Die humane Proteinkinase Mps1 ist essentiell für den mitotischen Spindelkontrollpunkt, aber nicht für Zentrosomenduplikation

Die Familie der Mps1-Proteinkinasen (Monopolar spindle 1) hat mehrere wichtige Aufgaben im Zellzyklus. Mps1p wurde zuerst in S. cerevisiae gefunden und näher charakterisiert. Mps1p ist zum einen an der Verdoppelung des Spindel-Polkörperchens beteiligt und zum anderen ist die Kinase eine Komponente im mitotischen Spindelkontrollpunkt. Das Spindel-Polkörperchen ist das Centrosomäquivalent in Hefezellen und somit das Mikrotubuli-Organisationszentrum (MTOC) in Zellen. Zu Beginn der Mitose dient das MTOC zum Aufbau des mitotischen Spindelapparates, der aus Mikrotubuli besteht. Mikrotubuli zeigen in dieser Phase eine hohe Dynamik, was durch Hinzufügen und Entfernen der sie aufbauenden Einzelbausteine, der Tubuline, erklärt werden kann. Während des Zellzyklus muss sich das Spindel-Polkörperchen/Centrosom verdoppeln, um zu Beginn der Mitose eine bipolare Spindel aufbauen zu können. Hefemutanten im MPS1-Gen bilden dagegen eine monopolare Spindel, was auf einem Defekt während der Verdoppelung des Spindel-Polkörperchens beruht. Die Untersuchung der MPS1-Mutanten liess aber auch die zweite, bedeutende Funktion von Mps1p im Zellzyklus erkennen: die Kinase spielt im mitotischen Spindelkontrollpunkt eine wichtige Rolle. Dieser Kontrollpunkt gewährleistet, dass es während dem Übergang von der Metaphase zur Anaphase zu einer gleichmässigen Verteilung der Chromosomen auf die Tochterzellen kommt. Beim Eintritt in die Mitose binden die Mikrotubuli des mitotischen Spindelapparates an die replizierten Chromosomen, auch Schwesterchromatiden genannt. Die Bindestellen der Mikrotubuli auf den Schwesterchromatiden werden als Kinetochoren bezeichnet. Dabei handelt es sich um spezifische Proteinkomplexe an den Centromeren von Chromosomen, die die Mikrotubuli einfangen und stabilisieren. Der mitotische Spindelkontrollpunkt verzögert nun die Trennung der Schwesternchromatiden solange bis alle Kinetochoren an Mikrotubuli gebunden sind. Komponenten des mitotischen Spindelkontrollpunkts lokalisieren an Kinetochoren, um den Zustand der Mikrotubulibindung zu überprüfen. Erst wenn alle Kinetochoren mit Mikrotubuli verbunden sind, wird das inhibitorische Zellzyklussignal ausgeschaltet, und die Zelle kann mit der Mitose fortfahren. In diversen Organismen wurden Proteinkinasen identifizert, die Homologie zu Mps1p von S. cerevisiae aufweisen. Für S. pombe und X. laevis wurde eine Funktion der Mps1 Proteinkinase im mitotischen Spindelkontrollpunkt gezeigt. Demgegenüber steht eine Studie in M. musculus, in der mMps1 für die Duplikation der Centrosomen notwendig ist. Wir haben eine detailierte Untersuchung über die Funktion der humanen Mps1 Proteinkinase durchgeführt. Wir zeigen, dass hMps1 im Verlauf des Zellzyklus reguliert wird. Proteinexpression und Kinaseaktivität sind während der Mitose am höchsten. Wird zusätzlich der mitotische Spindelkontrollpunkt induziert ist hMps1 maximal phosphoryliert und aktiviert. Mehrere, hochspezifische monoklonale Antikörper gegen hMps1 zeigen, dass das Protein in frühen Phasen der Mitose an den Kinetochoren lokalisiert, wofür die amino-terminale, regulatorische Domäne von hMps1 notwendig ist. Wir finden keine Lokalisierung von hMps1 an Centrosomen in Interphase und auch nicht an den Spindelpolen während der Mitose. Zudem geben mehrere funktionelle Analysen wie die Überexpression von Wild-typ- und katalytisch inaktiver Mutanten, Antikörpermikroinjektionen und siRNA-Experimente keine Hinweise auf eine Funktion von hMps1 in der Duplikation der Centrosomen. Demgegenüber wird aber durch Antikörpermikroinjektionsstudien und siRNA-Experimente gezeigt, dass hMps1 eine essentielle Funktion in der Etablierung und / oder in der Aufrechterhaltung eines aktiven mitotischen Spindelkontrollpunktes in humanen Zellen hat. Wird die Funktion von hMps1 ausgeschaltet, können die Zellen sowohl nicht mehr den Spindelkontrollpunkt aktivieren als auch nicht mehr imZellzyklus in der frühen Mitose arretieren. Schliesslich wird noch der Mechanismus untersucht, wie hMps1 im Spindelkontrollpunkt funktioniert. Wir zeigen, dass hMps1 wichtig ist für die Kinetochorlokalisierung von spezifischen Spindelkontrollpunktproteinen. hMps1 ist einerseits notwendig für die Bindung von hMad1/hMad2-Proteinkomplexen an Kinetochoren, während andererseits die Lokalisierung von Spindelkontrollpunktproteinen wie hBub1/hBubR1 und CENP-E nicht von hMps1 abhängen. Das Protein Hec1 dagegen ist entscheidend dafür, dass hMps1 effizient an das Kinetochor lokalisieren kann. Aus diesen Resultaten folgern wir dass die Funktion von hMps1 für den mitotischen Spindelkontrollpunkt gebraucht wird, aber nicht für die Duplikation der Centrosomen. Diese Schlussfolgerung steht im Widerspruch zur gegenwärtigen Annahme, dass Mps1 Proteinkinasen evolutionär konservierte duale Funktionen haben. Wir schlagen vor, dass die primäre Funktion von Mps1 Proteinkinasen im mitotischen Spindelkontrollpunkt liegt

Kinetochore localization and microtubule interaction of the human spindle checkpoint kinase Mps1

Members of the Mps1 protein kinase family have been implicated in the regulation of the kinetochore-mediated spindle assembly checkpoint in species ranging from yeast to man. However, conflicting data have been reported on the subcellular localization of vertebrate Mps1 kinases and their possible roles in centrosome duplication. Moreover, little is presently known about the regulation of Mps1 kinases during the cell cycle. Here, we have used immunofluorescence microscopy, immunoblotting and siRNA-mediated depletion of hMps1 to re-investigate the subcellular localization of this kinase. Our data confirm the kinetochore association of hMps1 but suggest that the centrosome staining produced by some anti-hMps1 antibodies could be due to cross-reactivity with other proteins. We also show that the kinetochore association of hMps1 is mediated by the amino-terminal, non-catalytic domain and specifically requires the presence of the Hec1/Ndc80-Nuf2 complex at the kinetochore. Finally, we have combined in vitro binding studies and kinase assays to explore the influence of microtubules on hMps1 activity. Our data indicate that the catalytic domain of hMps1 displays affinity for microtubules and that microtubule binding could contribute to the regulation of kinase activity

Role of Hec1 in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of Mad1/Mad2

The spindle checkpoint delays sister chromatid separation until all chromosomes have undergone bipolar spindle attachment. Checkpoint failure may result in chromosome mis-segregation and may contribute to tumorigenesis. We showed that the human protein Hec1 was required for the recruitment of Mps1 kinase and Mad1/Mad2 complexes to kinetochores. Depletion of Hec1 impaired chromosome congression and caused persistent activation of the spindle checkpoint, indicating that high steady-state levels of Mad1/Mad2 complexes at kinetochores were not essential for checkpoint signaling. Simultaneous depletion of Hec1 and Mad2 caused catastrophic mitotic exit, making Hec1 an attractive target for the selective elimination of spindle checkpoint-deficient cells

Human Mps1 kinase is required for the spindle assembly checkpoint but not for centrosome duplication

Budding yeast Mps1p kinase has been implicated in both the duplication of microtubule-organizing centers and the spindle assembly checkpoint. Here we show that hMps1, the human homolog of yeast Mps1p, is a cell cycle-regulated kinase with maximal activity during M phase. hMps1 localizes to kinetochores and its activity and phosphorylation state increase upon activation of the mitotic checkpoint. By antibody microinjection and siRNA, we demonstrate that hMps1 is required for human cells to undergo checkpoint arrest in response to microtubule depolymerization. In contrast, centrosome (re-)duplication as well as cell division occur in the absence of hMps1. We conclude that hMps1 is required for the spindle assembly checkpoint but not for centrosome duplication

Accepting from the best donor; analysis of long-lifetime donor fluorescent protein pairings to optimise dynamic FLIM-based FRET experiments

<div><p>FRET biosensors have proven very useful tools for studying the activation of specific signalling pathways in living cells. Most biosensors designed to date have been predicated on fluorescent protein pairs that were identified by, and for use in, intensity based measurements, however fluorescence lifetime provides a more reliable measurement of FRET. Both the technology and fluorescent proteins available for FRET have moved on dramatically in the last decade. Lifetime imaging systems have become increasingly accessible and user-friendly, and there is an entire field of biology dedicated to refining and adapting different characteristics of existing and novel fluorescent proteins. This growing pool of fluorescent proteins includes the long-lifetime green and cyan fluorescent proteins Clover and mTurquoise2, the red variant mRuby2, and the dark acceptor sREACh. Here, we have tested these donors and acceptors in appropriate combinations against the standard or recommended norms (EGFP and mTFP as donors, mCherry and either Ypet or Venus as acceptors) to determine if they could provide more reliable, reproducible and quantifiable FLIM-FRET data to improve on the dynamic range compared to other donors and breadth of application of biosensor technologies. These tests were performed for comparison on both a wide-field, frequency domain system and a multiphoton, TCSPC time domain FLIM system. Clover proved to be an excellent donor with extended dynamic range in combination with mCherry on both platforms, while mRuby2 showed a high degree of variability and poor FRET efficiencies in all cases. mTFP-Venus was the most consistent cyan-yellow pair between the two FLIM methodologies, but mTurquoise2 has better dynamic range and transfers energy consistently over time to the dark acceptor sRCh. Combination of mTFP-sRCh with Clover-mCherry would allow the simultaneous use of two FLIM-FRET biosensors within one sample by eliminating the crosstalk between the yellow acceptor and green donor emissions.</p></div

Assay potential (Z’) and FRET efficiency under frequency and time domain FLIM conditions at t = 0.

<p>Assay potential (Z’) and FRET efficiency under frequency and time domain FLIM conditions at t = 0.</p

Fluorescence lifetime measurements of FRET donors expressed in mammalian cells.

<p><b>A.</b> Fluorescence lifetimes of FRET donors expressed alone in HEK293 cells, measured in both the frequency domain (black bars) and the multiphoton time domain (white bars). Error bars represent the standard deviation in the lifetime measurements of a total 130 > n < 450 individual cells for each bar. <b>B.</b> Representative Frequency Domain fluorescence lifetime images for the 4 donors, acquired at 60X magnification on a Nikon TE2000 microscope equipped with the Lambert Instruments Fluorescence Attachment system. Images are false coloured with lifetime information; warm colours represent longer lifetimes and cool colours shorter lifetimes as per the colour scale provided. <b>C.</b> Representative Multiphoton Time Domain fluorescence lifetime images for the 4 donors, acquired at 20X magnification on a LaVision BioTec TRIMScope. Images are false coloured with lifetime information; warm colours represent longer lifetimes and cool colours shorter lifetimes as per the colour scale provided.</p

Multiphoton time domain fluorescence lifetime measurements of FRET pairs expressed in mammalian cells.

<p><b>A.</b> Multiphoton time domain measurements of fluorescence lifetimes of FRET donors when fused to acceptors and expressed in HEK293 cells (dark grey bars) and the respective FRET efficiencies (yellow bars) calculated from the donor-alone lifetimes from <b><i><a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0183585#pone.0183585.g001" target="_blank">Fig 1A</a></i></b> (shown for reference as greyed-out bars). Error bars represent the standard deviation in the lifetime measurements of a total 105 > n < 145 individual cells for each bar. <b>B.</b> Representative Multiphoton Time Domain fluorescence lifetime images for the 11 FRET pairs, acquired at 20X magnification on a LaVision BioTec TRIMScope. Images are false coloured with lifetime information; warm colours represent longer lifetimes and cool colours shorter lifetimes as per the colour scale provided.</p

Z-Factor and FRET efficiency as a measure of the dynamic assay potential of FRET pairs expressed in mammalian cells.

<p>Throughout this figure the donor involved is denoted by the shape of the point (EGFP = circle, Clv = square, mTFP = triangle and mTq2 = diamond) and the acceptor is denoted by the fill-colour of the symbol (mCh = red, mR2 = blue, YPet = yellow, Ven = green and sRCh = black) <b>A.</b> Plot of the mean Z’ of the frequency domain lifetime measurements over a 10 minute time course in 3 separate experiments against their mean FRET Efficiency for those experiments. Error bars on both axes represent standard deviation. <b>B.</b> Plot of the mean Z’ of the multiphoton time domain lifetime measurements over a 10 minute time course in 3 separate experiments against their mean FRET Efficiency for those experiments. Error bars on both axes represent standard deviation. <b>C.</b> Direct comparison of the Z’ values from the two different FLIM systems; pairs that respond similarly on both systems will fall on the x = y diagonal. Error bars represent standard deviation.</p