Descrição histológica de imaturos de Chironomus sancticaroli Strixino e Strixino, 1981 (Diptera: Chironomidae) e efeitos histopatológicos e biológicos após a exposição ao fenatreno

Resumo: Imaturos de Chironomidae são considerados bioindicadores de qualidade de sedimentos em ecossistemas aquáticos. A utilização de biomarcadores histopatológicos para compreender os efeitos de xenobióticos nestes organismos pode nos fornecer indícios da qualidade ambiental, porém não existem descrições histológicas recentes do grupo, o que enfatiza também a necessidade de estudos histológicos. O objetivo do trabalho foi descrever a histologia da larva de Chironomus sancticaroli e avaliar alterações na estrutura histológica e no desenvolvimento causadas pela exposição ao hidrocarboneto fenantreno. Os organismos utilizados foram provenientes de colônia matriz do Laboratório de Entomologia Médica e Veterinária da Universidade Federal do Paraná mantida em sala de criação com controle de temperatura (25ºC ±2), fotoperíodo (12h claro:12h escuro) e umidade (80%). Para o padrão histológico foram utilizadas 30 larvas da colônia que foram fixadas em solução Dubosq para insetos a 56ºC, seguido de processamento histológico de rotina com emblocagem em parafina, obtendo-se cortes que foram corados com Hematoxilina-Eosina. A sensibilidade dos organismos da colônia foi avaliada através de testes de sensibilidade ao KCl e o sedimento utilizado nos bioensaios passou por análises químicas e mineralógicas. Foram realizados bioensaios de toxicidade aguda com fenantreno utilizando 10 larvas de 3º ínstar final/4º ínstar inicial nas quatro réplicas de cada concentração, com duração de 96h em câmaras tipo BOD, com as concentrações letais (CLs) calibradas anteriormente CENO (concentração de efeito não observado) de (0,12 mg/L), CL2 (0,6 mg/L), CL10 (0,78 mg/L), CL30 (1,01 mg/L) e CL50 (1,2 mg/L). Os bioensaios de toxicidade crônica foram conduzidos com as concentrações CENO, CL2 e CL10 iniciando com 20 larvas de 1º ínstar por réplica sendo quatro por concentração alimentadas com ração Tetramin®, sob aeração constante, com duração de oito dias, período em que as larvas do controle atingiram o 4ºínstar final, com renovação da água e contaminante a cada 48 horas, utilizando areia como sedimento em ambos ensaios. Nas larvas sobreviventes foram realizadas análises histológicas, segundo protocolo descrito anteriormente, utilizando 10 exemplares por concentração, e nos bioensaios de toxicidade crônica o desenvolvimento larval foi avaliado medindo o tamanho do corpo e da antena da larva. Foi descrito a histologia dos principais sistemas: digestório e glândulas anexas, excretor, circulatório, nervoso e tegumentar. Nos bioensaios de toxicidade aguda foram observadas alterações teciduais nas concentrações CL2, CL10, CL30 e CL50 e nos bioensaios de toxicidade crônica ocorreram alterações em todas as concentrações. As principais modificações observadas ocorreram em células da região III do intestino médio e células de Cuénot como a diminuição da borda em escova e rompimento da região apical das células; nos túbulos de Malpighi foi possível observar diminuição da borda em escova e nos trofócitos do corpo gorduroso observaram-se alterações nucleares, as alterações mostraram-se dose-dependentes. Foram também observados efeitos na exposição crônica no tamanho do corpo e da antena, demonstrando que ocorreram alterações no desenvolvimento larval. O hidrocarboneto fenantreno causou alterações teciduais mesmo em baixas concentrações em C. sancticaroli em exposição aguda e crônica. Estas modificações provavelmente alteram a fisiologia do organismo que a longo prazo podem refletir na dinâmica populacional da espécie

Respostas ecotoxicológicas em Chironomidae (Diptera) : uma abordagem fisiológica e evolutiva

Orientador: Prof. Dr. Mário Antônio Navarro da SilvaCoorientadora: Prof. Dr. Célia Regina Cavichiolo FrancoTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Defesa : Curitiba, 22/02/2017Inclui referências: p. 101-125Área de concentração: EntomologiaResumo: A sobrevivência é o maior desafio enfrentado por organismos que habitam ambientes constantemente degradados pela ação antrópica, muitos deles o vencem porém com custos biológicos da exposição. O objetivo da tese foi avaliar as respostas de larvas de Chironomidae sob desafios da sobrevivência em degradação ambiental através de biomarcadores. Primeiramente bioensaios de toxicidade crônica foram realizados em larvas de Chironomus sancticaroli expostas a sedimentos provindos de 5 rios e 5 reservatórios do estado de São Paulo, nessas larvas foram avaliados as respostas de biomarcadores como AChE (Acetilcolinesterase), EST-? (Esterase alfa), EST-? (Esterase beta), GST (Glutationa S-transferase), CAT (Catalase), SOD (Superóxido-dismutase), LPO (lipoperoxidação) e alterações histológicas. Além disso, larvas de Chironomus dilutus foram expostas em um respirômetro por 6 horas a 4 concentrações de arsênio e oxigênio dissolvido e suas combinações resultando em 16 tratamentos. Nesses organismos além do consumo de oxigênio em exposição ao arsênio, foi avaliado para todas as combinações a expressão gênica das hemoglobinas A, B, C, D e a enzima GST. Por fim, 12 espécies distribuídas em Chironomus, Dicrotendipes e Goeldichironomus foram expostas por 48 horas ao malathion e ao propuxur, nesses organismos foi mensurado a atividade das enzimas AChE, EST-? e EST-?. Com a resposta enzimática foi aplicado as métricas K e para detecção de sinal filogenético, juntamente com uma filogenia baseada no COI (citocromo oxidase I), além disso respostas de espécies iguais coletadas em locais diferentes foram comparadas para verificar o efeito da pressão de seleção. Para C. sancticaroli exposta ao sedimentos, todas as enzimas apresentaram alterações em relação ao grupo controle, além de estresse oxidativo e a histologia demonstrou efeitos principalmente no corpo gorduroso visceral. Em C. dilutus houve um aumento no consumo de oxigênio em exposição ao arsênio e aumento na expressão da HbA na exposição ao arsênio, HbB em arsênio e hipóxia, Hb A, D e GST na combinações das duas condições. Nas 13 espécies de Chironomidae expostas a pesticidas, não existe sinal filogenético para a respostas da enzimas, mas para as espécies de Chironomus foi observado uma tendência para as enzimas AChE e EST-?. A pressão de seleção se mostrou o principal direcionador das respostas enzimáticas já que mesmas espécies coletadas em locais diferentes, apresentaram níveis diferenciados de atividade. Larvas de Chironomidae possuem uma considerável plasticidade fisiológica que permite-os sobreviver nesse ambientes desafiadores, mesmo sem mortalidade, alterações foram detectadas demonstrando desequilíbrios da homeostase. Mesmo com a pressão de seleção que esses organismos sofrem no ambiente natural, eles se mantém vivos e resistentes, esse quadro pode refletir em algum custo no fitness das espécies a longo prazo. Palavras-chave: Chironomidae, sedimento, biomarcadores bioquímicos, expressão gênica, biologia comparadaAbstract: Survival is the biggest challenge faced by organisms inhabiting environments constantly degraded by anthropic activities. Several organisms can thrive but they have biological costs of exposure. The aim of the thesis was evaluate the chironomids larvae responses under survival challenges of environmental degradation using biomarkers. First, chronic bioassays were carried out in Chironomus sancticaroli larvae exposed to sediments of 5 rivers and 5 reservoirs from São Paulo State. It was measured in these larvae biomarkers as AChE (Acetylcholinesterase), EST-? (alpha-esterase), EST-? (beta-esterase), GST (Glutathione S-transferase), CAT (Catalase), SOD (Superoxide-dismutase), LPO (lipid peroxidation) and histopathologies. In addition, Chironomus dilutus larvae were exposed in a respirometer for 6 hours to 4 concentrations of arsenic and dissolved oxygen and their combinations resulting in 16 treatments. Beyond oxygen consumption in arsenic exposure, in the combinations were measured gene expression of A, B, C, D hemoglobins and GST enzyme. Finally, 12 species of Chironomus, Dicrotendipes, and Goeldichironomus were exposed for 48 hours to malathion and propoxur pesticides. The activity of AChE, EST-? e EST-? was measured, and in the results was applied K and metrics to phylogenetic signal detection also using a phylogeny based in COI gene (cytochrome oxidase I). The responses from same species collected in different sites were compared to verify selection pressure influence. In C. santicaroli exposed to sediments, all enzymes showed alterations comparing with control group, also was detected oxidative stress and tissues changes in visceral fat body. In C. dilutus there was an increase of oxygen consumption in arsenic exposure, also was observed increase of HbA expression (arsenic exposure), HbB (arsenic and hypoxia) and HbA, D, GST in combinations of both conditions. Throughout of 13 chironomids species exposed to pesticides, there was no phylogenetic signal to enzymes responses, but to Chironomus species there was a trend to AChE and EST-? enzymes. Selection pressure showed the main driver of enzymatic responses due to the fact same species collected in different sites had no similar levels of activity. Chironomidae larvae have a remarkable physiological plasticity that allows them to survive in challenging environments, even mortality being not observed changes were detected demonstrating homeostasis imbalance. In the environment, even suffering with selection pressure, chrinomids are alive and resistants, this status can reflect in some fitness cost of this species in a long-term. Keywords: Chironomidae, sediment, biochemical biomarkers, gene expression, comparative biolog

Respostas ecotoxicológicas em Chironomidae (Diptera) : uma abordagem fisiológica e evolutiva

Orientador: Prof. Dr. Mário Antônio Navarro da SilvaCoorientadora: Prof. Dr. Célia Regina Cavichiolo FrancoTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Defesa : Curitiba, 22/02/2017Inclui referências: p. 101-125Área de concentração: EntomologiaResumo: A sobrevivência é o maior desafio enfrentado por organismos que habitam ambientes constantemente degradados pela ação antrópica, muitos deles o vencem porém com custos biológicos da exposição. O objetivo da tese foi avaliar as respostas de larvas de Chironomidae sob desafios da sobrevivência em degradação ambiental através de biomarcadores. Primeiramente bioensaios de toxicidade crônica foram realizados em larvas de Chironomus sancticaroli expostas a sedimentos provindos de 5 rios e 5 reservatórios do estado de São Paulo, nessas larvas foram avaliados as respostas de biomarcadores como AChE (Acetilcolinesterase), EST-? (Esterase alfa), EST-? (Esterase beta), GST (Glutationa S-transferase), CAT (Catalase), SOD (Superóxido-dismutase), LPO (lipoperoxidação) e alterações histológicas. Além disso, larvas de Chironomus dilutus foram expostas em um respirômetro por 6 horas a 4 concentrações de arsênio e oxigênio dissolvido e suas combinações resultando em 16 tratamentos. Nesses organismos além do consumo de oxigênio em exposição ao arsênio, foi avaliado para todas as combinações a expressão gênica das hemoglobinas A, B, C, D e a enzima GST. Por fim, 12 espécies distribuídas em Chironomus, Dicrotendipes e Goeldichironomus foram expostas por 48 horas ao malathion e ao propuxur, nesses organismos foi mensurado a atividade das enzimas AChE, EST-? e EST-?. Com a resposta enzimática foi aplicado as métricas K e para detecção de sinal filogenético, juntamente com uma filogenia baseada no COI (citocromo oxidase I), além disso respostas de espécies iguais coletadas em locais diferentes foram comparadas para verificar o efeito da pressão de seleção. Para C. sancticaroli exposta ao sedimentos, todas as enzimas apresentaram alterações em relação ao grupo controle, além de estresse oxidativo e a histologia demonstrou efeitos principalmente no corpo gorduroso visceral. Em C. dilutus houve um aumento no consumo de oxigênio em exposição ao arsênio e aumento na expressão da HbA na exposição ao arsênio, HbB em arsênio e hipóxia, Hb A, D e GST na combinações das duas condições. Nas 13 espécies de Chironomidae expostas a pesticidas, não existe sinal filogenético para a respostas da enzimas, mas para as espécies de Chironomus foi observado uma tendência para as enzimas AChE e EST-?. A pressão de seleção se mostrou o principal direcionador das respostas enzimáticas já que mesmas espécies coletadas em locais diferentes, apresentaram níveis diferenciados de atividade. Larvas de Chironomidae possuem uma considerável plasticidade fisiológica que permite-os sobreviver nesse ambientes desafiadores, mesmo sem mortalidade, alterações foram detectadas demonstrando desequilíbrios da homeostase. Mesmo com a pressão de seleção que esses organismos sofrem no ambiente natural, eles se mantém vivos e resistentes, esse quadro pode refletir em algum custo no fitness das espécies a longo prazo. Palavras-chave: Chironomidae, sedimento, biomarcadores bioquímicos, expressão gênica, biologia comparadaAbstract: Survival is the biggest challenge faced by organisms inhabiting environments constantly degraded by anthropic activities. Several organisms can thrive but they have biological costs of exposure. The aim of the thesis was evaluate the chironomids larvae responses under survival challenges of environmental degradation using biomarkers. First, chronic bioassays were carried out in Chironomus sancticaroli larvae exposed to sediments of 5 rivers and 5 reservoirs from São Paulo State. It was measured in these larvae biomarkers as AChE (Acetylcholinesterase), EST-? (alpha-esterase), EST-? (beta-esterase), GST (Glutathione S-transferase), CAT (Catalase), SOD (Superoxide-dismutase), LPO (lipid peroxidation) and histopathologies. In addition, Chironomus dilutus larvae were exposed in a respirometer for 6 hours to 4 concentrations of arsenic and dissolved oxygen and their combinations resulting in 16 treatments. Beyond oxygen consumption in arsenic exposure, in the combinations were measured gene expression of A, B, C, D hemoglobins and GST enzyme. Finally, 12 species of Chironomus, Dicrotendipes, and Goeldichironomus were exposed for 48 hours to malathion and propoxur pesticides. The activity of AChE, EST-? e EST-? was measured, and in the results was applied K and metrics to phylogenetic signal detection also using a phylogeny based in COI gene (cytochrome oxidase I). The responses from same species collected in different sites were compared to verify selection pressure influence. In C. santicaroli exposed to sediments, all enzymes showed alterations comparing with control group, also was detected oxidative stress and tissues changes in visceral fat body. In C. dilutus there was an increase of oxygen consumption in arsenic exposure, also was observed increase of HbA expression (arsenic exposure), HbB (arsenic and hypoxia) and HbA, D, GST in combinations of both conditions. Throughout of 13 chironomids species exposed to pesticides, there was no phylogenetic signal to enzymes responses, but to Chironomus species there was a trend to AChE and EST-? enzymes. Selection pressure showed the main driver of enzymatic responses due to the fact same species collected in different sites had no similar levels of activity. Chironomidae larvae have a remarkable physiological plasticity that allows them to survive in challenging environments, even mortality being not observed changes were detected demonstrating homeostasis imbalance. In the environment, even suffering with selection pressure, chrinomids are alive and resistants, this status can reflect in some fitness cost of this species in a long-term. Keywords: Chironomidae, sediment, biochemical biomarkers, gene expression, comparative biolog

Morpho-histological characterization of immature of the bioindicator midge Chironomus sancticaroli Strixino and Strixino (Diptera, Chironomidae)

AbstractChironomidae immature are used as bioindicators of sediment quality in aquatic ecosystems and ecotoxicological assays. Histological descriptions for this family are outdated and limited and there are no studies with Neotropical species. The aim of this study was to describe the tissue architecture of several organs of the larva of Chironomus sancticaroli. For the description of the histological pattern, the larvae were fixed in Duboscq solution for insects at 56°C, followed by routine histologic processing, infiltration in paraffin, and the sections were stained with Hematoxylin–Eosin. After examining the slides, the tube digestive, salivary gland, excretory, nervous, endocrine, circulatory, and integumentary systems and fat body were histologically characterized. The histology allows evaluation of cell morphology, and for being not expensive and easily accessible can be routinely used in biomonitoring. In addition, is a useful tool in ecotoxicological assays and allow to evaluate biomarkers at tissue and cell levels

Cuticular damage of Lucilia cuprina larvae exposed to Curcuma longa leaves essential oil and its major compound α-phellandrene

Morphological biomarkers as the histopathological assessment and scanning electron microscopy can be used to establish a diagnosis of structure damage and intoxication of target cells by new biopesticide candidate. In this sense, cuticle damage caused by active substances in larvae exposed to biopesticides can help to elucidate the mode action. Thus, insecticide activity analysis of essential oil of Curcuma longa leaves and its major compound α-phellandrene have proven to be a new biopesticide candidate against third instar larvae (L3) of the Australian blowfly Lucilia cuprina. In this way, groups of 20 L3 were placed on filter paper, impregnated with ranging concentrations (from 0.15 to 2.86 μL/cm2) of C. longa leaves EO and (0.29–1.47 μL/cm2) to α-phellandrene. The extracts were solubilized in ethanol. Progressive darkening in the body of L3, marked reduction of movement, color changes in larval cuticle and dead were observed 6 and 24 h after contact with both extracts

Accelerating the Morphogenetic Cycle of the Viral Vector Aedes aegypti Larvae for Faster Larvicidal Bioassays

Any bioassay to test new chemically synthesized larvicides or phytolarvicides against Culicidae and more harmful mosquito species, such as Aedes aegypti and Aedes albopictus, which specifically transmit dengue, yellow fever, chikungunya viral fevers as well as Zika virus, or Anopheles gambiae, a vector for malaria and philariasis, requires thousands of well-developed larvae, preferably at the fourth instar stage. The natural morphogenetic cycle of Aedes spp., in the field or in the laboratory, may extend to 19 days at room temperature (e.g., 25°C) from the first permanent contact between viable eggs and water and the last stage of larval growth or metamorphosis into flying adults. Thus, accelerated sequential molting is desirable for swifter bioassays of larvicides. We achieved this goal in Aedes aegypti with very limited strategic and low-cost additions to food, such as coconut water, milk or its casein, yeast extract, and to a lesser extent, glycerol. The naturally rich coconut water was excellent for quickly attaining the population of instar IV larvae, the most advanced one before pupation, saving about a week, for subsequent larvicidal bioassays. Diluted milk, as another food source, allowed an even faster final ecdysis and adults are useful for mosquito taxonomical purpose