A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit

Perivascular pericytes are key regulators of the blood–brain barrier, vascular development, and cerebral blood flow. Deciphering pericyte roles in health and disease requires cellular tracking; yet, pericyte identification remains challenging. A previous study reported that the far-red fluorophore TO-PRO-3 (642/661), usually employed as a nuclear dye in fixed tissue, was selectively captured by live pericytes from the subventricular zone. Herein, we validated TO-PRO-3 as a specific pericyte tracer in the nervous system (NS). Living pericytes from ex vivo murine hippocampus, cortex, spinal cord, and retina robustly incorporated TO-PRO-3. Classical pericyte immunomarkers such as chondroitin sulphate proteoglycan neuron-glial antigen 2 (NG2) and platelet-derived growth factor receptor beta antigen (PDGFrβ) and the new pericyte dye NeuroTrace 500/525 confirmed cellular specificity of dye uptake. The TO-PRO-3 signal enabled quantification of pericytes density and morphometry; likewise, TO-PRO-3 labeling allowed visualization of pericytes associated with other components of the neurovascular unit. A subset of TO-PRO-3 stained cells expressed the contractile protein α–SMA, indicative of their ability to control the capillary diameter. Uptake of TO-PRO-3 was independent of connexin/pannexin channels but was highly sensitive to temperature and showed saturation, suggesting that a yet unidentified protein-mediated active transport sustained dye incorporation. We conclude that TO-PRO-3 labeling provides a reliable and simple tool for the bioimaging of pericytes in the murine NS microvasculature.Comisión Sectorial de Investigación Científica. Proyecto de Investigación y Desarrollo CSIC I+D 2014.Agencia Nacional de Investigación e Innovación FCE_1_2017_1_13610

Afrontamiento y necesidades percibidas en progenitores de afectados por Espina Bífida

Resumen del trabajo: Introducción: La Espina Bífida es una malformación congénita que consiste en una alteración del desarrollo embrionario del tubo neural y estructuras adyacentes. Objetivos: Conocer las estrategias de afrontamiento utilizadas por los progenitores de afectados por la Espina Bífida e identificar las necesidades percibidas para establecer propuestas de mejora. Metodología: Estudio cualitativo con entrevistas semiestructuradas dirigidas a 17 progenitores. Se establecieron categorías y subcategorías partiendo de las principales variables estudiadas, por cada una de estas subcategorías se elaboraron indicadores, utilizándose como medida de análisis la presencia o ausencia de determinado indicador. También se consideró el nivel de deterioro de los afectados y algunas variables sociodemográficas. Resultados: Se describieron los comentarios espontáneos coincidentes entre los part icipantes (consistencia) que justifican cada indicador. También se establece una priorización de necesidades percibidas dependiendo del deterioro de la enfermedad y del nivel de renta percibido. Conclusiones: Las estrategias de afrontamientos más utilizadas por los progenitores son las activas, las cuales reflejan la adaptación a la enfermedad de sus hijos. Por otro lado, las necesidades percibidas son mayoritariamente a nivel económico y escolar, destacadas más comúnmente entre los progenitores de renta baja y de hijos con un mayor nivel de deterioro

Regulación de las proteínas fosfatasas de especificidad dual (DUSP2 y DUSP6) por receptores de nucleótidos en neuronas granulares

Los nucleótidos pueden considerarse como importantes mediadores extracelulares ya que se encuentran implicados en una gran variedad de funciones en el Sistema Nervioso Central relacionadas con proliferación, diferenciación y supervivencia celular. En neuronas granulares de cerebelo, los receptores P2Y13 y P2X7 han sido descritos como promotores de la supervivencia celular frente a la excitotoxicidad activada por glutamato. La acción neuroprotectora por parte de estos receptores ha sido analizada además por otros tipos de estímulos que inducen estrés genotóxico, como la luz UV, el cisplatino y la camptotecina. En estas condiciones, se produce una desregulación de la familia de las MAP quinasas al provocarse una activación mantenida en el tiempo de p38-MAPK y ERK1/2. En este sentido, también se ha observado una disminución progresiva en la expresión de las fosfatasas de especificidad dual DUSP2 y DUSP6 va en paralelo con el aumento de la activación de p38-MAPK y ERK1/2 respectivamente bajo en condiciones de estrés genotóxico. Cuando las neuronas granulares han sido tratadas con los agonistas nucleotídicos de los receptores P2Y13 y P2X7, el 2MeSADP y BzATP respectivamente, se produce una recuperación de los niveles basales fosforilados de las MAP quinasas tras la exposición a los agentes genotóxicos. Además, el 2MeSADP y BzATP son capaces de restaurar la expresión de DUSP2 y DUSP6 a través de la activación la señalización del receptor P2Y13 y P2X7 en neuronas granulares. Por lo tanto, este efecto mediado por los agonistas nucleotídicos puede contribuir a la acción neuroprotectora contra la muerte celular inducida por los agentes genotóxicos. Este trabajo hace hincapié en la acción de los nucleótidos como importantes señales extracelulares que contribuyen al restablecimiento de los mecanismos de retroalimentación basales que operan en las cascadas de señalización de las MAP quinasas indispensables en el mantenimiento y la supervivencia de las células neuronales. [ABSTRACT]Nucleotides are emerging as important extracellular mediators being involved in a great variety of functions in the nervous system related to proliferation, differentiation and cell survival. In cerebellar granule neurons nucleotide P2Y13 and P2X7 receptors had been described to act as survival promoting factors against glutamate excitotoxicity and oxidative stress. The potential neuroprotective effect of these receptors was analyzed against other damaging insults that induce genotoxic stress, such as exposure to the cisplatin, camptothecin and UV radiation. In addition, both conditions produced MAPK deregulation that was evidenced by long-lasting activation of p38-MAPK and ERK1/2. In this sense, it was observed a progressive reduction in the expression of dual-specificity phosphatases DUSP2 and DUSP6 which run in parallel with long-term p38-MAPK and ERK1/2 activation under conditions of genotoxic stress. When the effect of pre-treatment with the P2Y13 and P2X7 nucleotides agonists, 2MeSADP and BzATP respectively, was analyzed, a significant recovery in the phosphorylated p38-MAPK and ERK1/2 basal levels was observed after to stress genotoxic. Hence, 2MeSADP and BzATP mediated effect might contribute to the neuroprotective action observed for these nucleotidic agonists against cell death induced by genotoxic stress in granule neurons. This work emphasizes the action of nucleotides as important extracellular signals contributing to reestablish basal feedback mechanisms operating at the MAPK signaling cascades that are critical in maintenance and survival of neural cell

Neuroprotection Mediated by P2Y13 Nucleotide Receptors in Neurons

ADP-specific P2Y13 receptor constitutes one of the most recently identified nucleotide receptor and the understanding of their physiological role is currently under investigation. Cerebellar astrocytes and granule neurons provide excellent models to study P2Y13 expression and function since the first identification of ADP-evoked calcium responses not attributable to the related P2Y1 receptor was performed in these cell populations. In this regard, all responses induced by ADP analogues in astrocytes resulted to be Gi-coupled activities mediated by P2Y13 instead of P2Y1 receptors. Similarly, both glycogen synthase kinase-3 (GSK3) and ERK1/2 signaling triggered by 2MeSADP in cerebellar granule neurons were also dependent on Gi-coupled receptors, and mediated by PI3K activity. In granule neurons, P2Y13 receptor was specifically coupled to the main neuronal survival PI3K/Akt-cascade targeting GSK3 phosphorylation. GSK3 inhibition led to nuclear translocation of transcriptional targets, including β-catenin and Nrf2. The activation of the Nrf2/heme oxygenase-1 (HO-1) axis was responsible for the prosurvival effect against oxidative stress. In addition, P2Y13-mediated ERK1/2 signaling in granule neurons also triggered activation of transcription factors, such as CREB, which underlined the antiapoptotic action against glutamate-induced excitotoxicity. Finally, a novel signaling mechanism has been recently described for a P2Y13 receptor in granule neurons that involved the expression of a dual protein phosphatase, DUSP2. This activity contributed to regulate MAPK activation after genotoxic stress. In conclusion, P2Y13 receptors harbored in cerebellar astrocytes and granule neurons exhibit specific signaling properties that link them to specialized functions at the level of neuroprotection and trophic activity in both cerebellar cell populations

P2X7 Nucleotide and EGF Receptors Exert Dual Modulation of the Dual-Specificity Phosphatase 6 (MKP-3) in Granule Neurons and Astrocytes, Contributing to Negative Feedback on ERK Signaling

Extracellular signal-regulated kinases 1 and 2 (ERK1/2) play a central role in the intracellular signaling of P2X7 nucleotide receptors in neurons and glial cells. Fine spatio-temporal tuning of mitogen-activated protein (MAP) kinases is essential to regulate their biological activity. MAP kinase phosphatases (MKPs) are dual specificity protein phosphatases (DUSPs) that dephosphorylate phosphothreonine and phosphotyrosine residues in MAP kinases. This study focuses on how DUSP, DUSP6/MKP3, a phosphatase specific for ERK1/2 is regulated by the P2X7 nucleotide receptor in cerebellar granule neurons and astrocytes. Stimulation with the specific P2X7 agonist, BzATP, or epidermal growth factor (EGF) (positive control for ERK activation) regulates the levels of DUSP6 in a time dependent manner. Both agonists promote a decline in DUSP6 protein, reaching minimal levels after 30 min yet recovering to basal levels after 1 h. The initial loss of protein occurs through proteasomal degradation, as confirmed in experiments with the proteasome inhibitor, MG-132. Studies carried out with Actinomycin D demonstrated that the enhanced transcription of the Dusp6 gene is responsible for recovering the DUSP6 protein levels. Interestingly, ERK1/2 proteins are involved in the biphasic regulation of the protein phosphatase, being required for both the degradation and the recovery phase. We show that direct Ser197 phosphorylation of DUSP6 by ERK1/2 proteins could be part of the mechanism regulating their cytosolic levels, at least in glial cells. Thus, the ERK1/2 activated by P2X7 receptors exerts positive feedback on these kinase’s own activity, promoting the degradation of one of their major inactivators in the cytosolic compartment, DUSP6, both in granule neurons and astrocytes. This feedback loop seems to function as a common universal mechanism to regulate ERK signaling in neural and non-neural cells

Informe final del proyecto: Canales de panexina 1 acoplan la interfaz neuro-vascular en pericitos cerebrales

En la interface neurovascular, los pericitos cerebrales contráctiles ajustan el diámetro capilar para acoplar el flujo sanguíneo local a las demandas metabólicas neuronales, fenómeno conocido como acoplamiento neurovascular: sus mecanismos moleculares y su regulación permanecen aún poco explorados. Reportes recientes implican a canales de membrana de gran poro formados por panexina1-Panx1 (panexones) en la regulación de las interacciones neuro-gliovasculares y del tono muscular y flujo sanguíneo de los grandes vasos. Los panexones proporcionan una vía para transferir iones/moléculas (ingreso de Ca2+; liberación de ATP) entre los medios intracelular y extracelular. Demostramos aquí que los pericitos pericapilares cerebrales expresan panexones funcionales capaces de mediar un intercambio molecular con el microentorno cerebral en ratones despiertos (in vivo), rodajas agudas (ex vivo) y cultivos primarios (in vitro). En condiciones control, dicho intercambio es mantenido por la secreción basal de ATP endógeno y receptores purinérgicos ionotrópicos P2X7(P2X7R) y metabotrópicos P2Y6(P2Y6R). El neurotransmisor glutamato, los receptores neuronales glutamatérgicos NMDA/AMPA, la actividad neuronal inducida por inhibición de receptores GABAA, la descarga epiléptica, y los vasodilatadores acetil-colina y adenosina, disminuyeron la interacción pericito-fluido cerebral por cierre de panexones pericitarios; la PGE2 inhibió panexones solamente en presencia de noradrenalina. La deprivación sensorial, los vasoconstrictores ATP, noradrenalina, endotelina-1 y angiotensina-II y los P2Y6R incrementaron dicha interacción por apertura de panexones. En pericitos cerebrales cultivados, la Panx1 amplificó el aumento del Ca2+ intracelular inducido por ATP exógeno. Nuestros resultados sugieren que los panexones pericitarios sensan y responden a la actividad neuronal y los niveles extracelulares de neurotransmisores y moléculas vasoactivas mediante cambios en su actividad; su estado funcional modula el Ca2+ intrapericitario y consecuentemente el tono contráctil de los pericitos. La panexina1 pericitaria, estratégicamente ubicada en la interfaz sangre/cerebro, surge como un nuevo mecanismo para regular el flujo sanguíneo microvascular y el intercambio a través de la barrera hemato-encefálica.Agencia Nacional de Investigación e Innovació

Informe final del proyecto: Canales de panexina 1 acoplan la interfaz neuro-vascular en pericitos cerebrales

En la interface neurovascular, los pericitos cerebrales contráctiles ajustan el diámetro capilar para acoplar el flujo sanguíneo local a las demandas metabólicas neuronales, fenómeno conocido como acoplamiento neurovascular: sus mecanismos moleculares y su regulación permanecen aún poco explorados. Reportes recientes implican a canales de membrana de gran poro formados por panexina1-Panx1 (panexones) en la regulación de las interacciones neuro-gliovasculares y del tono muscular y flujo sanguíneo de los grandes vasos. Los panexones proporcionan una vía para transferir iones/moléculas (ingreso de Ca2+; liberación de ATP) entre los medios intracelular y extracelular. Demostramos aquí que los pericitos pericapilares cerebrales expresan panexones funcionales capaces de mediar un intercambio molecular con el microentorno cerebral en ratones despiertos (in vivo), rodajas agudas (ex vivo) y cultivos primarios (in vitro). En condiciones control, dicho intercambio es mantenido por la secreción basal de ATP endógeno y receptores purinérgicos ionotrópicos P2X7(P2X7R) y metabotrópicos P2Y6(P2Y6R). El neurotransmisor glutamato, los receptores neuronales glutamatérgicos NMDA/AMPA, la actividad neuronal inducida por inhibición de receptores GABAA, la descarga epiléptica, y los vasodilatadores acetil-colina y adenosina, disminuyeron la interacción pericito-fluido cerebral por cierre de panexones pericitarios; la PGE2 inhibió panexones solamente en presencia de noradrenalina. La deprivación sensorial, los vasoconstrictores ATP, noradrenalina, endotelina-1 y angiotensina-II y los P2Y6R incrementaron dicha interacción por apertura de panexones. En pericitos cerebrales cultivados, la Panx1 amplificó el aumento del Ca2+ intracelular inducido por ATP exógeno. Nuestros resultados sugieren que los panexones pericitarios sensan y responden a la actividad neuronal y los niveles extracelulares de neurotransmisores y moléculas vasoactivas mediante cambios en su actividad; su estado funcional modula el Ca2+ intrapericitario y consecuentemente el tono contráctil de los pericitos. La panexina1 pericitaria, estratégicamente ubicada en la interfaz sangre/cerebro, surge como un nuevo mecanismo para regular el flujo sanguíneo microvascular y el intercambio a través de la barrera hemato-encefálica.Agencia Nacional de Investigación e Innovació

Sexist Myths Emergency Healthcare Professionals and Factors Associated with the Detection of Intimate Partner Violence in Women

This study analysed the capacity of emergency physicians and nurses working in the city of Granada (Spain) to respond to intimate partner violence (IPV) against women, and the mediating role of certain factors and opinions towards certain sexist myths in the detection of cases. This is a cross-sectional study employing the physician readiness to manage intimate partner violence survey (PREMIS) between October 2020 and January 2021, with 164 surveys analysed. Descriptive and analytical statistics were applied, designing three multivariate regression models by considering opinions about different sexist myths. Odds ratios and 95% confidence intervals (CIs) were considered for the detection of cases. In the past six months, 34.8% of professionals reported that they had identified some cases of IPV, particularly physicians (OR = 2.47, 95% CI = 1.14–5.16; OR = 2.65, 95% CI = 1.26–5.56). Those who did not express opinions towards sexist myths related to the understanding of the victim or the consideration of alcohol/drug abuse as the main causes of violence and showed a greater probability of detecting a case (NS) (OR = 1.26 and OR = 1.65, respectively). In order to confirm the indicia found, further research is required, although there tends to be a common opinion towards the certain sexual myth of emergency department professionals not having an influence on IPV against women