Left-right asymmetry in Xenopus laevis : functional dissection of leftward flow

Despite their external bilateral symmetry, vertebrates have a conserved left right (LR) asymmetry of their inner organs. For all vertebrates, it is well-known that the asymmetric organogenesis is preceded by the left-sided nodal signaling cascade during embryonic development. A question which has not been settled in detail is how the first asymmetrically directed signal arises, which activates nodal only on the left side. In mice and fish embryos an extracellular leftward fluid flow ? generated by rotating cilia ? was shown to be functionally necessary for gene activation. Recently, this process has also been demonstrated in frog embryos and its mechanic inhibition caused laterality defects. This raised the question if this process is also conserved among vertebrates. The aim of this study was to analyze the mechanism of flow in the frog in the context of the known models. Thereby, its prerequisites and the exact mode of activation of the left-sided genes should be assessed. Finally, general conclusions on the symmetry breakage of vertebrates were to be drawn. Loss of function of axonemal dynein heavy chains inhibited ciliary movement, fluid flow and laterality development of the embryos. By showing that flow was only necessary on the left half of the ciliated epithelium (GRP), definite statements could be made concerning origin, identity and possibility of a transported substance. Moreover, a function for GRP morphogenesis and thus for the generation of flow were proven for the serotonin receptor 3 and the calcium channel Pkd2. These results did not confirm the hypothesis that Pkd2 causes a flow-dependent left-sided calcium signal. Consequently, this contradicted the so-called "2-cilia model" in favor of an early morphogenetic function in frog. In the course of a collaboration it could be shown, that the RNA-binding protein xBic-C has a conserved function for cilia polarization and thus for the flow in both Xenopus and mice. Additionally, up to now, a right-sided nodal inhibitory function has been assigned to the protein coco. However, the exact mechanism was unknown. By specific, combined left- and right-sided loss of function experiments with coco, nodal and the above mentioned components, it could be demonstrated that coco but not nodal is directly dependent on leftward flow. With the flow, coco was downregulated on the left side only and could thus no longer inhibit nodal there. Loss of flow or xBic-C function ? but not that of Pkd2 ? could be rescued by coco inhibition; this revealed a clear hierarchy. Taken together a sequence of conditions could be formulated: Pkd2 and the serotonin receptor 3 are obligatory for the formation of the GRP and correct flow before neurulation. xBic-C also precedes the flow and is required for cilia polarization but seemed also to have a further function. coco is downstream of the fluid flow and is downregulated as its direct consequence on the left side. nodal, in turn, is downstream of this order and is only released on the left side where it can thus act as a putative mediator to transfer the generated signal into the lateral plate mesoderm. These results are discussed in terms of evolutionary origin and conservation.Trotz ihrer äußeren Bilateralsymmetrie weisen Wirbeltiere eine konservierte Links-Rechts (LR)-Asymmetrie der inneren Organe auf. Es ist bekannt, dass bei allen Vertebraten der embryonalen, asymmetrischen Organogenese die linksseitig aktive nodal-Signalkaskade vorangeht. Eine im Detail noch nicht geklärte Frage ist, wie das erste asymmetrisch gerichtete Signal entsteht, welches nodal nur links aktiviert. In Maus- und Fischembryonen wurde ein durch rotierende Cilien erzeugter, linksgerichteter extrazellulärer Flüssigkeitsstrom für die Genaktivierung als funktionell notwendig nachgewiesen. Vor kurzem wurde gezeigt, dass solch ein Prozess auch im Froschembryo stattfindet und dessen mechanische Inhibition Lateralitätsdefekte zur Folge hat. Dadurch stellte sich die Frage, ob dieser Vorgang ebenfalls konserviert ist. Das Ziel dieser Arbeit war es, vor dem Hintergrund bekannter Modelle den genauen Mechanismus des Flüssigkeitsstroms, seine Voraussetzungen und den Modus der genauen Aktivierung der linksseitigen Gene am Froschmodell zu untersuchen. Damit sollten letztlich allgemeine Schlussfolgerungen zum Symmetriebruch der Wirbeltiere gezogen werde. Der Funktionsverlust von axonemalen schweren Dyneinketten führte zur Störung der Cilienbewegung, des Flüssigkeitsstroms und damit zu Lateralitätsproblemen der Embryonen. Es konnte gezeigt werden, dass der Flüssigkeitsstrom nur auf der linken Hälfte des cilierten Epithels (GRP) nötig war, wodurch klare Aussagen über Herkunft, Identität und Möglichkeit einer transportierten Substanz gemacht werden konnten. Weiter wurden für den Serotonin-Rezeptor 3 und den Calciumkanal Pkd2 eine Funktion für die Morphogenese der GRP und damit für die Entstehung des Flüssigkeitsstromes nachgewiesen. Diese Resultate bestätigten nicht die Hypothese, dass Pkd2 ein stromabhängiges linksseitiges Calcium-Signal erzeugt und somit auch nicht das so genannte ?2-Cilien Modell?, sondern favorisiert eine frühe morphogenetische Funktion im Frosch. Für das RNA-Bindeprotein xBic-C konnte im Rahmen einer Kollaboration eine konservierte Funktion für korrekte Cilienpolarität und damit für den Flüssigkeitsstrom in Xenopus und Maus gezeigt werden. Dem nodal-Inhibitor coco wurde bisher eine rechtsseitige Funktion zugeschrieben, der genaue Mechanismus war jedoch unbekannt. Durch gezielte, kombinierte links- und rechtsseitige Funktionsverlust-Experimente mit coco, nodal und den oben genannten Komponenten, konnte gezeigt werden, dass coco aber nicht nodal vom linksgerichteten Flüssigkeitsstrom direkt abhängig ist. Es wird von diesem linksseitig runterreguliert und hemmt dadurch nodal dort nicht mehr. Der Verlust der Flüssigkeitsströmung oder der Funktion von xBic-C, nicht aber von Pkd2 konnten durch coco-Inhibition gerettet werden; dies zeigte eine klare Hierarchie. Zusammengefasst kann damit eine Abfolge von Bedingungen formuliert werden: Pkd2 und der Serotonin-Rezeptor 3 sind zwingend nötig für die Bildung der GRP und einen funktionellen Flüssigkeitsstrom. xBic-C ist diesem ebenfalls vorangestellt und für die Cilienpolarisierung nötig, scheint aber auch noch eine weitere Funktion zu haben. Coco ist dem Flüssigkeitsstrom nachgeschaltet und wird als dessen direkte Konsequenz links herunterreguliert. nodal wiederum ist dieser Rangfolge nachgeschaltet und wird als Vermittler des Signals linksseitig von der Hemmung freigesetzt und kann so als Vermittler für die Weiterleitung des generierten Signals ins Seitenplattenmesoderm fungieren. Die Ergebnisse werden im Kontext des evolutionäre Ursprungs und der Konservierung diskutiert

Left-right asymmetry in Xenopus laevis : functional dissection of leftward flow

Despite their external bilateral symmetry, vertebrates have a conserved left right (LR) asymmetry of their inner organs. For all vertebrates, it is well-known that the asymmetric organogenesis is preceded by the left-sided nodal signaling cascade during embryonic development. A question which has not been settled in detail is how the first asymmetrically directed signal arises, which activates nodal only on the left side. In mice and fish embryos an extracellular leftward fluid flow ? generated by rotating cilia ? was shown to be functionally necessary for gene activation. Recently, this process has also been demonstrated in frog embryos and its mechanic inhibition caused laterality defects. This raised the question if this process is also conserved among vertebrates. The aim of this study was to analyze the mechanism of flow in the frog in the context of the known models. Thereby, its prerequisites and the exact mode of activation of the left-sided genes should be assessed. Finally, general conclusions on the symmetry breakage of vertebrates were to be drawn. Loss of function of axonemal dynein heavy chains inhibited ciliary movement, fluid flow and laterality development of the embryos. By showing that flow was only necessary on the left half of the ciliated epithelium (GRP), definite statements could be made concerning origin, identity and possibility of a transported substance. Moreover, a function for GRP morphogenesis and thus for the generation of flow were proven for the serotonin receptor 3 and the calcium channel Pkd2. These results did not confirm the hypothesis that Pkd2 causes a flow-dependent left-sided calcium signal. Consequently, this contradicted the so-called "2-cilia model" in favor of an early morphogenetic function in frog. In the course of a collaboration it could be shown, that the RNA-binding protein xBic-C has a conserved function for cilia polarization and thus for the flow in both Xenopus and mice. Additionally, up to now, a right-sided nodal inhibitory function has been assigned to the protein coco. However, the exact mechanism was unknown. By specific, combined left- and right-sided loss of function experiments with coco, nodal and the above mentioned components, it could be demonstrated that coco but not nodal is directly dependent on leftward flow. With the flow, coco was downregulated on the left side only and could thus no longer inhibit nodal there. Loss of flow or xBic-C function ? but not that of Pkd2 ? could be rescued by coco inhibition; this revealed a clear hierarchy. Taken together a sequence of conditions could be formulated: Pkd2 and the serotonin receptor 3 are obligatory for the formation of the GRP and correct flow before neurulation. xBic-C also precedes the flow and is required for cilia polarization but seemed also to have a further function. coco is downstream of the fluid flow and is downregulated as its direct consequence on the left side. nodal, in turn, is downstream of this order and is only released on the left side where it can thus act as a putative mediator to transfer the generated signal into the lateral plate mesoderm. These results are discussed in terms of evolutionary origin and conservation.Trotz ihrer äußeren Bilateralsymmetrie weisen Wirbeltiere eine konservierte Links-Rechts (LR)-Asymmetrie der inneren Organe auf. Es ist bekannt, dass bei allen Vertebraten der embryonalen, asymmetrischen Organogenese die linksseitig aktive nodal-Signalkaskade vorangeht. Eine im Detail noch nicht geklärte Frage ist, wie das erste asymmetrisch gerichtete Signal entsteht, welches nodal nur links aktiviert. In Maus- und Fischembryonen wurde ein durch rotierende Cilien erzeugter, linksgerichteter extrazellulärer Flüssigkeitsstrom für die Genaktivierung als funktionell notwendig nachgewiesen. Vor kurzem wurde gezeigt, dass solch ein Prozess auch im Froschembryo stattfindet und dessen mechanische Inhibition Lateralitätsdefekte zur Folge hat. Dadurch stellte sich die Frage, ob dieser Vorgang ebenfalls konserviert ist. Das Ziel dieser Arbeit war es, vor dem Hintergrund bekannter Modelle den genauen Mechanismus des Flüssigkeitsstroms, seine Voraussetzungen und den Modus der genauen Aktivierung der linksseitigen Gene am Froschmodell zu untersuchen. Damit sollten letztlich allgemeine Schlussfolgerungen zum Symmetriebruch der Wirbeltiere gezogen werde. Der Funktionsverlust von axonemalen schweren Dyneinketten führte zur Störung der Cilienbewegung, des Flüssigkeitsstroms und damit zu Lateralitätsproblemen der Embryonen. Es konnte gezeigt werden, dass der Flüssigkeitsstrom nur auf der linken Hälfte des cilierten Epithels (GRP) nötig war, wodurch klare Aussagen über Herkunft, Identität und Möglichkeit einer transportierten Substanz gemacht werden konnten. Weiter wurden für den Serotonin-Rezeptor 3 und den Calciumkanal Pkd2 eine Funktion für die Morphogenese der GRP und damit für die Entstehung des Flüssigkeitsstromes nachgewiesen. Diese Resultate bestätigten nicht die Hypothese, dass Pkd2 ein stromabhängiges linksseitiges Calcium-Signal erzeugt und somit auch nicht das so genannte ?2-Cilien Modell?, sondern favorisiert eine frühe morphogenetische Funktion im Frosch. Für das RNA-Bindeprotein xBic-C konnte im Rahmen einer Kollaboration eine konservierte Funktion für korrekte Cilienpolarität und damit für den Flüssigkeitsstrom in Xenopus und Maus gezeigt werden. Dem nodal-Inhibitor coco wurde bisher eine rechtsseitige Funktion zugeschrieben, der genaue Mechanismus war jedoch unbekannt. Durch gezielte, kombinierte links- und rechtsseitige Funktionsverlust-Experimente mit coco, nodal und den oben genannten Komponenten, konnte gezeigt werden, dass coco aber nicht nodal vom linksgerichteten Flüssigkeitsstrom direkt abhängig ist. Es wird von diesem linksseitig runterreguliert und hemmt dadurch nodal dort nicht mehr. Der Verlust der Flüssigkeitsströmung oder der Funktion von xBic-C, nicht aber von Pkd2 konnten durch coco-Inhibition gerettet werden; dies zeigte eine klare Hierarchie. Zusammengefasst kann damit eine Abfolge von Bedingungen formuliert werden: Pkd2 und der Serotonin-Rezeptor 3 sind zwingend nötig für die Bildung der GRP und einen funktionellen Flüssigkeitsstrom. xBic-C ist diesem ebenfalls vorangestellt und für die Cilienpolarisierung nötig, scheint aber auch noch eine weitere Funktion zu haben. Coco ist dem Flüssigkeitsstrom nachgeschaltet und wird als dessen direkte Konsequenz links herunterreguliert. nodal wiederum ist dieser Rangfolge nachgeschaltet und wird als Vermittler des Signals linksseitig von der Hemmung freigesetzt und kann so als Vermittler für die Weiterleitung des generierten Signals ins Seitenplattenmesoderm fungieren. Die Ergebnisse werden im Kontext des evolutionäre Ursprungs und der Konservierung diskutiert

Bewertungsrisiken bei Störaussendungsmessungen von Prüflingen mit angeschlossenen Leitungen in GTEM-Zellen

In elektrischen Systemen bilden Kabel Koppelpfade für leitungsgebundene und abgestrahlte Störungen. Als Alternative zur zeitaufwendigen Messung in der Absorberhalle nach [2] kann zur kostengünstigen Ermittlung der abgestrahlten Feldstärke für kleine Prüflinge (EUT) die GTEM-Zelle verwendet werden. Allerdings gilt die Norm IEC 61000-4-20 [1] in ihrer derzeitig gültigen Fassung nicht für Prüflinge mit angeschlossenen Kabeln. Die GTEM-Zelle gehört nicht zu den etablierten Messumgebungen. Ein Grund hierfür ist die unterschiedliche Messgröße. Werden in den etablierten Messumgebungen wie OATS oder SAC die Feldstärken gemessen, so wird bei der GTEM-Zelle die Spannung am Zellenport abgegriffen. Die Spannung wird mit Hilfe eines Korrelationsalgorithmus in eine der OATS-Messung äquivalente Feldstärke umgerechnet. Ein weiterer Grund ist der große Prüfling. Als großer Prüfling wird jedes EUT bezeichnet, das entweder zu groß für das Prüfvolumen ist oder ein kleiner Prüfling mit einer oder mehreren Zuleitungen. In diesem Beitrag soll evaluiert werden, ob die GTEM-Zelle trotzdem nützlich ist, um den höchsten Aussendungspegel der internen Störquellen sicher zu erkennen ohne die Korrelationsmethode zu modifizieren. Hierfür wurden sowohl kleine Prüflinge als auch komplexe Prüflinge mit Zuleitungen ausgemessen

ZBTB7A prevents RUNX1-RUNX1T1-dependent clonal expansion of human hematopoietic stem and progenitor cells

ZBTB7A is frequently mutated in acute myeloid leukemia (AML) with t(8;21) translocation. However, the oncogenic collaboration between mutated ZBTB7A and the RUNX1–RUNX1T1 fusion gene in AML t(8;21) remains unclear. Here, we investigate the role of ZBTB7A and its mutations in the context of normal and malignant hematopoiesis. We demonstrate that clinically relevant ZBTB7A mutations in AML t(8;21) lead to loss of function and result in perturbed myeloid differentiation with block of the granulocytic lineage in favor of monocytic commitment. In addition, loss of ZBTB7A increases glycolysis and hence sensitizes leukemic blasts to metabolic inhibition with 2-deoxy-d-glucose. We observed that ectopic expression of wild-type ZBTB7A prevents RUNX1-RUNX1T1-mediated clonal expansion of human CD34+ cells, whereas the outgrowth of progenitors is enabled by ZBTB7A mutation. Finally, ZBTB7A expression in t(8;21) cells lead to a cell cycle arrest that could be mimicked by inhibition of glycolysis. Our findings suggest that loss of ZBTB7A may facilitate the onset of AML t(8;21), and that RUNX1-RUNX1T1-rearranged leukemia might be treated with glycolytic inhibitors

SAMHD1 is a biomarker for cytarabine response and a therapeutic target in acute myeloid leukemia.

The nucleoside analog cytarabine (Ara-C) is an essential component of primary and salvage chemotherapy regimens for acute myeloid leukemia (AML). After cellular uptake, Ara-C is converted into its therapeutically active triphosphate metabolite, Ara-CTP, which exerts antileukemic effects, primarily by inhibiting DNA synthesis in proliferating cells. Currently, a substantial fraction of patients with AML fail to respond effectively to Ara-C therapy, and reliable biomarkers for predicting the therapeutic response to Ara-C are lacking. SAMHD1 is a deoxynucleoside triphosphate (dNTP) triphosphohydrolase that cleaves physiological dNTPs into deoxyribonucleosides and inorganic triphosphate. Although it has been postulated that SAMHD1 sensitizes cancer cells to nucleoside-analog derivatives through the depletion of competing dNTPs, we show here that SAMHD1 reduces Ara-C cytotoxicity in AML cells. Mechanistically, dGTP-activated SAMHD1 hydrolyzes Ara-CTP, which results in a drastic reduction of Ara-CTP in leukemic cells. Loss of SAMHD1 activity-through genetic depletion, mutational inactivation of its triphosphohydrolase activity or proteasomal degradation using specialized, virus-like particles-potentiates the cytotoxicity of Ara-C in AML cells. In mouse models of retroviral AML transplantation, as well as in retrospective analyses of adult patients with AML, the response to Ara-C-containing therapy was inversely correlated with SAMHD1 expression. These results identify SAMHD1 as a potential biomarker for the stratification of patients with AML who might best respond to Ara-C-based therapy and as a target for treating Ara-C-refractory AML

Identification of ZBTB26 as a Novel Risk Factor for Congenital Hypothyroidism

Congenital primary hypothyroidism (CH; OMIM 218700) is characterized by an impaired thyroid development, or dyshormonogenesis, and can lead to intellectual disability and growth retardation if untreated. Most of the children with congenital hypothyroidism present thyroid dysgenesis, a developmental anomaly of the thyroid. Various genes have been associated with thyroid dysgenesis, but all known genes together can only explain a small number of cases. To identify novel genetic causes for congenital hypothyroidism, we performed trio whole-exome sequencing in an affected newborn and his unaffected parents. A predicted damaging de novo missense mutation was identified in the ZBTB26 gene (Zinc Finger A and BTB Domain containing 26). An additional cohort screening of 156 individuals with congenital thyroid dysgenesis identified two additional ZBTB26 gene variants of unknown significance. To study the underlying disease mechanism, morpholino knock-down of zbtb26 in Xenopus laevis was carried out, which demonstrated significantly smaller thyroid anlagen in knock-down animals at tadpole stage. Marker genes expressed in thyroid tissue precursors also indicated a specific reduction in the Xenopus ortholog of human Paired-Box-Protein PAX8, a transcription factor required for thyroid development, which could be rescued by adding zbtb26. Pathway and network analysis indicated network links of ZBTB26 to PAX8 and other genes involved in thyroid genesis and function. GWAS associations of ZBTB26 were found with height. Together, our study added a novel genetic risk factor to the list of genes underlying congenital primary hypothyroidism and provides additional support that de novo mutations, together with inherited variants, might contribute to the genetic susceptibility to CH

Vergleichende Bewertung verschiedener normativer Störemissionsmessungen an einem Elektrofahrzeug

Die Emissionen eines Elektrofahrzeugs wurden nach unterschiedlichen Prüfmethoden untersucht. Es zeigte sich, dass die Emissionen nach Industrienorm über das gesamte Spektrum mit ca. 20 dB höher sind. Es ist zu empfehlen, die Fahrzeuge aus mehreren Richtungen, und nicht nur die Fahrer- und Beifahrerseite zu prüfen, sowie in verschiedenen Antennenhöhen zu messen. Weiterhin wurde der Einfluss des Mess-Setups der KFZ-Norm untersucht, da es in vielen EMV-Messhallen notwendig ist, zusätzliche Messachsen zu verwenden. Es stellte sich heraus, dass die Abweichungen zur Referenzachse nicht gering sind. Um die Ursache dieser Abweichungen näher zu untersuchen, wurden Messungen mit definierten Antennen vorgenommen. Diesen Messergebnissen ist zu entnehmen, dass die Abweichungen durch die Verwendung anderer Messachsen über den gesamten Frequenzbereich hoch waren, so dass einige dieser Messaufbauten ungeeignet für die Störemissionsmessung sind. Abschließend wurden die leitungsgebundenen Störemissionen von dem Elektrofahrzeug untersucht. Neben der normkonformen Emissionsmessung in 10 cm Höhe über dem Boden wurden Messungen mit 40 cm Höhe und 80 cm Höhe durchgeführt. Es ist nur eine geringe Abweichung festzustellen