these domains. Pathogenic GORAB mutations perturb Scyl1 binding or GORAB assembly into domains, indicating the importance of these interactions. Loss of GORAB causes impairment of COPI-mediated retrieval of trans-Golgi enzymes, resulting in a deficit in glycosylation of secretory cargo proteins. Our results therefore identify GORAB as a COPI scaffolding factor, and support the view that defective protein glycosylation is a major disease mechanism in gerodermia osteodysplastica.Peer reviewe

Analyses structurales et métaboliques de la sialylation des vertébrés

Les travaux présentés explorent la diversité structurale des glycannes dans l organisme modèle du Poisson Zèbre et analysent la régulation des sialoconjugués lors d évènements physiopathologiques particuliers. La première partie de mes travaux vise à étendre nos connaissances structurales sur la distribution des glycannes à l échelle cellulaire et tissulaire grâce à l étude d un modèle majeur de vertébré, le poisson zèbre. Ces travaux s inscrivent dans une optique de recherche fondamentale pour établir la première carte de glycosylation (glycosphingolipides ; N- et O-glycannes) des organes du poisson zèbre adulte. A terme, ces résultats permettront de mieux appréhender les relations structures-fonctions des glycannes au niveau des organismes entiers. La seconde partie de mes travaux se focalise sur le suivi structural et métabolique de la sialylation. Une première stratégie est basée sur l utilisation d un mime-alcyné de l acide sialique que nous pouvons coupler à un fluorophore-azidé par click-chemistry pour visualiser les sialoconjugués en microscopie. Ainsi, nous avons étudié le métabolisme de l acide sialique des fibroblastes de patients atteints de Maladie Congénitale de la Glycosylation ou pour suivre la métabolisation de l acide sialique après une infection par le parasite intracellulaire Toxoplasma gondii. Une seconde stratégie s intéresse à la régulation de la sialylation par des analyses structurales lors d une infection parasitaire par Trypanosoma cruzii ou lors de la surexpression d une sialyltransferase dans la lignée cellulaire MCF-7. Ces études révèlent d importantes variations dans l expression des sialoglycoconjugués.Our studies investigated the structural diversity of glycans in zebrafish model organism and analyzed the regulation of sialoconjuguates during specific pathophysiological events. First part of my work intends to expand our structural knowledge about the organisation of glycans at the cellular and tissue levels through the study of a major vertebrate model, the zebrafish. This study aims to establish the first map of glycosylation in zebrafish, including profiles of glycosphingolipids as well as N- and O-glycans of glycoproteins. These data reveal numerous novel structures, including oligofucosylated and oligosialylated glycosphingolipids, and inform us about the organization of glycans within each organ. These results will provide new insight into the structure-function relationships of glycans in whole organisms. Second part of my work focuses on the structural and metabolic monitoring of sialylation. One of the deployed strategies is based on the use of an alkyne analogue of sialic acid and that can specially bind to a fluorophore by click-chemistry for monitoring the sialoconjugates by fluorescence microscopy. This strategy has been implemented to study sialic acid metabolism of fibroblasts from patients with congenital disease of the glycosylation or to follow the sialic acid metabolism after infection with the intracellular parasite Toxoplasma gondii. A second strategy based on structural analyzes focuses on the regulation of sialic acid during parasitic infection by Trypanosoma cruzii or during an overexpression of sialyltransferase in MCF-7 cell line. These studies reveal significant variations in the expression of sialoconjuguates.LILLE1-Bib. Electronique (590099901) / SudocSudocFranceF

Variabilité structurale et fonctionnelle des glycoconjugués (études réalisées chez les mycobactéries, les nématodes, les éponges et les amphibiens)

Les glycanes font montre d'une extraordinaire diversité structurale, et ce à tous les niveaux d'organisation biologique. Les travaux présentés dans ce mémoire sont centrés sur la notion de spécificité d'espèce de la glycosylation, au travers de l'étude de plusieurs modèles expérimentaux : les mycobactéries, les organismes pluricellulaires primitifs et les vertébrés. En particulier, l'analyse des O-glycanes isolés de diverses espèces d'amphibiens et du nématode Caenorhabditis elegans a révélé l'existence de plusieurs activités glycosyltransférasiques inédites. De même, l'étude de la variabilité structurale des lipoglycanes isolés de la paroi des mycobactéries a permis de réévaluer en partie les activités pro-inflammatoires de ces composés. Enfin, la comparaison des glyconectines isolées de trois espèces d'éponge a fourni les premières bases moléculaires nécessaires à la compréhension de leurs propriétés d'auto-agrégation.LILLE1-BU (590092102) / SudocSudocFranceF

Analyse structurale et fonctionnelle des glycolipides pariétaux de Mycobacterium marinum (une mycobactérie modèle dans l'étude de la tuberculose)

Mycobacterium marinum est une mycobactérie pathogène des ectothermes génétiquement proche de M. tuberculosis. Ce modèle peut être utilisé pour mieux comprendre la formation des granulomes tuberculeux et déterminer le rôle des glycoconjugués pariétaux dans la régulation de la réponse immunitaire. Dans ce contexte, nos travaux ont porté sur la purification des glycolipides polaires et apolaires extraits de la paroi de M. marinum et leur caractérisation en utilisant la résonance magnétique nucléaire et la spectrométrie de masse. Nos résultats concernant l analyse structurale de la famille des lipooligosaccharides polaires (LOSs, comprenant les LOS-I à LOS-IV) ont démontré la présence de monosaccharides rares, dont le caryophyllose et un monosaccharide N-acylé, spécifique du LOS-IV. Nous avons également observé que tous les LOSs inhibent la sécrétion macrophagique d une cytokine pro-inflammatoire, le TNF-a . En revanche, seul le LOS-IV stimule l expression d antigènes (ICAM-1 et CD40) à la surface des macrophages et la production de chimiokine (IL-8). Cet effet inducteur du LOS-IV pourrait être lié à la présence du monosaccharide terminal N-acylé. Par ailleurs, les autres glycolipides polaires analysés, incluant les phosphatidyl-myo-inositol mannosides (PIM), le lipomannane (LM) et le lipoarabinomannane (LAM), possèdent des structures similaires à celles de M. tuberculosis.L étude des glycolipides apolaires a permis de préciser la structure des glycolipides phénoliques (PGL) et des tréhaloses di-mycolates (TDM). De plus, une famille de glycolipides méconnue comprenant le Di-Mycolyl-Di-Arabinoglycérol (DMDA) a été identifiée. Le DMDA présente une structure très proche de la partie terminale du mycolyl-arabinogalactane-peptidoglycanne (mAGp), macro-complexe pariétal majoritaire des mycobactéries. Des études complémentaires effectuées chez M. bovis BCG ont démontré que ce glycolipide était lié au métabolisme du mAGp, ce qui ouvre de nouvelles pistes pour la compréhension du mode d action de certaines drogues anti-tuberculeuses telles que la thiacétazone.Mycobacterium marinum is a natural pathogen of ectotherms genetically close to M. tuberculosis. This pathogen model is useful for deciphering the role of mycobacterial cell wall glycolipids in granulomatous infection. In this context, our work focused on the purification of both polar and apolar glycolipids extracted from M. marinum cell wall and their structural characterization using nuclear magnetic resonance and mass spectrometry. Analysis of the polar lipooligosaccharide family (LOSs, including LOS-I to LOS-IV) demonstrated the presence of several rare or even unique monosaccharides including caryophyllose, derivatives and a N-acylated monosaccharide specific of LOS-IV. Biological activity assays showed that LOSs exert an important pro-inflammatory effect by decreasing the TNF-a secretion from macrophages. Moreover, LOS-IV was found to stimulate the expression of the chemokine IL-8 and cell surface antigens (CD40 and ICAM-1) on macrophages. This specific immunostimulatory property was related to the presence of the terminal N-acylated monosaccharide in LOS-IV. In addition, other polar glycolipids analyzed, including phosphatidyl-myo-inositol mannosides (PIM), lipomannane (LM) and lipoarabinomannan (LAM), possess similar structures than M. tuberculosis. The study of apolar glycolipids permitted to precise the structure of phenolic glycolipids (PGL) and trehalose di-mycolates (TDM). Moreover, a family of unusual glycolipids, including Di-Mycolyl-Di-Arabinoglycérol (DMDA), was identified. DMDA structure is very close from the terminal part of peptidoglycan-arabinogalactan-mycolyl (mAGp), the mycobacterial cell wall macro-complex. Additional studies performed in M. bovis BCG showed that this glycolipid is related to mAGp, providing new insights about the mode of action of anti-tuberculous drugs such as thiacetazone.LILLE1-Bib. Electronique (590099901) / SudocSudocFranceF

Gangliosphingolipids:Structure and Biological Roles

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Neutral aldoses derived from sequential acid hydrolysis of sediments as indicators of diagenesis over 120,000 years.

International audienceNeutral aldoses of the upper 50 m (representing ca. 120 kyr) of sediments from the Cariaco Basin were studied using a new technique based on water extraction followed by sequential acid hydrolysis with 2N, 4N and 6N trifluoroacetic acid (TFA) to investigate the fate of carbohydrates during diagenesis. The distribution and abundance of neutral aldoses and their evolution with depth shed light on the origin and fate of carbohydrates upon burial. The carbohydrates originated mainly from phytoplanktonic production, in particular diatoms. The porewater carbohydrate fraction was invariant and its composition attested to considerable biodegradation of the source material. Bacteria in the sediment may have also contributed to this fraction. The carbohydrates in the 2N fraction represented a decreasing fraction of the total organic carbon (TOC) with increasing depth/age. This fraction likely derived from storage polysaccharides, which were progressively degraded in the sediment. The 4N fraction was dominated by hexoses, suggesting that it comprised sugars derived from structural polysaccharides and exopolymeric substances. It showed a slight decrease with depth, over the 120 kyr. The 6N fraction comprised a relatively constant fraction of TOC with sediment depth. The aldose distribution suggested that the 6N fraction showed the imprint of the initial biological signal preserved by a proteinaceous macromolecular structure and/or a mineral matrix, but not from condensation in the sediment of more labile polysaccharide

A fish and its pathogen as model of tuberculosis [Un poisson et son pathogène comme modèle de la tuberculosa]

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Structural characterization of the N-linked pentasaccharide decorating glycoproteins of the halophilic archaeon Haloferax volcanii

N-Glycosylation is a post-translational modification performed in all three domains of life. In the halophilic archaea Haloferax volcanii, glycoproteins such as the S-layer glycoprotein are modified by an N-linked pentasaccharide assembled by a series of Agl (archaeal glycosylation) proteins. In the present study, mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance spectroscopy were used to define the structure of this glycan attached to at least four of the seven putative S-layer glycoprotein N-glycosylation sites, namely Asn-13, Asn-83, Asn-274 and Asn-279. Such approaches detected a trisaccharide corresponding to glucuronic acid (GlcA)-β1,4-GlcA-β1,4-glucose-β1-Asn, a tetrasaccharide corresponding to methyl-O-4-GlcA-β-1,4-galacturonic acid-α1,4-GlcA-β1,4-glucose-β1-Asn, and a pentasaccharide corresponding to hexose-1,2-[methyl-O-4-]GlcA-β-1,4-galacturonic acid-α1,4-GlcA-β1,4-glucose-β1-Asn, with previous MS and radiolabeling experiments showing the hexose at the non-reducing end of the pentasaccharide to be mannose. The present analysis thus corrects the earlier assignment of the penultimate sugar as a methyl ester of a hexuronic acid, instead revealing this sugar to be a methylated GlcA. The assignments made here are in good agreement with what was already known of the Hfx. volcanii N-glycosylation pathway from previous genetic and biochemical efforts while providing new insight into the process

Étude de la régulation des sialo-conjugués au cours de l'embryogenèse du poisson zèbre

L'acide sialique joue un rôle primordial dans les phénomènes de reconnaissance inter-cellulaires. Au cours de ce travail, les fonctions biologiques des épitopes sialylés régulés au cours du développement, en relation avec la régulation spatiale et temporelle des a2-8 sialyltransferases (ST8sia) au cours de l'embryogenèse du poisson zèbre, ont été étudiées par une combinaison d'analyses chimiques et spectrométriques. Dans un premier temps, les glycolipides, N-glycannes et O-glycannes ont été séquentiellement purifiés d'extraits totaux de poissons zèbres et étudiés par une combinaison de spectrométrie de masse, de digestion enzymatique, de dérivation chimique et de résonance magnétique nucléaire (RMN). Nous avons ainsi mis en évidence l'existence de profils de glycosylation très particuliers dominés par des composés hautement sialylés. Dans un deuxième temps, le suivi de la glycosylation au cours du développement a révélé que la polysialylation des glycoconjugués était différentiellement régulée en fonction de leur nature. Sur ces bases structurales, nous avons suivi l'expression des gènes codant pour les ST8Sias du poisson zèbre par PCR quantitative. Nous émettons l'hypothèse que les glycoprotéines polysialylées observées dans l'embryon sont héritées de la mère, tandis que les glycolipides sialylés sont synthétisés de novo par l'embryon. Enfin, l'observation de la plupart des ST8Sias par hybridation in situ montre qu'elles sont exprimées dans le système nerveux central dés les premiers stades de développement embryonnaire. L'ensemble de nos travaux démontrent l'utilisation du poisson zèbre en tant que modèle animal d'étude cohérent de la glycosylation.The nine-carbon sugar, sialic acid, plays important roles as the recognition epitopes in cell-cell communications. ln this thesis work, the biological functions of developmentally regulated sialylation were investigated using a combination of chemical and mass spectrometry (MS) analyses. Glycomic survey mapping permitted to identify unusual structures typified by complex sialylation patterns. The analysis of sialyltransferase and sialidase activities along development led to a working model, which proposes that the oligosialic acids from glycoproteins are maternally inherited (synthesized before fertilization) and exocytosis out of the embryo into the perivitelline space where it undergoes catabolism, whereas oligosialic acids on the glycolipids are de novo synthesized by the increasingly expressed ST8sia in the embryos. Furthermore, through whole mount in-situ hybridization, most of the ST8sia were shown to be expressed in the nervous system during early embryogenesis, with different onset and locations. ln summary, the precise MS and MS/MS-based glycomic profiles, together with detailed structural determination, quantitative analysis of the developmentally regulated oligosialylation pattern, and the spatial and temporal expression profiling of ST8sia of zebrafish, collectively provides new sialoglycobiology insights for neuroscientists at the molecular level and highlighted the significance and complicated regulation of oligosialylation in early neuronal development.LILLE1-Bib. Electronique (590099901) / SudocSudocFranceF