Strukturelle und funktionelle Charakterisierung von Komponenten der eukaryotischen Eisen-Schwefel-Cluster-Biogenese-Maschinerie

Eisen-Schwefel-Cluster (Fe/S-Cluster) sind essentielle und vielseitige Kofaktoren zahlreicher Proteine und kommen in allen bekannten Lebensformen vor. Trotz ihrer vergleichsweise einfachen Struktur erfordert ihre Biosynthese und der Einbau in Apoproteine komplexe Synthesemaschinerien, die evolutionär konserviert sind. Im eukaryotischen Modellorganismus S. cerevisiae hängt die Biogenese mitochondrialer Fe/S-Proteine von der mitochondrialen ISC-Maschinerie ab, während die Synthese zytosolischer und nukleärer Fe/S-Proteine zusätzlich noch die mitochondriale ISC-Export- und die zytosolische CIA Maschinerie erfordert. Sowohl die Biosynthese mitochondrialer Fe/S-Proteine als auch die von zytosolischen oder nukleären Fe/S Proteinen kann in zwei biochemische Hauptreaktionen eingeteilt werden. Nach der de novo Assemblierung eines Fe/S Clusters auf einem Gerüstprotein wird der so vorgefertigte Cluster auf das eigentliche Zielprotein übertragen und dort inseriert. Während nahezu alle Komponenten der Biogenesemaschinerien mittlerweile bekannt sind, ist der molekulare Mechanismus der in vivo Fe/S-Cluster Biosynthese noch in vielen Punkten ungeklärt. Für die de novo Assemblierung von Fe/S-Clustern auf dem Gerüstprotein Isu1 der mitochondrialen ISC-Maschinerie ist die Elektronenübertragung durch ein Ferredoxin essentiell. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, dass sich eukaryotische mitochondriale Ferredoxine funktionell und strukturell in drei Untergruppen aufteilen lassen. Während die Mitglieder der ersten Untergruppe wie humanes Ferredoxin Fdx2 spezifisch an der Fe/S-Cluster Biogenese und der Häm A Biosynthese beteiligt sind, liefern die Ferredoxine der zweiten Untergruppe wie das Fdx2-verwandte humane Ferredoxin Fdx1 Elektronen für die Steroidbiogenese durch Cytochrom P450 Enzyme (CYP). Die dritte Untergruppe bilden die noch vielseitigeren Ferredoxine aus Pilzen wie Yah1 aus S. cerevisiae, das neben den Funktionen des Fdx2 auch noch eine essentielle Rolle in der Biosynthese von Koenzym Q6 spielt. In dieser Arbeit wurde die Struktur des humanen Ferredoxins Fdx2 mit einer Auflösung von 1,7 Å durch Röntgenstrukturanalyse bestimmt. Im Vergleich zur schon bekannten Struktur von Fdx1 besitzt Fdx2 eine nahezu identische Faltung. Strukturelle Unterschiede wurden nur in der α-Helix C sowie im Bereich nach α-Helix C gefunden. Dies warf die Frage nach der strukturellen Basis für die hohe Substratspezifität der beiden humanen Ferredoxine auf. Durch genetische und biochemische Experimente konnte gezeigt werden, dass der hoch konservierte C Terminus von Fdx2 essentiell für die in vivo Funktion des Proteins in der Biogenese von Fe/S-Clustern ist. Ein in der Fe/S-Cluster Biogenese funktionelles Fdx1 konnte durch die Übertragung der 27 C-terminalen Aminosäuren des Fdx2 an den Fdx1 C-Terminus erzeugt werden. Weitere Sequenzaustausche im Bereich der α Helix C sowie in der Fe/S-Cluster-bedeckenden Schlaufe erhöhten die Funktionsfähigkeit des Fdx1 in der Fe/S Proteinbiogenese, was die Rolle dieser Reste bei der Erzeugung der Substratspezifität nachweist. Umgekehrt gelang es, in Fdx2 eine Elektronenübertragungsfunktion auf CYP einzuführen. Die hierfür kritische Mutation wurde als R73E identifiziert. Die Umfunktionalisierung des Fdx2 war überraschenderweise nicht abhängig von der Sequenz am C Terminus. Da die Funktionsübertragung durch die R73E Mutation nur partiell erfolgte, scheint diese Schlüsselaminosäure nicht allein verantwortlich für die Spezifität von Fdx1 für CYP zu sein. Der positiv geladene Rest R73 im Fdx2 könnte daher eher verhindern, dass dieses Ferredoxin Elektronen auf CYP übertragen kann. Die theoretische Analyse des Dipolmomentes der Ferredoxine Fdx1 und Fdx2 ergab, dass die Dipolmomentvektoren der beiden Ferredoxine nahezu senkrecht zueinander stehen. Da die Interaktion der hochgeladenen Ferredoxine mit ihren Proteinpartnern auf Ladungswechselwirkungen beruht, deutet dieser Unterschied auf einen elektrostatischen Steuerungseffekt bei der Annäherung der Ferredoxine an den entsprechenden Elektronenakzeptor als mögliche Unterstützung der Funktionsspezifität hin. Ein solcher Steuerungseffekt könnte ein allgemeines Prinzip bei der Annäherung von Proteinen in transienten Elektronentransferkomplexen darstellen. .

Coenzyme q biosynthesis: coq6 is required for the c5-hydroxylation reaction and substrate analogs rescue coq6 deficiency.

International audienceCoenzyme Q (Q), an essential component of eukaryotic cells, is synthesized by several enzymes from the precursor 4-hydroxybenzoic acid. Mutations in six of the Q biosynthesis genes cause diseases that can sometimes be ameliorated by oral Q supplementation. We establish here that Coq6, a predicted flavin-dependent monooxygenase, is involved exclusively in the C5-hydroxylation reaction. In an unusual way, the ferredoxin Yah1 and the ferredoxin reductase Arh1 may be the in vivo source of electrons for Coq6. We also show that hydroxylated analogs of 4-hydroxybenzoic acid, such as vanillic acid or 3,4-dihydroxybenzoic acid, restore Q biosynthesis and respiration in a Saccharomyces cerevisiae coq6 mutant. Our results demonstrate that appropriate analogs of 4-hydroxybenzoic acid can bypass a deficient Q biosynthetic enzyme and might be considered for the treatment of some primary Q deficiencies

Structure of the Yeast WD40 Domain Protein Cia1, a Component Acting Late in Iron-Sulfur Protein Biogenesis

SummaryThe WD40-repeat protein Cia1 is an essential, conserved member of the cytosolic iron-sulfur (Fe/S) protein assembly (CIA) machinery in eukaryotes. Here, we report the crystal structure of Saccharomyces cerevisiae Cia1 to 1.7 Å resolution. The structure folds into a β propeller with seven blades pseudo symmetrically arranged around a central axis. Structure-based sequence alignment of Cia1 proteins shows that the WD40 propeller core elements are highly conserved. Site-directed mutagenesis of amino acid residues in loop regions with high solvent accessibility identified that the conserved top surface residue R127 performs a critical function: the R127 mutant cells grew slowly and were impaired in cytosolic Fe/S protein assembly. Human Ciao1, which reportedly interacts with the Wilms' tumor suppressor, WT1, is structurally similar to yeast Cia1. We show that Ciao1 can functionally replace Cia1 and support cytosolic Fe/S protein biogenesis. Hence, our structural and biochemical studies indicate the conservation of Cia1 function in eukaryotes

Functional spectrum and specificity of mitochondrial ferredoxins FDX1 and FDX2

International audienceFerredoxins comprise a large family of iron–sulfur (Fe–S) proteins that shuttle electrons in diverse biological processes. Human mitochondria contain two isoforms of [2Fe-2S] ferredoxins, FDX1 (aka adrenodoxin) and FDX2, with known functions in cytochrome P450-dependent steroid transformations and Fe–S protein biogenesis. Here, we show that only FDX2, but not FDX1, is involved in Fe–S protein maturation. Vice versa, FDX1 is specific not only for steroidogenesis, but also for heme a and lipoyl cofactor biosyntheses. In the latter pathway, FDX1 provides electrons to kickstart the radical chain reaction catalyzed by lipoyl synthase. We also identified lipoylation as a target of the toxic antitumor copper ionophore elesclomol. Finally, the striking target specificity of each ferredoxin was assigned to small conserved sequence motifs. Swapping these motifs changed the target specificity of these electron donors. Together, our findings identify new biochemical tasks of mitochondrial ferredoxins and provide structural insights into their functional specificity

The role of mitochondria in cellular iron–sulfur protein biogenesis and iron metabolism

AbstractMitochondria play a key role in iron metabolism in that they synthesize heme, assemble iron–sulfur (Fe/S) proteins, and participate in cellular iron regulation. Here, we review the latter two topics and their intimate connection. The mitochondrial Fe/S cluster (ISC) assembly machinery consists of 17 proteins that operate in three major steps of the maturation process. First, the cysteine desulfurase complex Nfs1–Isd11 as the sulfur donor cooperates with ferredoxin–ferredoxin reductase acting as an electron transfer chain, and frataxin to synthesize an [2Fe–2S] cluster on the scaffold protein Isu1. Second, the cluster is released from Isu1 and transferred toward apoproteins with the help of a dedicated Hsp70 chaperone system and the glutaredoxin Grx5. Finally, various specialized ISC components assist in the generation of [4Fe–4S] clusters and cluster insertion into specific target apoproteins. Functional defects of the core ISC assembly machinery are signaled to cytosolic or nuclear iron regulatory systems resulting in increased cellular iron acquisition and mitochondrial iron accumulation. In fungi, regulation is achieved by iron-responsive transcription factors controlling the expression of genes involved in iron uptake and intracellular distribution. They are assisted by cytosolic multidomain glutaredoxins which use a bound Fe/S cluster as iron sensor and additionally perform an essential role in intracellular iron delivery to target metalloproteins. In mammalian cells, the iron regulatory proteins IRP1, an Fe/S protein, and IRP2 act in a post-transcriptional fashion to adjust the cellular needs for iron. Thus, Fe/S protein biogenesis and cellular iron metabolism are tightly linked to coordinate iron supply and utilization. This article is part of a Special Issue entitled: Cell Biology of Metals