Kontext-abhängige Signalwegsaktivierung des muskarinischen M₂-Rezeptors

Muskarinische Acetylcholinrezeptoren (M1-M5) werden in vielen Organen und Geweben des menschlichen Körpers exprimiert und sind an der Regulation einer Vielzahl physiologischer Funktionen beteiligt. Der muskarinische M2-Rezeptor zählt zu den G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRS), welche vornehmlich inhibitorische G-Proteine (Gi/o) aktivieren. Seine Charakterisierung hinsichtlich Ligandbindung und Signalwegsaktivierung wird durch die Tatsache erschwert, dass in Organen und Geweben verschiedene muskarinische Rezeptorsubtypen häufig nebeneinander exprimiert werden. Rekombinante Expressionssysteme bieten dagegen die Möglichkeit einzelne Rezeptorsubtypen genauer zu untersuchen. Hierzu dienten in dieser Arbeit Ovarialzellen des chinesischen Hamsters, welche stabil mit dem humanen M2-Rezeptor transfiziert sind (CHO-hM2). Da dieses Expressionssystem jedoch in der Kritik steht, keine große physiologische Relevanz zu besitzen, wurden ebenfalls Zellen untersucht, welche den M2-Rezeptor endogen exprimieren. Zu diesem Zweck wurden humane Lungenfibroblasten als natives Expressionssystem und isolierte murine Herzmuskelzellen als primäres Expressionssystem verwendet. Radioligand-Bindungsexperimente, mit denen die Untersuchung der Rezeptorkinetiken sowie der Bindungseigenschaften orthosterischer und allosterischer Liganden erfolgte, bestätigten die dominante Expression des muskarinischen M2-Rezeptors in diesen Zellen. M2-Rezeptoren besitzen neben der Aktivierung inhibitorischer G-Proteine die Fähigkeit zur Stimulation weiterer G-Proteine. Diese promiskuitive G-Proteinaktivierung ist bisher jedoch nur in rekombinanten Expressionssystemen eindeutig beschrieben und wird der Überexpression muskarinischer Rezeptoren zugeschrieben. Zur Klärung der physiologischen Relevanz promiskuitiver G-Proteinaktivierung erfolgten Untersuchungen mit humanen Lungenfibroblasten sowie mit murinen embryonalen Kardiomyozyten. In beiden Zellsystemen konnte jedoch allein die Aktivierung inhibitorischer G-Proteine eindeutig nachgewiesen werden. Daher kann die Hypothese nicht verworfen werden, dass sich die M2-vermittelte promiskuitive G-Proteinaktivierung auf artifizielle Expressionssysteme beschränkt. Einen weiteren Schwerpunkt dieser Arbeit stellte die Kontext-abhängige Untersuchung der Rezeptoraktivierung dualsterischer Hybridliganden dar, welche aus einem orthosterischen Agonistbaustein und einem M2-subtypselektiven allosterischen Modulator bestehen. Die beiden untersuchten Agonisten Iper-6-phth und Iper-8-phth unterschieden sich einzig hinsichtlich der Länge ihrer Kohlenwasserstoffkette, welche beide Bausteine miteinander verbindet. Die Länge dieser Zwischenkette wirkte sich sowohl auf die Wirksamkeit wie auch auf die intrinsische Aktivität der Liganden aus, was im rekombinanten, im nativen und im primären Expressionssystem des M2-Rezeptors gezeigt werden konnte

Nutzung von Registerdaten für regulatorische Entscheidungsfindung

Über die vergangenen Jahre hat die Nutzung von Registerdaten für die Arzneimittelforschung vermehrt an Bedeutung gewonnen. Folglich griffen im Jahr 2020 die Europäische Arzneimittelagentur (European Medicines Agency, EMA) und Vertreter der nationalen Zulassungsbehörden (Heads of Medicines Agencies, HMA) dies als Teil ihrer Netzwerkstrategie zum verbesserten Schutz der öffentlichen Gesundheit auf. Registerdaten gehören zu den sogenannten Real World Data (RWD) und können zur Beantwortung von Fragen zur Arzneimittelsicherheit und zur Untersuchung der Wirksamkeit von Arzneimitteln herangezogen werden. Registerdaten finden zum Beispiel Anwendung bei Studien zu Arzneimitteln für seltene Krankheiten und bei Studien zu speziellen Patientenpopulationen wie der Arzneimittelexposition bei Schwangeren. Bei der Durchführung von registerbasierten Studien stellen sich vielfältige Fragen, die u.a. das Auffinden geeigneter Datenquellen, die Nutzung bestehender Register oder die Etablierung neuer Register betreffen. Dieser Beitrag gibt eine Übersicht über aktuelle Initiativen zur Verbesserung der Nutzung von Registerdaten für regulatorische Zwecke auf europäischer und nationaler Ebene

Lack of Gαi2 leads to dilative cardiomyopathy and increased mortality in β1-adrenoceptor overexpressing mice

Aims Inhibitory G (Gi) proteins have been proposed to be cardioprotective. We investigated effects of Gαi2 knockout on cardiac function and survival in a murine heart failure model of cardiac β1-adrenoceptor overexpression. Methods and results β1-transgenic mice lacking Gαi2 (β1-tg/Gαi2 -/-) were compared with wild-type mice and littermates either overexpressing cardiac β1-adrenoceptors (β1-tg) or lacking Gαi2 (Gαi2 -/-). At 300 days, mortality of mice only lacking Gαi2 was already higher compared with wild-type or β1-tg, but similar to β1-tg/Gαi2 -/-, mice. Beyond 300 days, mortality of β1-tg/Gαi2 -/- mice was enhanced compared with all other genotypes (mean survival time: 363 ± 21 days). At 300 days of age, echocardiography revealed similar cardiac function of wild-type, β1-tg, and Gαi2 -/- mice, but significant impairment for β1-tg/Gαi2 -/- mice (e.g. ejection fraction 14 ± 2 vs. 40 ± 4% in wild-type mice). Significantly increased ventricle-to-body weight ratio (0.71 ± 0.06 vs. 0.48 ± 0.02% in wild-type mice), left ventricular size (length 0.82 ± 0.04 vs. 0.66 ± 0.03 cm in wild types), and atrial natriuretic peptide and brain natriuretic peptide expression (mRNA: 2819 and 495% of wild-type mice, respectively) indicated hypertrophy. Gαi3 was significantly up-regulated in Gαi2 knockout mice (protein compared with wild type: 340 ± 90% in Gαi2 -/- and 394 ± 80% in β1-tg/Gαi2 -/-, respectively). Conclusions Gαi2 deficiency combined with cardiac β1-adrenoceptor overexpression strongly impaired survival and cardiac function. At 300 days of age, β1-adrenoceptor overexpression alone had not induced cardiac hypertrophy or dysfunction while there was overt cardiomyopathy in mice additionally lacking Gαi2. We propose an enhanced effect of increased β1-adrenergic drive by the lack of protection via Gαi2. Gαi3 up-regulation was not sufficient to compensate for Gαi2 deficiency, suggesting an isoform-specific or a concentration-dependent mechanism.Fil: Keller, Kirsten. Universitat Zu Köln; AlemaniaFil: Maass, Martina. University Hospital of Cologne; AlemaniaFil: Dizayee, Sara. Universitat Zu Köln; AlemaniaFil: Leiss, Veronika. Eberhard Karls University Hospitals and Clinics; AlemaniaFil: Annala, Suvi. Universitat Zu Köln; AlemaniaFil: Köth, Jessica. Universitat Zu Köln; AlemaniaFil: Seemann, Wiebke K.. Universitat Zu Köln; AlemaniaFil: Müller Ehmsen, Jochen. Asklepios Klinik Altona; AlemaniaFil: Mohr, Klaus. Universitaet Bonn; AlemaniaFil: Nürnberg, Bernd. Eberhard Karls University Hospitals and Clinics; AlemaniaFil: Engelhardt, Stefan. Universitat Technical Zu Munich; AlemaniaFil: Herzig, Stefan. Universitat Zu Köln; AlemaniaFil: Birnbaumer, Lutz. National Institutes of Health; Estados Unidos. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Matthes, Jan. Universitat Zu Köln; Alemani

Engineered Context-Sensitive Agonism: Tissue-Selective Drug Signaling through a G Protein-Coupled Receptor

Drug discovery strives for selective ligands to achieve targeted modulation of tissue function. Here we introduce engineered context-sensitive agonism as a postreceptor mechanism for tissue-selective drug action through a G protein-coupled receptor. Acetylcholine M2-receptor activation is known to mediate, among other actions, potentially dangerous slowing of the heart rate. This unwanted side effect is one of the main reasons that limit clinical application of muscarinic agonists. Herein we show that dualsteric (orthosteric/allosteric) agonists induce less cardiac depression ex vivo and in vivo than conventional full agonists. Exploration of the underlying mechanism in living cells employing cellular dynamic mass redistribution identified context-sensitive agonism of these dualsteric agonists. They translate elevation of intracellular cAMP into a switch from full to partial agonism. Designed context-sensitive agonism opens an avenue toward postreceptor pharmacologic selectivity, which even works in target tissues operated by the same subtype of pharmacologic receptor

Applying label-free dynamic mass redistribution technology to frame signaling of G protein–coupled receptors noninvasively in living cells

Label-free dynamic mass redistribution (DMR) is a cutting-edge assay technology that enables real-time detection of integrated cellular responses in living cells. It relies on detection of refractive index alterations on biosensor-coated microplates that originate from stimulus-induced changes in the total biomass proximal to the sensor surface. Here we describe a detailed protocol to apply DMR technology to frame functional behavior of G protein-coupled receptors that are traditionally examined with end point assays on the basis of detection of individual second messengers, such as cAMP, Ca<sup>2+</sup> or inositol phosphates. The method can be readily adapted across diverse cellular backgrounds (adherent or suspension), including primary human cells. Real-time recordings can be performed in 384-well microtiter plates and be completed in 2 h, or they can be extended to several hours depending on the biological question to be addressed. The entire procedure, including cell harvesting and DMR detection, takes 1-2

Rational Design of Partial Agonists for the Muscarinic M-1 Acetylcholine Receptor

Aiming to design partial agonists for a G-protein-coupled receptor based on dynamic ligand binding, we synthesized three different series of bipharmacophoric ligands composed of the orthosteric building blocks iperoxo and 1 linked to allosteric modulators (BQCA-derived compounds, BQCAd; TBPB-derived compound, TBPBd). Their interactions were studied with the human muscarinic acetylcholine M-1-receptor (hM(1)) with respect to receptor binding and G(q)-protein signaling. Results demonstrate that iperoxo/BQCAd (2, 3) and 1/BQCAd hybrids (4) act as M1 partial agonists, whereas 1/TBPBd hybrids (5) did not activate M-1-receptors. Among the iperoxo/BQCAd-hybrids, spacer length in conjunction with the pattern of substitution tuned efficacy. Most interestingly, a model of dynamic ligand binding revealed that the spacer length of 2a and 3a controlled the probability of switch between the inactive purely allosteric and the active bitopic orthosteric/allosteric binding pose. In summary, dynamic ligand binding can be exploited in M-1 receptors to design partial agonists with graded efficacy