Caractérisation structurale et fonctionnelle de SpNox, une NADPH oxydase bactérienne

As specialized reactive oxygen species (ROS) producers, the involvement of the NADPH oxidase (NOX) enzymes extends to many crucial physiological processes. Thus, a NOX misregulation can lead to a wide range of severe pathologies including atherosclerosis, hypertension, diabetic nephropathy, lung fibrosis, cancer, or neurodegenerative diseases giving this membrane protein a strong therapeutic interest.Despite the recent success in finding prokaryotic NOX homologs enabling the production of such proteins in quantity compatible with mechanistic studies, thus furnishing good models for both functional and structural studies, all the attempts to obtain a NOX structure at high resolution always remained abortive.Thus, using an interdisciplinary approach, this project aims to overcome the challenges of this membrane protein crystallization therefore increasing diffraction of the Streptococcus pneumoniae NOX homolog (SpNox) crystals and allowing to solve the first structure of a full length NOX homolog at atomic level, hampered by the presence of large hydrophobic zones contacts related to the inherent function of transmembrane electron transfer performed by this protein family and that can prevent the formation of crystal.Using a systematic approach involving both a salt and pH screening by the NanoDSF technic, the optimal conditions for detergent and buffer composition in which the enzyme combines significant activity associated with high thermostability has been identified therefore enabling to preserve the integrity of the protein in order to promote the quality of the crystals obtained.En tant qu’enzymes spécialisées dans la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), le rôle des NADPH oxydases (NOX) s’étend à de nombreux processus physiologiques majeurs, et la dérégulation de celles-ci peut conduire à une grande variété de pathologies sévères, telles que le diabète ou les maladies cardiovasculaires et neurodégénératives, constituant ainsi une cible primordiale pour le développement de solutions thérapeutiques spécifiquement adaptées. Malgré la découverte récente d’homologues procaryotes de NOX, facilitant la production de ces protéines en quantités compatibles pour les études mécanistiques, et constituant ainsi des modèles favorisant l’étude fonctionnelle et structurale de la famille des NADPH oxydases, la résolution d’une structure haute résolution sous forme entière est toujours demeurée sans solution.Ainsi, à travers l’utilisation d’une approche interdisciplinaire, ce projet a pour but de relever les enjeux majeurs associés à l’obtention de cristaux dont la qualité de diffraction permettrait la résolution de la première structure d’un homologue de NADPH oxydase sous forme entière issu de Streptococcus pneumoniae (SpNox), complexifiée par la présence de larges zones hydrophobes intrinsèques au rôle de transfert d’électrons à travers les membranes de ces protéines, et pouvant altérer la formation et l’intégrité des contacts cristallins.Des conditions optimales de détergents et de tampons au sein de laquelle l’enzyme combine une importante activité associée à une haute thermostabilité ont été identifiées par criblage systématique des conditions de sels et pH pour la purification de l’enzyme et ainsi optimiser la préservation de l’intégrité de la protéine afin de favoriser la qualité des cristaux obtenus. De plus, à travers l’implémentation d’étapes conjointes de criblages ainsi que d’affinements automatiques et manuels extensifs, un effort intense a ainsi été initié afin d’optimiser le processus de cristallogenèse et des avancées majeures ont pu être réalisées concernant la cristallisation de SpNox permettant d’améliorer la diffraction des cristaux initiaux de 11Å à 4.3Å.En parallèle, une caractérisation basse résolution, réalisée par diffusion des neutrons aux petits angles, a permis de déterminer une enveloppe globale de la protéine. Le volume de cette enveloppe, plus large que le modèle d’homologie de la protéine sous forme entière reconstituée par l’ancrage des deux domaines modélisés indépendamment, suggère l’existence d’une flexibilité importante de SpNox dans la région charnière entre les domaines TM et DH, fournissant ainsi des informations essentielles et apportant une explication aux difficultés rencontrées pour abaisser la limite de résolution des cristaux.Afin de s‘affranchir de la flexibilité liée à la présence de deux domaines structuralement indépendants au sein de la protéine, une stratégie complémentaire, impliquant la caractérisation structurale de chacun des domaines dissociés de SpNox a été initiée en caractérisant indépendamment avec succès les domaines transmembranaire (TM) et déshydrogénase (DH) de SpNox. Des développements considérables ont été réalisés grâce à l’obtention de cristaux du domaine déshydrogénase, dont la qualité a permis la collecte de données selon des limites de diffraction atteignant 1.8Å permettant ainsi d’accéder à des informations à une résolution atomique, autorisant la visualisation de détails structuraux au sein de ce domaine, qui, en association avec le modèle d’homologie du TM obtenu par une approche bioinformatique, peut servir à guider certaines études fonctionnelles

Structural and functionnal studies of SpNox, a prokaryotic NADPH oxidase

En tant qu’enzymes spécialisées dans la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), le rôle des NADPH oxydases (NOX) s’étend à de nombreux processus physiologiques majeurs, et la dérégulation de celles-ci peut conduire à une grande variété de pathologies sévères, telles que le diabète ou les maladies cardiovasculaires et neurodégénératives, constituant ainsi une cible primordiale pour le développement de solutions thérapeutiques spécifiquement adaptées. Malgré la découverte récente d’homologues procaryotes de NOX, facilitant la production de ces protéines en quantités compatibles pour les études mécanistiques, et constituant ainsi des modèles favorisant l’étude fonctionnelle et structurale de la famille des NADPH oxydases, la résolution d’une structure haute résolution sous forme entière est toujours demeurée sans solution.Ainsi, à travers l’utilisation d’une approche interdisciplinaire, ce projet a pour but de relever les enjeux majeurs associés à l’obtention de cristaux dont la qualité de diffraction permettrait la résolution de la première structure d’un homologue de NADPH oxydase sous forme entière issu de Streptococcus pneumoniae (SpNox), complexifiée par la présence de larges zones hydrophobes intrinsèques au rôle de transfert d’électrons à travers les membranes de ces protéines, et pouvant altérer la formation et l’intégrité des contacts cristallins.Des conditions optimales de détergents et de tampons au sein de laquelle l’enzyme combine une importante activité associée à une haute thermostabilité ont été identifiées par criblage systématique des conditions de sels et pH pour la purification de l’enzyme et ainsi optimiser la préservation de l’intégrité de la protéine afin de favoriser la qualité des cristaux obtenus. De plus, à travers l’implémentation d’étapes conjointes de criblages ainsi que d’affinements automatiques et manuels extensifs, un effort intense a ainsi été initié afin d’optimiser le processus de cristallogenèse et des avancées majeures ont pu être réalisées concernant la cristallisation de SpNox permettant d’améliorer la diffraction des cristaux initiaux de 11Å à 4.3Å.En parallèle, une caractérisation basse résolution, réalisée par diffusion des neutrons aux petits angles, a permis de déterminer une enveloppe globale de la protéine. Le volume de cette enveloppe, plus large que le modèle d’homologie de la protéine sous forme entière reconstituée par l’ancrage des deux domaines modélisés indépendamment, suggère l’existence d’une flexibilité importante de SpNox dans la région charnière entre les domaines TM et DH, fournissant ainsi des informations essentielles et apportant une explication aux difficultés rencontrées pour abaisser la limite de résolution des cristaux.Afin de s‘affranchir de la flexibilité liée à la présence de deux domaines structuralement indépendants au sein de la protéine, une stratégie complémentaire, impliquant la caractérisation structurale de chacun des domaines dissociés de SpNox a été initiée en caractérisant indépendamment avec succès les domaines transmembranaire (TM) et déshydrogénase (DH) de SpNox. Des développements considérables ont été réalisés grâce à l’obtention de cristaux du domaine déshydrogénase, dont la qualité a permis la collecte de données selon des limites de diffraction atteignant 1.8Å permettant ainsi d’accéder à des informations à une résolution atomique, autorisant la visualisation de détails structuraux au sein de ce domaine, qui, en association avec le modèle d’homologie du TM obtenu par une approche bioinformatique, peut servir à guider certaines études fonctionnelles.As specialized reactive oxygen species (ROS) producers, the involvement of the NADPH oxidase (NOX) enzymes extends to many crucial physiological processes. Thus, a NOX misregulation can lead to a wide range of severe pathologies including atherosclerosis, hypertension, diabetic nephropathy, lung fibrosis, cancer, or neurodegenerative diseases giving this membrane protein a strong therapeutic interest.Despite the recent success in finding prokaryotic NOX homologs enabling the production of such proteins in quantity compatible with mechanistic studies, thus furnishing good models for both functional and structural studies, all the attempts to obtain a NOX structure at high resolution always remained abortive.Thus, using an interdisciplinary approach, this project aims to overcome the challenges of this membrane protein crystallization therefore increasing diffraction of the Streptococcus pneumoniae NOX homolog (SpNox) crystals and allowing to solve the first structure of a full length NOX homolog at atomic level, hampered by the presence of large hydrophobic zones contacts related to the inherent function of transmembrane electron transfer performed by this protein family and that can prevent the formation of crystal.Using a systematic approach involving both a salt and pH screening by the NanoDSF technic, the optimal conditions for detergent and buffer composition in which the enzyme combines significant activity associated with high thermostability has been identified therefore enabling to preserve the integrity of the protein in order to promote the quality of the crystals obtained

NADPH Oxidases (NOX): An Overview from Discovery, Molecular Mechanisms to Physiology and Pathology

The reactive oxygen species (ROS)-producing enzyme NADPH oxidase (NOX) was first identified in the membrane of phagocytic cells. For many years, its only known role was in immune defense, where its ROS production leads to the destruction of pathogens by the immune cells. NOX from phagocytes catalyzes, via one-electron trans-membrane transfer to molecular oxygen, the production of the superoxide anion. Over the years, six human homologs of the catalytic subunit of the phagocyte NADPH oxidase were found: NOX1, NOX3, NOX4, NOX5, DUOX1, and DUOX2. Together with the NOX2/gp91 component present in the phagocyte NADPH oxidase assembly itself, the homologs are now referred to as the NOX family of NADPH oxidases. NOX are complex multidomain proteins with varying requirements for assembly with combinations of other proteins for activity. The recent structural insights acquired on both prokaryotic and eukaryotic NOX open new perspectives for the understanding of the molecular mechanisms inherent to NOX regulation and ROS production (superoxide or hydrogen peroxide). This new structural information will certainly inform new investigations of human disease. As specialized ROS producers, NOX enzymes participate in numerous crucial physiological processes, including host defense, the post-translational processing of proteins, cellular signaling, regulation of gene expression, and cell differentiation. These diversities of physiological context will be discussed in this review. We also discuss NOX misregulation, which can contribute to a wide range of severe pathologies, such as atherosclerosis, hypertension, diabetic nephropathy, lung fibrosis, cancer, or neurodegenerative diseases, giving this family of membrane proteins a strong therapeutic interest

X-ray structure and enzymatic study of a bacterial NADPH oxidase highlight the activation mechanism of eukaryotic NOX

International audienceNADPH oxidases (NOX) are transmembrane proteins, widely spread in eukaryotes and prokaryotes, that produce reactive oxygen species (ROS). Eukaryotes use the ROS products for innate immune defense and signaling in critical (patho)physiological processes. Despite the recent structures of human NOX isoforms, the activation of electron transfer remains incompletely understood. SpNOX, a homolog from Streptococcus pneumoniae , can serves as a robust model for exploring electron transfers in the NOX family thanks to its constitutive activity. Crystal structures of SpNOX full-length and dehydrogenase (DH) domain constructs are revealed here. The isolated DH domain acts as a flavin reductase, and both constructs use either NADPH or NADH as substrate. Our findings suggest that hydride transfer from NAD(P)H to FAD is the rate-limiting step in electron transfer. We identify significance of F397 in nicotinamide access to flavin isoalloxazine and confirm flavin binding contributions from both DH and Transmembrane (TM) domains. Comparison with related enzymes suggests that distal access to heme may influence the final electron acceptor, while the relative position of DH and TM does not necessarily correlate with activity, contrary to previous suggestions. It rather suggests requirement of an internal rearrangement, within the DH domain, to switch from a resting to an active state. Thus, SpNOX appears to be a good model of active NOX2, which allows us to propose an explanation for NOX2’s requirement for activation

Interdomain Flexibility within NADPH Oxidase Suggested by SANS Using LMNG Stealth Carrier

Small angle neutron scattering (SANS) provides a method to obtain important low-resolution information for integral membrane proteins (IMPs), challenging targets for structural determination. Specific deuteration furnishes a stealth carrier for the solubilized IMP. We used SANS to determine a structural envelope of SpNOX, the Streptococcus pneumoniae NADPH oxidase (NOX), a prokaryotic model system for exploring structure and function of eukaryotic NOXes. SpNOX was solubilized in the detergent lauryl maltose neopentyl glycol, which provides optimal SpNOX stability and activity. Using deuterated solvent and protein, the lauryl maltose neopentyl glycol was experimentally undetected in SANS. This affords a cost-effective SANS approach for obtaining novel structural information on IMPs. Combining SANS data with molecular modeling provided a first, to our knowledge, structural characterization of an entire NOX enzyme. It revealed a distinctly less compact structure than that predicted from the docking of homologous crystal structures of the separate transmembrane and dehydrogenase domains, consistent with a flexible linker connecting the two domains