Improved coverage of cDNA-AFLP by sequential digestion of immobilized cDNA

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>cDNA-AFLP is a transcriptomics technique which does not require prior sequence information and can therefore be used as a gene discovery tool. The method is based on selective amplification of cDNA fragments generated by restriction endonucleases, electrophoretic separation of the products and comparison of the band patterns between treated samples and controls. Unequal distribution of restriction sites used to generate cDNA fragments negatively affects the performance of cDNA-AFLP. Some transcripts are represented by more than one fragment while other escape detection, causing redundancy and reducing the coverage of the analysis, respectively.</p> <p>Results</p> <p>With the goal of improving the coverage of cDNA-AFLP without increasing its redundancy, we designed a modified cDNA-AFLP protocol. Immobilized cDNA is sequentially digested with several restriction endonucleases and the released DNA fragments are collected in mutually exclusive pools. To investigate the performance of the protocol, software tool MECS (Multiple Enzyme cDNA-AFLP Simulation) was written in Perl. cDNA-AFLP protocols described in the literatur and the new sequential digestion protocol were simulated on sets of cDNA sequences from mouse, human and <it>Arabidopsis thaliana</it>. The redundancy and coverage, the total number of PCR reactions, and the average fragment length were calculated for each protocol and cDNA set.</p> <p>Conclusion</p> <p>Simulation revealed that sequential digestion of immobilized cDNA followed by the partitioning of released fragments into mutually exclusive pools outperformed other cDNA-AFLP protocols in terms of coverage, redundancy, fragment length, and the total number of PCRs. Primers generating 30 to 70 amplicons per PCR provided the highest fraction of electrophoretically distinguishable fragments suitable for normalization. For <it>A. thaliana</it>, human and mice transcriptome, the use of two marking enzymes and three sequentially applied releasing enzymes for each of the marking enzymes is recommended.</p

Retrotransposons as pathogenicity factors of the plant pathogenic fungus Botrytis cinerea

BACKGROUND Retrotransposons are genetic elements inducing mutations in all domains of life. Despite their detrimental effect, retrotransposons can become temporarily active during epigenetic reprogramming and cellular stress response, which may accelerate host genome evolution. In fungal pathogens, a positive role has been attributed to retrotransposons when shaping genome architecture and expression of genes encoding pathogenicity factors; thus, retrotransposons are known to influence pathogenicity. RESULTS We uncover a hitherto unknown role of fungal retrotransposons as being pathogenicity factors, themselves. The aggressive fungal plant pathogen, Botrytis cinerea, is known to deliver some long-terminal repeat (LTR) deriving regulatory trans-species small RNAs (BcsRNAs) into plant cells to suppress host gene expression for infection. We find that naturally occurring, less aggressive B. cinerea strains possess considerably lower copy numbers of LTR retrotransposons and had lost retrotransposon BcsRNA production. Using a transgenic proof-of-concept approach, we reconstitute retrotransposon expression in a BcsRNA-lacking B. cinerea strain, which results in enhanced aggressiveness in a retrotransposon and BcsRNA expression-dependent manner. Moreover, retrotransposon expression in B. cinerea leads to suppression of plant defence-related genes during infection. CONCLUSIONS We propose that retrotransposons are pathogenicity factors that manipulate host plant gene expression by encoding trans-species BcsRNAs. Taken together, the novelty that retrotransposons are pathogenicity factors will have a broad impact on studies of host-microbe interactions and pathology

Oomycete small RNAs bind to the plant RNA-induced silencing complex for virulence

The exchange of small RNAs (sRNAs) between hosts and pathogens can lead to gene silencing in the recipient organism, a mechanism termed cross-kingdom RNAi (ck-RNAi). While fungal sRNAs promoting virulence are established, the significance of ck-RNAi in distinct plant pathogens is not clear. Here, we describe that sRNAs of the pathogen Hyaloperonospora arabidopsidis, which represents the kingdom of oomycetes and is phylogenetically distant from fungi, employ the host plant's Argonaute (AGO)/RNA-induced silencing complex for virulence. To demonstrate H. arabidopsidis sRNA (HpasRNA) functionality in ck-RNAi, we designed a novel CRISPR endoribonuclease Csy4/GUS reporter that enabled in situ visualization of HpasRNA-induced target suppression in Arabidopsis. The significant role of HpasRNAs together with AtAGO1 in virulence was revealed in plant atagol mutants and by transgenic Arabidopsis expressing a short-tandem-target-mimic to block HpasRNAs, that both exhibited enhanced resistance. HpasRNA-targeted plant genes contributed to host immunity, as Arabidopsis gene knockout mutants displayed quantitatively enhanced susceptibility

Identifizierung von Xylemsaft-induzierten Genen im vaskulaeren Pathogen Vertcillium longisporum mittles einer verbesserten cDNA-AFLP Methode fuer transkriptomweite Expressionsstudien

Die funktionelle Transkriptomik ist grundlegend in der heutigen biologischen Forschung. Vergleichende Analysen von Transkriptomen verschiedener physiologischer oder entwicklungsspezifischer Stadien ermoeglicht die Erkenntnis von Genen und ihrer biologischen Funktionen. In dieser Arbeit wurde die Methode des cDNA-AFLPs (cDNA-amplified fragment length polymorphism) gewaehlt, um Gene zu identifizieren, die eine Rolle in der Pathogenese von Verticillium longisporum bei der Infektion von Raps (Brassica napus) spielen. cDNA-AFLP benoetigt keine Vorkenntnisse ueber Gensequenzen und ist damit ubiquitaer anwendbar zur Entdeckung neuer Gene.Eine uneinheitliche Verteilung von Restriktionsschnittstellen bei der Erzeugung von cDNA Fragmenten beieinflusst das cDNA-AFLP im negativen Sinn. Einige Transkripte werden mehrfach repreasentiert, waehrend andere nicht detektiert werden, was zu Redundanz und zu unbefriedigenden Erfassungsraten von Trankripten fuehrt. Zur Verbesserung der Erfassung in der cDNA-AFLP Methode ohne einen Anstieg der Redundanz wurde ein modifiziertes cDNA-AFLP Protokol entwickelt. Immobilisierte cDNA wird sequenziell mit mehreren Restriktionsendonukleasen verdaut und die dadaurch freigesetzten cDNA Fragmente werden in exklusiven Pools gesammelt. Zur Pruefung der neuen Methode wurde eine Software auf der Basis von PERL entwickelt, genannt MECS (Multiple Enzyme cDNA-AFLP Simulation). Mittels Simulationen basierend auf EST Datensaetzen von Arabidopsis, Maus and Mensch zeigte sich, dass die neue cDNA-AFLP Strategie den klassische Protokollen in punkto Erfassung, Redundanz, Fragmentlaenge, und totale Anzahl von PCRs ueberlegen ist, wobei die Anwendung von 2 "marking" und 3 "releasing" Enzymen empfohlen wird.Des Weiteren wurden Untersuchungen von Quellen der Varianz in der Elektrophorese-basierenden Transkriptomik (cDNA-AFLP) gemacht. Dabei wurden Vergleiche in der Separation und der Detektion von amplifizierten cDNA Fragmenten ueber Flachbettpolyacrylamidgel-basierenden und Kapillarelektrophorese (DNA sequencer) durchgefuehrt. Die Kapillarelektrophorese zeigte eine geringere Datenvarianz. Die totale Varianz wurde aufgespalten in die einzelnen Beitrage der cDNA Synthese, Adapterligation, Preamplifikation, Amplifikation und der Elektrophorese. Den groessten Beitrag zur Varianz trug die Preamplifikation bei, was diesen Schritt fuer Verbesserungen praedestiniert. Des Weiteren wurden Paramater der Computer-gestuetzten Bandenerkennung und -paarung untersucht und Strategien zur Verbesserung der automatischen Bandenpaarung entwickelt, die auf eine zweimalige Bandendetektion mit unterschiedlichen Grenzwerten der Bandensignalstaerke beruhen. Die Datenqualitaet der cDNA-AFLP Experimente waren vergleichbar mit denen bekannt aus der Microarray Hybridisierung. Allerdings war die Varianz im cDNA-AFLP unabhaengig zur Signalstaerke, waehrend Microarraydaten zu hoeheren Varianzen bei geringen Signalstaerken tendieren.Das Transkriptom von V. longisporum wurde untersucht nach der Behandlung des Pilzes mit Xylemsaftextrakten der Wirtspflanze B. napus unter Anwendung der verbesserten cDNA-AFLP Methode. Ziel war es, Gene zu identifizieren, die speziell bei der Besiedlung des Xylems durch den Pathogen induziert werden. Unter 13000 cDNA-AFLP Signalen, die untersucht wurden, zeigten nur 34 eine Veraenderung in der Expression durch die Behandlung. Ueber reverse Transkription und real-time PCR wurden 21 klonierte und sequenzierte Transkripte getest und fuer 9 Transkripte konnte eine differentielle Expression bestaetigt werden. Die Expression dieser Kandidatengene wurde anschliessend in planta getestet und fuer 8 Transkripte zeigte sich auch hier eine Regulation im Vergleich zu in vitro Kulturen. Die Identifizierung von regulierten Genen speziell nach der Behandlung mit Xylemsaftmetaboliten aus Verticillium-infizierten Pflanzen wird unser Verstaendnis ueber die biochemische Interaktion zwischen V. longisporum und seiner Wirtspflanze vertiefen und als ein Beispiel der Interaktion eines vaskulaeren Pathogens mit seiner Wirtspflanzen generell stehen.Die quantitative Genexpressionsstudie von V. longisporum mittels eines genomweiten cDNA-AFLPs laesst erahnen, dass die Anpassung des Pathogens an die Xylemumgebung waehrend der Pathogenese nur durch eine geringe Anzahl an regulierten Genen ermoeglicht wird, die allerdings eine erhebliche Rolle bei der Interaktion mit der Wirtspflanze spielen. Die Sequenzanalyse der identifizierten, regulierten Gene deutet an, dass deren Genprodukte entweder regulatorische Funktionen haben oder bei Aufnahme von Zucker, Adhesion, Apoptose oder bei der Synthese von sekundaeren Metaboliten eine Rolle spielen. Ihre Funktion waehrend der Pathogenese wird durch Infektionsassays mit Gen-inaktivierten und mit Ueberexpressionsmutanten geklaert werden. Reportergenfusionen werden zeitliche und raeumliche Expressionsmuster der Kandidatengene waehrend der Infektion ermoeglichen

Small RNAs—the secret agents in the plant–pathogen interactions

Eukaryotic regulatory small RNAs (sRNAs) that induce RNA interference (RNAi) are involved in a plethora of biological processes, including host immunity and pathogen virulence. In plants, diverse classes of sRNAs contribute to the regulation of host innate immunity. These immune-regulatory sRNAs operate through distinct RNAi pathways that trigger transcriptional or post-transcriptional gene silencing. Similarly, many pathogen-derived sRNAs also regulate pathogen virulence. Remarkably, the influence of regulatory sRNAs is not limited to the individual organism in which they are generated. It can sometimes extend to interacting species from even different kingdoms. There they trigger gene silencing in the interacting organism, a phenomenon called cross-kingdom RNAi. This is exhibited in advanced pathogens and parasites that produce sRNAs to suppress host immunity. Conversely, in host-induced gene silencing (HIGS), diverse plants are engineered to trigger RNAi against pathogens and pests to confer host resistance. Cross-kingdom RNAi opens up a vastly unexplored area of research on mobile sRNAs in the battlefield between hosts and pathogens

Conversations between kingdoms: small RNAs

Humans, animals, and plants are constantly under attack from pathogens and pests, resulting in severe consequences on global human health and crop production. Small RNA (sRNA)-mediated RNA interference (RNAi) is a conserved regulatory mechanism that is involved in almost all eukaryotic cellular processes, including host immunity and pathogen virulence. Recent evidence supports the significant contribution of sRNAs and RNAi to the communication between hosts and some eukaryotic pathogens, pests, parasites, or symbiotic microorganisms. Mobile silencing signals—most likely sRNAs—are capable of translocating from the host to its interacting organism, and vice versa. In this review, we will provide an overview of sRNA communications between different kingdoms, with a primary focus on the advances in plant-pathogen interaction systems