Value-added effects of using aromatic plants in foods and human therapy

Consumers' demands for low-processed and healthier food products led to a search for alternatives to replace or reduce synthetic food additives with natural ones. Aromatic plant derivatives which have GRAS status, have been examined for being natural food preservatives and antioxidants to prolong the shelf-life of foods. They contribute to food safety, owing to their anti-quorum sensing, and anti-biofilm properties. These potential food safety attributes and increasing demand for natural food additive options have led to an interest in the use of them, especially in traditional meat, dairy, and bakery products, which would provide them an added value, and increase the market competitiveness. Therefore, the overall perspective of the value-added effects of using aromatic plants and their derivatives in food production and of their incorporated use into packaging materials for active packaging are discussed in this review. In addition, it provides information on their antimicrobial and antioxidant actions. The review also aims to give detailed information on benefits of vegetal bioactive compounds in health and disease by giving their nutraceutical and health-promoting properties. The current knowledge on their application in the treatment of health disorders is presented, their ability to prevent diseases is discussed, and the areas for future research are proposed

Systematic Global Analysis of Genes Encoding Protein Phosphatases in Aspergillus fumigatus.

Aspergillus fumigatus is a fungal pathogen that causes several invasive and noninvasive diseases named aspergillosis. This disease is generally regarded as multifactorial, considering that several pathogenicity determinants are present during the establishment of this illness. It is necessary to obtain an increased knowledge of how, and which, A. fumigatus signal transduction pathways are engaged in the regulation of these processes. Protein phosphatases are essential to several signal transduction pathways. We identified 32 phosphatase catalytic subunit-encoding genes in A. fumigatus, of which we were able to construct 24 viable deletion mutants. The role of nine phosphatase mutants in the HOG (high osmolarity glycerol response) pathway was evaluated by measuring phosphorylation of the p38 MAPK (SakA) and expression of osmo-dependent genes. We were also able to identify 11 phosphatases involved in iron assimilation, six that are related to gliotoxin resistance, and three implicated in gliotoxin production. These results present the creation of a fundamental resource for the study of signaling in A. fumigatus and its implications in the regulation of pathogenicity determinants and virulence in this important pathogen

Comparação entre o diagnóstico clínico presuntivo e a microscopia a fresco em mulheres com leucorreia / Comparison between presumptive clinical diagnosis and fresh microscopy in women with leukorrhea

A leucorreia representa uma das queixas mais recorrentes entre as mulheres, principalmente em idade fértil. A vaginose bacteriana é a mais prevalente, sendo uma síndrome multifatorial com redução do número de lactobacilos e aumento de cepas potencialmente patogênicas. O objetivo deste estudo foi avaliar se há correlação entre o diagnóstico clínico e o exame a fresco. Foram avaliadas 22 pacientes com queixa sugestiva de vaginose bacteriana, triadas pelo odor fétido. As etapas da pesquisa foram: anamnese, exame físico, medida do pH vaginal, teste das aminas e exame a fresco. Os critérios de Amsel foram utilizados no diagnóstico de vaginose bacteriana. Os resultados evidenciaram a vaginose bacteriana como o distúrbio ginecológico mais prevalente. Houve concordância entre o diagnóstico clínico e o exame a fresco em 15 casos e discordância em 7. Foi possível observar que a microscopia direta teve fundamental importância no diagnóstico diferencial, já que há alterações que mimetizam outra

Influence of somatic mutant allelic imbalance in breast cancer clinical characteristics

Breast cancer is genomic and clinically heterogeneous, which represents a major challenge for treatment choice and has important consequences in survival rates. In the past decade studies profiled breast tumours, cataloguing somatic mutations and copy number alterations, which greatly improved prognosis and both expanded and facilitated treatment choices. In spite of this substantial progress, the current classification systems and biomarkers still do not encompass all breast cancer heterogeneity. Dosage changes of mutated allele has been associated with alterations in prognosis and in response to treatment. However, all studies examined the clinical association of somatic mutations and allelic imbalance solely at DNA level, leaving the contribution of gene expression regulation somewhat overlooked. Cis-regulatory variation is known to be a major determinant of allelic imbalance of expression, and a vast majority of the human genome is known to be affected by this. The most robust approach to detect the effect of, and map, cis-regulatory variation is to analyse differential allelic expression in heterozygotes. So, I hypothesised that differential allelic expression of mutated genes contributes to breast cancer biology and outcome, by creating imbalances in the allelic levels of gene expression (dosage) of somatic mutations. Using data from two independent sets of breast tumours, from METABRIC and TCGA projects, I studied the allelic imbalance of the two most mutated genes, PIK3CA and TP53. I show that preferential expression of the mutated allele presents positive selection, even more significantly that copy-number alterations. Also, I show that somatic mutations’ allelic imbalance resulting from cis-regulation impacts on the clinical characteristics of tumours, namely by showing association with known prognostic factors. Finally, tumours with differential allelic expression of PIK3CA’s mutated allele associated with poorer prognosis. The work presented in this thesis suggests that allelic imbalance generated by cis-regulation has an essential role in modulating of the effect of somatic mutations in tumours, as well as tumour clinical behaviour.O cancro da mama é uma doença heterogênea do ponto de vista clínico e genómico, o que representa um grande desafio na escolha do tipo de tratamento, com importantes consequências na taxa de sobrevida dos pacientes. Nas últimas décadas, estudos traçaram o perfil dos tumores da mama, catalogando mutações somáticas e alterações de número de cópias dos genes, melhorando muito o prognóstico e expandindo e facilitando as escolhas de tratamento dos doentes. Apesar desse progresso substancial, os sistemas de classificações e os biomarcadores atuais ainda não conseguem englobar toda a heterogeneidade do cancro da mama. Dosagem variável do alelo mutado em relação ao alelo referência de oncogenes em cancros, variando desde pequenos a grandes desequilíbrios alélicos, tem sido associada a alterações em prognóstico e tratamento. No entanto, todos os estudos que abordaram o desequilíbrio alélico, fizeram-no apenas ao nível do DNA, negligenciando o papel da regulação da expressão dos genes. Sabe-se que variações na cis-regulação são grandes determinantes de expressão diferencial entre alelos e que a maior parte do genoma humano é afetado pela cisregulação. Já foi também demonstrado que a cis-regulação afeta a penetrância das mutações, principalmente em contexto de portadores de mutações germinativas. No caso de mutações germinativas dos genes BRCA1 e BRCA2 em paciente com cancro da mama, foi descoberto que a maior expressão do alelo não mutado, capaz de produzir proteína para realizar as funções normais de reparação dos danos no DNA, associava a uma baixa penetrância, ou seja, era protector em relação ao desenvolvimento de cancro da mama. Contudo, a forma como a variação cis-regulatória impacta a biologia tumoral e o desfecho clínico ainda segue inexplorado. Dessa forma, criou-se a hipótese que a expressão diferencial de alelos de genes com mutações somáticas contribui para biologia do cancro da mama e tem impacto na sobrevida dos pacientes. Nomeadamente, mutações somáticas em oncogenes e genes supressores de tumores cuja expressão que seja modelada por variação cisregulatória, terão diferentes impactos na biologia e comportamento clínico do tumor que os comporta. Para testar a hipótese, foram utilizados dados de sequenciação de nova geração de DNA e RNA de cancros de mama, e dados clínicos dos pacientes de dois grandes projectos, METABRIC e TCGA. Como os dois genes mais mutados e que apresentavam expressão diferencial entre o alelo mutado e o alelo referência, nos dois projectos, foram os genes PIK3CA e TP53, optou-se por prosseguir o estudo analisando estes dois genes. Para a realização das análises foram calculados três rácios entre o alelo mutado e o alelo referência: rácio α que utiliza a contagem dos alelos no RNA e reflete a expressão total dos alelos; rácio β que utiliza a contagem dos alelos no DNA e reflete as alterações em número de cópias dos genes a nível do DNA; e o rácio γ em que o rácio α é normalizado pelo rácio β, refletindo assim a parte da expressão cujo responsável é a cis-regulação. Ao analisar tumores com mutações somáticas no gene PIK3CA, foi observada associação de expressão diferencial da mutação com características do tumor, nomeadamente status dos recetores de estrogénio e progesterona e do HER2, com expressão preferencial do alelo mutado em tumores recetores de estrogénio e de progesterona negativos e HER2 positivo. Esta associação foi observada tanto a nível de expressão global do gene quanto quando se considerou apenas os efeitos da cis-regulação. A análise de sobrevidas global e específica por cancro da mama demonstrou uma sobrevivência mais curta das pacientes com expressão diferencial entre alelo mutado e alelo referência do gene PIK3CA, quando comparado com pacientes que expressão aproximadamente as mesmas quantidades dos dois alelos. Ao avaliar as pacientes subdivididas de acordo com status de recetores hormonais, identificou-se um possível subgrupo de pior prognóstico dentro do grupo de tumores recetores de estrogénio e de progesterona positivos e HER2 negativo, que são tumores de melhor prognóstico. Como, por pesquisa anterior do meu grupo, havia evidências de que o polimorfismo de nucleótido único (SNP) rs2699887 era um possível responsável pela cis-regulação do gene PIK3CA em tecido de mama normal, foi analisada a associação deste com desfecho clinico de tumores de mama e a única associação encontrada foi uma pior sobrevida do grupo de pacientes cujo tumor expressa o alelo menos frequente (alelo T) no subgrupo de tumores recetor de progesterona negativo. Foi também observada associação entre expressão diferencial de alelo mutado e alelo referência de gene TP53 com características biológicas do tumor, porém esta associação só foi vista nas amostras oriundas do projeto TCGA e apenas com status de recetores de estrogénio e de progesterona, nesses dois casos com expressão preferencial do alelo mutado em tumores recetores de estrogénio e de progesterona negativos. A análise se sobrevida global demonstrou associação de expressão diferencial do alelo TP53 mutado com pior sobrevida quando todas as amostras foram analisadas em conjunto e também nos subgrupos de tumores recetor de estrogénio positivo e de progesterona negativo. Nas análises dos dois genes, PIK3CA e TP53, tanto para TCGA como METABRIC, quando comparada a dosagem de cada alelo seja por cis-regulação da expressão génica (RNA) ou alteração do número de cópias (DNA), observou-se que a maioria dos tumores expressa preferencialmente o alelo mutado, apesar de a nível de DNA possuir maior número de alelo referência, sugerindo uma seleção positiva da expressão do alelo mutado em tumores de mama. Se bem que a análise do PIK3CA, um oncogene típico, foi restringida a mutações missense, dado que o gene TP53 pode actuar como gene supressor de tumores ou oncogene consoante a mutação adquirida, a sua análise foi ainda extendida ao tipo de mutação presente em cada tumor. O que verificámos foi que a selecção positiva significava ainda uma separação clara entre mutações missense, associadas ao seu papel de oncogene e que verificámos estarem mais associadas a expressão preferencial do alelo mutado, e mutações frame-shift, normalmente associadas ao seu papel de gene supressor de tumores e que verificámos estar associado a expressão preferencial do alelo referência. O trabalho realizado no âmbito da tese aqui apresentada providencia, pela primeira vez, evidências que apoiam o papel essencial do desequilíbrio alélico gerado pela cis-regulação, além do gerado pela alteração no número de cópias, na modulação do efeito das mutações somáticas nos tumores. Estes achados suportam a realização de pesquisa de níveis de expressão de alelos de mutações somáticas oncogénicas como parte do manejo clínico de pacientes com cancro da mama. Para além disso, os achados também suportam novos estudos sobre a forma como estes desequilíbrios da expressão génica podem estar ativando ou silenciando outros genes relacionados com o cancro

Different methods to quantify Listeria monocytogenes biofilms cells showed different profile in their viability

Abstract Listeria monocytogenes is a foodborne pathogen able to adhere and to form biofilms in several materials commonly present in food processing plants. The aim of this study was to evaluate the resistance of Listeria monocytogenes attached to abiotic surface, after treatment with sanitizers, by culture method, microscopy and Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction (qPCR). Biofilms of L. monocytogenes were obtained in stainless steel coupons immersed in Brain Heart Infusion Broth, under agitation at 37°C for 24 h. The methods selected for this study were based on plate count, microscopic count with the aid of viability dyes (CTC-DAPI), and qPCR. Results of culture method showed that peroxyacetic acid was efficient to kill sessile L. monocytogenes populations, while sodium hypochlorite was only partially effective to kill attached L. monocytogenes (p < 0.05). When, viability dyes (CTC/DAPI) combined with fluorescence microscopy and qPCR were used and lower counts were found after treatments (p < 0.05). Selective quantification of viable cells of L. monocytogenes by qPCR using EMA revelead that the pre-treatment with EMA was not appropriate since it also inhibited amplification of DNA from live cells by ca. 2 log. Thus, the use of CTC counts was the best method to count viable cells in biofilms

Growth Inhibition of Selected Microorganisms by an Association of Dairy Starter Cultures and Probiotics

Several growth curves for selected pathogens and hygiene indicators alone and vs selected dairy starter cultures (LAB) and commercial probiotics have been performed. All strains for LAB and commercial probiotics were inoculated as pure cultures into skim milk to get an initial cocci:bacilli:enterocci ratio of 2:1:1 and a concentration of approx 107 cfu mL–1 until challenge vs selected pathogens and hygiene indicators. Selected pathogens came from the collection of the Laboratorio di Ispezione degli Alimenti di O.A. or were reference strains (Escherichia coli, CSH26 K12, Staphylococcus aureus, 27R, Salmonella Derby 27, Pseudomonas fluorescens ATCC 13525, Listeria innocua ATCC 33090). Each strain was inoculated into skim milk to get an initial concentration of approx 106 cfu mL–1. Growth curves in skim milk for the following challenges were studied: i) sterility control; ii) association LAB; iii) association of LAB vs each selected pathogen or hygiene indicator; iv) selected pathogen or hygiene indicator alone. The challenges were carried out in BHI broth and in skim milk at 37°C. The highest reduction was observed in milk but in general the association of LAB and the probiotic was able to limit the growth of pathogens and hygiene indicators.http://www.aspajournal.itindex.php/ijas/indexam201