Unsaturated long-chain free fatty acids are input signals of the Salmonella enterica PhoP/PhoQ regulatory system

The Salmonella enterica serovar Typhimurium PhoP/PhoQ system has largely been studied as a paradigmatic two-component regulatory system not only to dissect structural and functional aspects of signal transduction in bacteria but also to gain knowledge about the versatile devices that have evolved allowing a pathogenic bacterium to adjust to or counteract environmental stressful conditions along its life cycle. Mg2+ limitation, acidic pH, and the presence of cationic antimicrobial peptides have been identified as cues that the sensor protein PhoQ can monitor to reprogram Salmonella gene expression to cope with extra- or intracellular challenging conditions. In this work, we show for the first time that long chain unsaturated free fatty acids (LCUFAs) present in Salmonella growth medium are signals specifically detected by PhoQ. We demonstrate that LCUFAs inhibit PhoQ autokinase activity, turning off the expression of the PhoP-dependent regulon. We also show that LCUFAs exert their action independently of their cellular uptake and metabolic utilization by means of the β-oxidative pathway. Our findings put forth the complexity of input signals that can converge to finely tune the activity of the PhoP/PhoQ system. In addition, they provide a new potential biochemical platform for the development of antibacterial strategies to fight against Salmonella infections.Fil: Viarengo, Gastón. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Sciara, Mariela Ines. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Salazar, Mario Oscar. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas; ArgentinaFil: Kieffer, Pablo M.. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Furlan, Ricardo Luis Eugenio. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas; ArgentinaFil: Garcia Vescovi, Eleonora. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentin

Identificación y caracterización de compuestos antibacterianos a partir de productos naturales o semisintéticos

El sistema de dos componentes PhoP/PhoQ regula numerosos fenotipos de virulencia en Salmonella enterica. La proteína sensora PhoQ alterna entre un estado quinasa y fosfatasa en respuesta a la disponibilidad de Mg2+ en el medio, lo cual define el nivel de fosforilación del regulador de respuesta PhoP, modulando su actividad transcripcional. Este sistema constituye un objetivo estratégico para la búsqueda y desarrollo de compuestos que modulen específicamente su acción, destinados a la prevención y tratamiento de las patologías a las que Salmonella da origen. En este sentido, durante el trabajo de tesis de la Dra. Mariela Sciara se identificó que un extracto metanólico de Lamium amplexicaule era capaz de inhibir específicamente la expresión de genes regulados por el TCS PhoP/PhoQ, y se determinó que las especies responsables de este efecto eran los ácidos grasos insaturados de cadena larga presentes en la muestra. Mediante el uso de AG libres puros de origen comercial, se verificó que LCUFAs reprimían de manera dosis dependiente la expresión de genes regulados por PhoP, pero no afectaban la expresión de genes regulados por otros sistemas de dos componentes en el rango de concentraciones ensayadas. Además, los ácidos grasos saturados no mostraron efecto sobre ninguno de los genes reporteros, indicando especificidad de sustrato y de blanco de acción por parte de los LCUFAs sobre el sistema PhoP/PhoQ. Durante el presente trabajo de tesis, se estableció que, al ser agregados exógenamente al medio de cultivo bacteriano, los LCUFAs inhiben específicamente la capacidad de autofosforilación de la proteína sensora PhoQ en el mecanismo de transducción de la señal, lo que lleva a una disminución en los niveles de PhoP fosforilado y, finalmente, a una represión en la expresión de los genes del regulón phoPQ. Los ácidos grasos son metabolizados por la vía de β-oxidación, pero la integridad de esta ruta metabólica no es necesaria para observar la represión sobre el sistema de dos componentes PhoP/PhoQ, permitiendo concluir que los LCUFAs son las especies responsables de este efecto, y no los productos intermedios o el producto final de esta vía. Por otra parte, también se observó que la expresión de genes regulados por PhoP cuando el ácido graso insaturado era removido del medio de cultivo eran equiparables a los niveles de expresión en ausencia de compuesto, lo que lleva a concluir que el efecto de LCUFAs sobre el TCS es de naturaleza reversible. Además, se determinó que la presencia en simultáneo de dos ácidos grasos insaturados en el medio de crecimiento ejerce un efecto represor que es mayor que el de cada uno cuando se encuentra presente de manera individual. Por último, se ensayaron muestras de bilis fresca de rata que fueron agregadas al medio de cultivo LB, y que también mostraron inhibir de manera específica y dosis-dependiente la expresión del gen reportero regulado por PhoP sin afectar la actividad transcripcional del gen reportero control. Esto nos permite especular que existen compuestos en este fluido que podrían constituir señales fisiológicas para que Salmonella pueda coordinar la expresión de fenotipos de virulencia a través de la regulación de la actividad del sistema de dos componentes PhoP/PhoQ. Dado que no fue posible realizar un análisis más detallado de los componentes presentes en la muestra de bilis fresca, no podemos asegurar que el efecto inhibitorio sea debido a LCUFAs, cationes divalentes o una combinatoria de ambos presente en la muestra, o a otros compuestos que no han sido determinados hasta el momento. Estos resultados permiten concluir que los LCUFAs, sin mediar procesos metabólicos en la célula, actuarían como señales que inhiben la actividad de autofosforilación de la proteína sensora PhoQ, ya sea como ligandos interactuando directamente con la misma, o a través de la modificación de propiedades de la membrana interna bacteriana en la cual se encuentra inserta y que afecten la actividad catalítica de la misma. El hecho de que los ácidos grasos insaturados puedan ser señales que permitan a Salmonella distinguir los diferentes ambientes en los que se encuentra, y de esta manera, en conjunto con otros estímulos, coordinar los procesos para una exitosa invasión del hospedador, nos llevo a estudiar el patrón de expresión génica de cepas de Salmonella Typhimurium crecidas en presencia de C18:2 mediante ensayos de microarreglos. A partir del análisis del conjunto de datos, pudimos identificar varios genes involucrados en un mismo proceso metabólico o celular cuya expresión se encontraba reprimida en presencia de C18:2 en el medio de cultivo de una manera dependiente de PhoP. Tomando algunos de ellos, se realizó un análisis bioinformático que llevó a la identificación de cajas putativas de unión a PhoP sobre genes involucrados en el metabolismo de arginina, glutamato y aspartato, en el metabolismo de poliaminas, y en el mecanismo de sensado de la densidad poblacional (quorum-sensing). Al momento de escritura de este trabajo de tesis, se comenzó con la caracterización del efecto de la mutación en el regulador de respuesta PhoP sobre la actividad transcripcional y sobre los niveles de expresión proteica del gen speB (que codifica para una de las enzimas del metabolismo de espermidina) y del operon lsr (que codifica para el transportador responsable del quorum-sensing bacteriano). Finalmente, se ha notado en ensayos de Western-blot que muestras de células de S. Typhimurium crecidas en presencia de C18:2 que han sido inmunodetectadas con anticuerpos anti-PhoQ presentan bandas adicionales (PhoQ(+) “modificada”) a las observadas en muestras provenientes de células crecidas en medio control (PhoQ(-)), y que las mismas migran a un peso molecular aparente mayor que el correspondiente a la especie “sin modificar” de PhoQ. Se logró expresar en forma heteróloga en Escherichia coli, solubilizar y purificar la proteína recombinante His-PhoQ, tanto a partir de células crecidas en medio de cultivo control como con agregado de C18:2. En esta última condición también se evidenció la presencia de bandas adicionales, a pesar de estar trabajando en otro entorno génico al momento de expresar la proteína. Las fracciones resultantes de la purificación tuvieron una resolución electroforética que permitió escindir las bandas de manera individual para su análisis por espectrometría de masa (MS). Los estudios por MS arrojaron, en conjunto, una cobertura de secuencia de 72% y 60% para las proteínas His-PhoQ “nativa” y His-PhoQ “modificada”, pero no se pudieron identificar péptidos cuya masa detectada fuera diferente a la predicha y que pudiera deberse a la presencia de modificaciones post-traduccionales (PTMs). Tampoco se encontraron péptidos correspondientes a proteínas que posean un peso molecular similar al observado en el desplazamiento electroforético en la especie “modificada”. En base a estos y otros resultados, provenientes de tratamiento con agentes reductores, o de separación de las muestras en PAGE-SDS en presencia de urea 6M, favorecemos la hipótesis de que se trata de una PTMs que ocurre sobre la estructura del sensor PhoQ. Por otro lado, mediante el análisis del perfil de inmunodetección de muestras de cepas expresando la proteína quimérica ZhoQ crecidas en C18:2, se logró acotar la región en la proteína PhoQ donde se localizaría la modificación al extremo C-terminal citoplásmico de la misma. Más aún, por comparación entre versiones truncadas de PhoQ, observamos que el anclaje a la membrana de este dominio citoplásmico es condición necesaria para que la PTMs se produzca. Por último, se ha comenzado la caracterización del efecto de nuevos compuestos obtenidos a partir de extractos naturales sobre el sistema de dos componentes PhoP/PhoQ, pero los resultados son muy preliminares por lo que no han sido incluidos en este trabajo de tesis.Fil: Viarengo, Gastón. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET); Argentina

A Thin-layer Chromatography Autographic Method for the Detection of Inhibitors of the Salmonella PhoP-PhoQ Regulatory System

Introduction The PhoP–PhoQ system from Salmonella enterica serovar Typhimurium controls the expression of factors that are critical for the bacterial entry into host cells and the bacterial intramacrophage survival. Therefore it constitutes an interesting target to search for compounds that would control Salmonella virulence. Localisation of such compounds in complex matrixes could be facilitated by thin-layer chromatography (TLC) bioautography. Objective To develop a TLC bioautography to detect inhibitors of the PhoP–PhoQ regulatory system in complex matrixes. Methods The TLC plates were covered by a staining solution containing agar, Luria-Bertani medium, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal), kanamycin and a S. typhimurium strain that harbours a reporter transcriptional lacZ-fusion to an archetypal PhoP-activated gene virK. After solidification, the plate was incubated at 37°C for 16 h. Results A bioautographic assay suitable for the localisation of inhibitors of the PhoP–PhoQ system activity in S. enterica serovar Typhimurium present in a complex matrix is described. The assay was used to analyse a series of hydrolysed extracts prepared by alkaline treatment of crude plant extracts. Bioassay-guided analysis of the fractions by NMR spectroscopy and MS led to the identification of linolenic and linoleic acids as inhibitory input signals of the PhoP–PhoQ system. Conclusion A practical tool is introduced that facilitates detection of inhibitors of the Salmonella PhoP–PhoQ regulatory system. The assay convenience is illustrated with the identification of the first naturally occurring organic compounds that down-regulate a PhoP–PhoQ regulatory system from a hydrolysed extract.Fil: Salazar, Mario Oscar. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas; ArgentinaFil: Viarengo, Gastón. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Sciara, Mariela Ines. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Kieffer, Pablo M.. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Garcia Vescovi, Eleonora. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Furlan, Ricardo Luis Eugenio. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas; Argentin

Soybean hulls, an alternative source of bioactive compounds: Combining pyrolysis with bioguided fractionation

The trend for material and energy recovery from residues along with the need to reduce greenhouse gases has led to an increased interest in the thermal exploitation of biomass and/or their wastes. Due to the enormous quantity generated every year, agro-industrial byproducts have an attractive potential to be recycled. One way to do this is by means of pyrolysis, a thermal decomposition of high molecular weight polymers into simpler compounds. In this study, we applied an autographic assay to analyze the biological effect of bio-oils produced by pyrolysis of soybean hulls. The discovery of a compound with antimicrobial activity validated this novel approach as a tool for the generation of bioactive compounds.Fil: Giri, German Francisco. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Química Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Química Rosario; ArgentinaFil: Viarengo, Gastón. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Furlan, Ricardo Luis Eugenio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Investigaciones para el Descubrimiento de Fármacos de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Instituto de Investigaciones para el Descubrimiento de Fármacos de Rosario; ArgentinaFil: Suarez, Alejandra Graciela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Química Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Química Rosario; ArgentinaFil: Garcia Vescovi, Eleonora. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Spanevello, Rolando Angel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Química Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Química Rosario; Argentin

Viral Metagenomic Data Analyses of Five New World Bat Species from Argentina: Identification of 35 Novel DNA Viruses

Bats are natural reservoirs of a variety of zoonotic viruses, many of which cause severe human diseases. Characterizing viruses of bats inhabiting different geographical regions is important for understanding their viral diversity and for detecting viral spillovers between animal species. Herein, the diversity of DNA viruses of five arthropodophagous bat species from Argentina was investigated using metagenomics. Fecal samples of 29 individuals from five species (Tadarida brasiliensis, Molossus molossus, Eumops bonariensis, Eumops patagonicus, and Eptesicus diminutus) living at two different geographical locations, were investigated. Enriched viral DNA was sequenced using Illumina MiSeq, and the reads were trimmed and filtered using several bioinformatic approaches. The resulting nucleotide sequences were subjected to viral taxonomic classification. In total, 4,520,370 read pairs were sequestered by sequencing, and 21.1% of them mapped to viral taxa. Circoviridae and Genomoviridae were the most prevalent among vertebrate viral families in all bat species included in this study. Samples from the T. brasiliensis colony exhibited lower viral diversity than samples from other species of New World bats. We characterized 35 complete genome sequences of novel viruses. These findings provide new insights into the global diversity of bat viruses in poorly studied species, contributing to prevention of emerging zoonotic diseases and to conservation policies for endangered species.Fil: Bolatti, Elisa María. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET). Grupo Virología Humana; Argentina.Fil: Bolatti, Elisa María. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Área Virología; Argentina.Fil: Viarengo, Gastón. Centro Científico Tecnológico CONICET Rosario. DETx MOL S.A; Argentina.Fil: Zorec, Tomaž M. University of Ljubljana. Faculty of Medicine. Institute of Microbiology and Immunology; Slovenia.Fil: Cerri, Agustina. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET). Grupo Virología Humana; Argentina.Fil: Montani, María E. Museo Provincial de Ciencias Naturales “Dr. Ángel Gallardo”; Argentina.Fil: Montani, María E. Miguel Lillo 251; Argentina.Fil: Montani, María E. Universidad Nacional de Tucumán. Facultad de Ciencias Naturales e Instituto Miguel Lillo. Instituto Programa de Investigaciones de Biodiversidad Argentina (PIDBA); Argentina.Fil: Hošnjak, Lea. University of Ljubljana. Faculty of Medicine. Institute of Microbiology and Immunology; Slovenia.Fil: Casal, Pablo E. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Área Virología; Argentina.Fil: Bortolotto, Eugenia. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Área Estadística y Procesamiento de Datos; Argentina.Fil: Di Domenica, Violeta. Miguel Lillo 251; Argentina.Fil: Chouhy, Diego. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET). Grupo Virología Humana; Argentina.Fil: Chouhy, Diego. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Área Virología; Argentina.Fil: Chouhy, Diego. Centro Científico Tecnológico CONICET Rosario. DETx MOL S.A; Argentina.Fil: Allasia, María Belén. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Área Estadística y Procesamiento de Datos; Argentina.Fil: Barquez, Rubén M. Miguel Lillo 251; Argentina.Fil: Barquez, Rubén M. Universidad Nacional de Tucumán. Facultad de Ciencias Naturales e Instituto Miguel Lillo. Instituto Programa de Investigaciones de Biodiversidad Argentina (PIDBA); Argentina.Fil: Poljak, Mario. University of Ljubljana. Faculty of Medicine. Institute of Microbiology and Immunology; Slovenia.Fil: Giri, Adriana Angélica. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET). Grupo Virología Humana; Argentina.Fil: Giri, Adriana Angélica. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Área Virología; Argentina

A preliminary study of the virome of the South American free-tailed bats (Tadarida brasiliensis) and identification of two novel mammalian viruses

Bats provide important ecosystem services as pollinators, seed dispersers, and/or insect controllers, but they have also been found harboring different viruses with zoonotic potential. Virome studies in bats distributed in Asia, Africa, Europe, and North America have increased dramatically over the past decade, whereas information on viruses infecting South American species is scarce. We explored the virome of Tadarida brasiliensis, an insectivorous New World bat species inhabiting a maternity colony in Rosario (Argentina), by a metagenomic approach. The analysis of five pooled oral/anal swab samples indicated the presence of 43 different taxonomic viral families infecting a wide range of hosts. By conventional nucleic acid detection techniques and/or bioinformatics approaches, the genomes of two novel viruses were completely covered clustering into the Papillomaviridae (Tadarida brasiliensis papillomavirus type 1, TbraPV1) and Genomoviridae (Tadarida brasiliensis gemykibivirus 1, TbGkyV1) families. TbraPV1 is the first papillomavirus type identified in this host and the prototype of a novel genus. TbGkyV1 is the first genomovirus reported in New World bats and constitutes a new species within the genus Gemykibivirus. Our findings extend the knowledge about oral/anal viromes of a South American bat species and contribute to understand the evolution and genetic diversity of the novel characterized viruses