A foszfatidilinozitol 4-kináz PI4K230 izoformájának szerepe a központi idegrendszerben: szubcelluláris lokalizációjának és SH-csoportjainak jelentősége fiziológiás és kóros körülmények között = Role of phosphatidylinositol 4-kinase PI4K230 in the CNS: significance of its subcellular localization and SH groups under physiological conditions

Immunfluorescenciás eljárással kimutattuk, hogy a foszfatidilinozitol 4-kináz PI4K230 izoformája, más izoformáktól eltérően, patkányagy neuronális sejtjeiben és különféle neurális és nem neurális sejtvonalakban a citoplazmán kívűl a nukleoluszban is előfordul, ahol a "dense fibrillar component" szerkezetének kialakitásában és funkcióiban játszhat szerepet. A PI4K230 immunreaktivitás a nukleolusz degradációját okozó egyes antitumor ágensek hatására a sejtmagon belül diszpergálódik, ami alkalmassá teheti ezen ágensek hatékonyságának tesztelésére. A PI4K230 nukleáris transzportjában egy "monopartite", nukleoláris lokalizációjában egy "bipartite" nukleáris lokalizációs szignál (NLS) szerepét valószínűsítettük. Maleimidek a PI4K230-at méretüktől függő módon a cAMP-függő proteinkinázhoz hasonlóan inaktiválják, feltehetően az ATP-kötődés sztérikus gátlását okozva és alátámasztva a két enzim katalitikus centrumának hasonlóságát. A PI4K230 azonban eltérően a PKA-tól olyan SH-csoportokat is tartalmaz, amelyek a Cys-X-Cys szekvenciával specifikusan reagáló fenil arzén (III)-oxid (PAO) inaktíváló hatása iránt igen érzékenyek. | Immunofluorescent detection of PI4K230 in rat brain neuronal cells and several neural and non neural cell lines revealed the unique nucleolar occurrence of this phosphatidylinositol 4-kinase isoform, in addition to its presence in the cytoplasm, suggesting its role in the structural organization and function of the "dense fibrillar component". The dispersion within the nucleus of nucleolar PI4K230 immunoreactivity can be elicited by several antitumor agents may therefore serve for testing the efficiency of these agents. We have ascertained the role of a monopartite and a bipartite nuclear localization signal (NLS) in the amino acid sequence of PI4K230 for nuclear transport and nucleolar localization, respectively. Maleimides inactivate PI4K230 in a size-dependent manner, similarly to cAMP-dependent protein kinase (PKA), suggesting sterical inhibition of ATP-binding and supporting the structural similarity of their catalytic domains. However, PI4K230 differs from PKA in its characteristic high sensitivity to inactivation by phenylarsinoxide (PAO), an SH-reagent against the Cys-X-Cys sequence

AccPbFRET: An ImageJ plugin for semi-automatic, fully corrected analysis of acceptor photobleaching FRET images

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>The acceptor photobleaching fluorescence resonance energy transfer (FRET) method is widely used for monitoring molecular interactions in cells. This method of FRET, while among those with the simplest mathematics, is robust, self-controlled and independent of fluorophore amounts and ratios.</p> <p>Results</p> <p>AccPbFRET is a user-friendly, efficient ImageJ plugin which allows fully corrected, pixel-wise calculation and detailed, ROI (region of interest)-based analysis of FRET efficiencies in microscopic images. Furthermore, automatic registration and semi-automatic analysis of large image sets is provided, which are not available in any existing FRET evaluation software.</p> <p>Conclusion</p> <p>Despite of the widespread applicability of the acceptor photobleaching FRET technique, this is the first paper where all possible sources of major errors of the measurement and analysis are considered, and AccPbFRET is the only program which provides the complete suite of corrections – for registering image pairs, for unwanted photobleaching of the donor, for cross-talk of the acceptor and/or its photoproduct to the donor channel and for partial photobleaching of the acceptor. The program efficiently speeds up the analysis of large image sets even for novice users and is freely available.</p

ErbB Receptor tirozinkinázok molekuláris interakciói, mint potenciális terápiás célpontok = Molecular interactions of ErbB receptor tyrosine kinases as potential therapy targets

Az ErbB2 célpontú trastuzumab (TR) fő in vivo hatása feltehetőleg a antitest mediált citotoxicitás (ADDC), melyen keresztül a TR csökkenti a keringő és disszeminált daganatsejtek számát akkor is, amikor a primer daganat már TR rezisztens: fejletlen EC matrixú daganatsejtek és kisebb csoportjaik még hozzáférhetők NK sejtek számára, amikor azok nagyobb tömegű daganattal szemben már nem hatékonyak, ami a korai TR terápia fontosságára, és a primer tumor rezisztenciája mellett is elérhető metasztázis gátlásra hívja fel a figyelmet. A TR rezisztens emlőtumorok terápiára alkalmasak a HSP-gátlók is ErbB2-dimerizáló és leszabályozó, apoptótikus hatásuk alapján. Cisztein proteináz inhibitor kombinálása fotodinámiás kezeléssel in vivo szinergisztikus VEGF szint csökkenést, neovascularizáció gátlást és tumor nekrózist okoz. Új fejlesztésű mikroszkópos FRET módszerekkel és fluoreszcencia korrelációs spektroszkópiával jellemeztük az ErbB2 EGF-ErbB1 általi transzaktivációját, mely lipidtutaj-függő, dinamikus aggregáción és recirkuláción alapszik. Antikorrelációt figyeltünk meg a b1-integrin/ErB2 heteroasszociáció, és az ErbB2 homoasszociáció között emlő és gyomorkarcinómákban, mely csökkentheti a TR által keresztköthető és leszabályozható ErbB2 dimereket és ezért TR rezisztenciát okozhat. Hasonló kölcsönhatás a b1-integrin és ErbB1 között glioblasztóma sejteken fokozott Akt aktiválódáshoz, és klinikai mintákból is igazoltan a magas grádusú glia tumorok fokozott sugárrezisztenciájához vezet. | Trastuzumab (TR) targeting ErbB2 exhibits its in vivo effect mainly through antibody mediated cytotoxicity (ADDC) which effectively fights circulating and disseminated tumor cells even when the primary tumor is already trastuzumab resistant, possibly owed to better access of NK cells to single cells or small clusters without well developed extracellular matrix, which calls the attention to starting TR therapy early and to continue it to preclude metastasis upon the primary tumor reaching resistance. TR resistant tumors can also be treated ith HSP inhibitors that dimerize and downregulate ErbB2 and cause apoptosis. Cistein protease inhibitor combined with PDT in vivo synergistically decreases VEGF, neovascularization and causes tumor necrosis. Newly developed FRET methods and program as well as fluorescence correlation spectroscopy showed ErbB2 being transactivated and dynamically aggregated and recycled in a lipid raft dependent manner by EGF-bound ErbB1 serving as physiological signal input antennae. These innovative methods also revealed anticorrelation between b1-integrin/ErB2 heteroassociation and ErbB2 homoassociation in breast and gastric tumors, a competition for association partners which can decrease ErbB2 dimers downregulatable by TR and thus can cause TR resistance. A similar interaction between b1-integrin and ErbB1 in glioblastoma can lead to increased Akt signalling and radiation resistance of higher grade astrocytomas also verifiable in clinical samples

A Small Number of HER2 Redirected CAR T Cells Significantly Improves Immune Response of Adoptively Transferred Mouse Lymphocytes against Human Breast Cancer Xenografts

L

Apoptózis, fagocitózis és a gyulladás kialakulásának megakadályozása = Apoptosis, phagocytosis and prevention of inflammation

Az elhalt sejteket a környező makrofágok ismerik fel és takarítják el. Az apoptózis kutatása eddig a két folyamatot egymást követő, de egymástól független biológiai eseménynek tekintette. Csoportunk utóbbi években folytatott kutatómunkája azonban rámutatott arra, hogy az elhaló sejt és az őt eltakarító makrofágok között folyamatos párbeszéd zajlik, ami összehangolja az apoptózis és a fagocitózis folyamatát, és meggátolja gyulladás kialakulását. Kísérleteinkben a tímuszt mint modell szervet vizsgáljuk, mert itt folyamatosan nagymértékű sejtelhalás zajlik. Kimutattuk, hogy az elhaló sejteket felvevő makrofágok adenozint és egy új retinoidot termelnek a fagocitózis mértékének függvényében. Az adenozin meggátolja a makrofágok gyulladás indító képességét, míg a retinoid fokozza fagocitáló képességüket. Mind a retinoid termelődést, mind az adenozinra válaszoló receptor mennyiségének fokozódását a felvett apoptótikus sejteket lipid tartalmuk alapján érzékelő lipid érzékeny receptorok indítják el. Mind az adenozin, mind a retinoid elősegíti a hibás timociták elhalását. Munkánk azonosított néhány molekuláris target pontot, ahol a fagocitózis folyamata befolyásolható lehet olyan gyulladásos betegségekben, ahol ennek zavara hozzájárul a betegség pathomechanizmusának kialakításához. Ugyanakkor felveti, hogy az új retinoidoknak a gyulladási program szabályozásában is szerepük lehet, hiszen abban is folyamatosan zajlik a gyulladásban elhalt sejtek fagocitózisa. | Apoptotic cells are recognized and removed by neighbouring macrophages. So far he apoptosis research field looked at these biological processes as two subsequent but independent events. Research carried out by our laboratory during the past years has, however, revealed a continuous crosstalk between macrophages and apoptotic cells, which harmonises the rate of apoptosis and phagocytosis and prevents inflammation. We study thymus as a model organ, since it is characterized by a constantly high rate of apoptosis and phagocytosis. We found that macrophages engulfing apoptotic cells produce adenosine and a novel retinoid and their amount is related to the phagocytic rate. Adenosine prevents proinflammatory cytokine formation, while the retinoid enhances phagocytic capacity of macrophages. Both the retinoid production and the expression of the adenosine receptor are under the control of lipid sensing receptors that sense the number of apoptotic cells digested by their lipid content. Both the retinoid and adenosine promotes the death of those thymocytes whose T cell receptor is improper. Our work identified several target points at which phagocytosis can be affected in those autoimmune diseases in which the improper phagocytosis play a role in the pathomechanism of the disease. In addition we propose that retinoids might have a role in the regulation of inflammation as well, since cells died during inflammation are also taken up by phagocytosis

Trastuzumab derived HER2-specific CARs for the treatment of trastuzumab-resistant breast cancer: CAR T cells penetrate and eradicate tumors that are not accessible to antibodies

HER2-targeted monoclonal antibodies improve the outcome for advanced breast cancer patients; however, resistance to therapy is still frequent. Epitope masking and steric hindrance to antibody binding through matrix components are thought to be the major mechanism. We asked whether tumors resistant to trastuzumab can still be eliminated by CAR T cells redirected by the same antibody domain. While saturating doses of trastuzumab in the presence of CD16.176V.NK-92 effector cells and trastuzumab derived CAR T cells equally well recognized and killed HER2-positive tumor cells in a monolayer, only CAR T cells penetrated into the core region of tumor spheroids and exhibited cytotoxic activity in vitro, whereas antibodies failed. In NSG mice treatment with trastuzumab and CD16.176V.NK-92 cells only transiently retarded tumor growth but did not induce regression of clinically trastuzumab-resistant breast cancer xenografts. In contrast, one dose of HER2-specific CAR T cells eradicated established tumors resulting in long-term survival. Data indicate that CAR T cells can successfully combat antibody resistant tumors by targeting the same epitope suggesting that CAR T cells can penetrate the tumor matrix which is a barrier for antibodies

EGF Receptor Stalls upon Activation as Evidenced by Complementary Fluorescence Correlation Spectroscopy and Fluorescence Recovery after Photobleaching Measurements

LBK