Effekte mesenchymaler Knochenstammzellen auf Kopf-Hals-Tumorzelllinien in 2D- und 3D- Zellkultur

Plattenepithelkarzinome stellen die häufigste Malignität im Kopf- und Halsbereich dar (engl.: head and neck squamous cell carcinomas, HNSCCs). Trotz Intensivierung von Forschung und Entwicklung an erweiterten und neuen Therapieansätzen hat sich die Überlebensprognose von Patienten mit Kopf-Hals-Tumoren, vorwiegend in fortgeschrittenen Stadien, bisher nicht wesentlich verbessert. Die Metastasierung ins Knochengewebe stellt einen der häufigsten Metastasierungsorte in allen HNSCC-Patienten dar und geht mit einer besonders schlechten Prognose einher. Hier wird die Dringlichkeit deutlich, grundlegende Interaktionen von Zellen im Tumornetzwerk weiter aufzuklären und zu verstehen. Bis heute ist noch nicht vollständig geklärt, wie Tumorzellen ihre Umgebung beeinflussen und welche Interaktionen zwischen Tumorzellen und der Tumormikroumgebung das Tumorwachstum begünstigen. Vor allen in weiter fortgeschrittenen Stadien konnten unter anderem mesenchymale Stammzellen aus dem Knochenmark (engl.: bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs) im Tumorgewebe von HNSCC-Patienten nachgewiesen werden. Ziel dieser Arbeit war es, die Auswirkung der Wechselwirkung zwischen HNSCC-Zellen und BMSCs auf Matrixmetalloprotease-9 (MMP-9) Expression und Funktion weiter aufzuklären. Diesen Stammzellen werden sowohl tumorhemmende als auch tumorprogressive Eigenschaften zugeschrieben. Ihre Auswirkung auf Tumorzellen und die Tumormikroumgebung ist bis heute jedoch nicht eindeutig geklärt und wird in der Literatur kontrovers diskutiert. Die aktuellen Forschungsergebnisse bieten derzeit überwiegend Hinweise auf die Förderung aggressiver Tumoreigenschaften durch die Infiltration mesenchymaler Stammzellen. Aus der Arbeitsgruppe war bekannt, dass es bei Co-Kultivierung von BMSCs und HNSCC-Zellen in 3D-Zellkultur zu einer erhöhten Gen- und Proteinexpression der osteogenen Differenzierungsmarker Runt-verwandte Transkriptionsfaktor 2 (Runx2) und Alkalische Phosphatase (ALP) kam. Neben der osteogenen Differenzierung konnten sowohl Runx2 als auch ALP eine Beeinflussung der epitheliale-mesenchymale Transition (EMT), Invasion und Metastasierung von Tumoren zugeschrieben werden. In dieser Arbeit wurde die Rolle von ALP bei der Ausbreitung von co-kultivierten Sphäroiden untersucht. Um eine möglichst realitätsnahe Wachstums- und Versorgungsumgebung zu ermöglichen, stand besonders die 3D-Kultivierung der untersuchten Zellen nach der sogenannten Hanging Drop-Methode, neben einer 2D-Kultivierung adhärenter Zellen, im Vordergrund. Es konnte gezeigt werden, dass ALP das Ausbreitungsverhalten von HNSCC-Zellen begünstigt, da die Inhibition von ALP die Ausbreitung von Co-Kultur Sphäroiden auf Basallamina-ähnlichem Matrigel® hemmte. Daten der Arbeitsgruppe konnten zudem eine erhöhte Expression und Sekretion von MMP-9 bei Kultivierung von HNSCC-Zellen zusammen mit BMSCs nachweisen. Bei MMP-9 handelt es sich um eine Gelatinase, die für den Abbau extrazellulärer Matrix verantwortlich ist und mit einer erhöhten Tumorinvasion und Metastasierung assoziiert ist. Der genaue zelluläre Ursprung einer erhöhten Expression von MMP-9 im Tumorgewebe war bisher nicht bekannt. Diese Arbeit konnte aufzeigen, dass die mesenchymalen Knochenmarkstammzellen Ursprung der erhöhten MMP-9 Expression bei Co-Kultivierung mit HNSCC-Zellen waren. Zur Beantwortung der Frage, ob HNSCC-Zellen nach Co-Kultivierung mit BMSCs eine erhöhte MMP-9 Promotoraktivität aufweisen, erfolgte die Durchführung eines Dual-Luciferase® Reporter Assays. Hierbei stellte sich heraus, dass in HNSCC-Zellen bei Co-Kultivierung mit BMSCs keine Steigerung der MMP-9 Promotoraktivität auftrat. Eine Analyse der MMP-9 Sekretion nach spezifischem MMP-9 small interfering RNA (siRNA) Knockdown in BMSCs bzw. HNSCC-Zellen konnte nur nach Knockdown in BMSCs eine deutliche Reduktion der MMP-9 Expression herbeiführen. Des Weiteren diente diese Arbeit der genaueren Erforschung der Regulation der MMP-9 Expression durch Runx2 aus HNSCC-Zellen. Dafür wurde ein Knockdown von Runx2 mittels spezifischer siRNA in HNSCC-Zellen durchgeführt. Es folgte die Analyse der MMP-9 Aktivität in der Gelatinase-Zymographie. Hierbei konnte kein eindeutiger Einfluss von Runx2 auf die MMP-9 Aktivität in Sphäroiden aus HNSCC-Zellen gezeigt werden. Hier sind weiterführende Untersuchungen zur Regulation von MMP-9 notwendig. Zusammenfassend konnte diese Arbeit zeigen, dass BMSCs durch Sekretion von MMP-9 einen tumorprogressiven Einfluss auf HNSCC-Zellen ausüben und der osteogene Differenzierungsmarker ALP BMSCs und HNSCC-Zellen zur Interaktion mit Basallamina-ähnlichem Matrigel® befähigt und deren Ausbreitung begünstigt. Die durchgeführten Experimente lassen auf einen synergistischen Einfluss von MMP-9 und ALP auf die Migrations- und Invasionsfähigkeit von HNSCCs schließen

Opposing MMP-9 Expression in Mesenchymal Stromal Cells and Head and Neck Tumor Cells after Direct 2D and 3D Co-Culture

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BMSCs) respond to a variety of tumor cell-derived signals, such as inflammatory cytokines and growth factors. As a result, the inflammatory tumor microenvironment may lead to the recruitment of BMSCs. Whether BMSCs in the tumor environment are more likely to promote tumor growth or tumor suppression is still controversial. In our experiments, direct 3D co-culture of BMSCs with tumor cells from the head and neck region (HNSCC) results in strong expression and secretion of MMP-9. The observed MMP-9 secretion mainly originates from BMSCs, leading to increased invasiveness. In addition to our in vitro data, we show in vivo data based on the chorioallantoic membrane (CAM) model. Our results demonstrate that MMP-9 induces hemorrhage and increased perfusion in BMSC/HNSCC co-culture. While we had previously outlined that MMP-9 expression and secretion originate from BMSCs, our data showed a strong downregulation of MMP-9 promoter activity in HNSCC cells upon direct contact with BMSCs using the luciferase activity assay. Interestingly, the 2D and 3D models of direct co-culture suggest different drivers for the downregulation of MMP-9 promoter activity. Whereas the 3D model depicts a BMSC-dependent downregulation, the 2D model shows cell density-dependent downregulation. In summary, our data suggest that the direct interaction of HNSCC cells and BMSCs promotes tumor progression by significantly facilitating angiogenesis via MMP-9 expression. On the other hand, data from 3D and 2D co-culture models indicate opposing regulation of the MMP-9 promoter in tumor cells once stromal cells are involved

Pre-trial evaluation of the potential for unblinding in drug trials: a prototype example

Blinding is an important design feature of randomised trials that may reduce bias in the results, compared to the situation where blinding is not possible or is not maintained. The literature provides some guidance for the evaluation of blinding in ongoing or completed studies, but the question of pre-trial assessment of the potential for unblinding has not been addressed. This paper describes the design and analysis of a prototype experiment for the pre-trial assessment of blinding in a drug trial. This work was motivated by a trial using antibiotic therapy, in which the investigators were concerned about the possibility of subjects being able to differentiate active medication from placebo, and thus become unblinded to their treatment assignment. A small experiment was mounted in which participants had to divide a random mixture of tablets into two groups. Statistical methods were developed to calculate the probability of a given number of similar tablets being classified into the same group by chance, with a modification to allow for some participants having constrained their responses to have equal numbers of tablets in each group. Differentiation of tablets by taste (the initial concern of the investigators) was not statistically different from chance. A smaller set of data on differentiation by appearance (a possibility not originally considered) had borderline statistical significance. After reviewing all these results, the investigators decided to proceed with the study without modifying the tablets, in part because subjects in the study would be unlikely to compare the two types of medication side-by-side. Our results suggest that blinding might sometimes be compromised in unexpected ways. Whenever possible, we suggest that similar and larger such experiments be carried out before the trial to assess whether blinding might be compromised. The methods proposed here could easily be adapted to evaluate the results of such experiments

Induction of ALP and MMP9 activity facilitates invasive behavior in heterogeneous human BMSC and HNSCC 3D spheroids

Mesenchymal stem cells (MSCs) are multipotent progenitor cells capable of differentiating into adipocytic, osteogenic, chondrogenic, and myogenic lineages. There is growing evidence that MSCs home into the tumor microenvironment attracted by a variety of signals such as chemokines, growth factors, and cytokines. Tumor-homing stem cells may originate from bone marrow-derived MSCs (BMSCs) or adipose tissue-derived MSCs. Recent scientific data suggest that MSCs in combination with tumor cells can either promote or inhibit tumorigenic behavior. In head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), BMSCs are reported to be enriched with a potential negative role. Here, we evaluated the effect of BMSCs from 4 different donors in combination with 4 HNSCC cell lines in a 3-dimensional multicellular spheroid model. Heterogeneous combinations revealed an up-regulation of gene and protein expression of osteogenic markers runt-related transcription factor 2 (RUNX2) and alkaline phosphatase (ALP) together with a substantial secretion of matrix metalloproteinase 9. Moreover, heterogenous BMSC/tumor spheroids showed increased invasion compared with homogenous spheroids in a Boyden chamber invasion assay. Furthermore, inhibition of ALP resulted in a substantially decreased spreading of heterogeneous spheroids on laminin-rich matrix. In summary, our data suggest a prometastatic effect of BMSCs combined with HNSCC

Approximate counting : a martingale approach

SIGLECNRS 14802E / INIST-CNRS - Institut de l'Information Scientifique et TechniqueFRFranc