Tensin links energy metabolism to extracellular matrix assembly.

The regulation of integrin function is key to fundamental cellular processes, including cell migration and extracellular matrix (ECM) assembly. In this issue, Georgiadou et al. (2017. J. Cell Biol. https://doi.org/10.1083/jcb.201609066) report that the metabolic sensor adenosine monophosphate-activated protein kinase influences tensin production to regulate α5β1-integrin and fibrillar adhesion assembly and thus reveal an important connection between energy metabolism and ECM assembly

Improving 3D MA-TIRF Reconstruction with Deconvolution and Background Estimation

International audienceTotal internal reflection fluorescence microscopy (TIRF) produces 2D images of the fluorescent activity integrated over a very thin layer adjacent to the glass coverslip. By varying the illumination angle (multi-angle TIRF), a stack of 2D images is acquired from which it is possible to estimate the axial position of the observed biological structures. Due to its unique optical sectioning capability, this technique is ideal to observe and study biological processes at the vicinity of the cell membrane. In this paper, we propose an efficient reconstruction algorithm for multi-angle TIRF microscopy which accounts for both the PSF of the acquisition system (diffraction) and the background signal (e.g., autofluorescence). It jointly performs volume reconstruction, deconvolution, and background estimation. This algorithm, based on the simultaneous-direction method of mul-tipliers (SDMM), relies on a suitable splitting of the optimization problem which allows to obtain closed form solutions at each step of the algorithm. Finally, numerical experiments reveal the importance of considering the background signal into the reconstruction process, which reinforces the relevance of the proposed approach

Human glycated albumin affects glucose metabolism in L6 skeletal muscle cells by impairing insulin-induced insulin receptor substrate (IRS) signaling through a protein kinase C alpha-mediated mechanism.

Nonenzymatic glycation is increased in diabetes and leads to increased levels of glycated proteins. Most studies have focused on the role of glycation products in vascular complications. Here, we have investigated the action of human glycated albumin (HGA) on insulin signaling in L6 skeletal muscle cells. Exposure of these cells to HGA inhibited insulin-stimulated glucose uptake and glycogen synthase activity by 95 and 80%, respectively. These effects were time- and dose-dependent, reaching a maximum after 12 h incubation with 0.1 mg/ml HGA. In contrast, exposure of the cells to HGA had no effect on thymidine incorporation. Further, HGA reduced insulin-stimulated serine phosphorylation of PKB and GSK3, but did not alter ERK1/2 activation. HGA did not affect either insulin receptor kinase activity or insulin-induced Shc phosphorylation on tyrosine. In contrast, insulin-dependent IRS-1 and IRS-2 tyrosine phosphorylation was severely reduced in cells preincubated with HGA for 24 h. Insulin-stimulated association of PI3K with IRS-1 and IRS-2, and PI3K activity were reduced by HGA in parallel with the changes in IRS tyrosine phosphorylation, while Grb2-IRS association was unchanged. In L6 myotubes, exposure to HGA increased PKC activity by 2-fold resulting in a similar increase in Ser/Thr phosphorylation of IRS-1 and IRS-2. These phosphorylations were blocked by the PKC inhibitor bisindolylmaleimide (BDM). BDM also blocked the action of HGA on insulin-stimulated PKB and GSK3 alpha. Simultaneously, BDM rescued insulin-stimulation of glucose uptake and glycogen synthase activity in cells exposed to HGA. The use of antibodies specific to PKC isoforms shows that this effect appears to be mediated by activated PKC alpha, independent of reactive oxygen species production. In summary, in L6 skeletal muscle cells, exposure to HGA leads to insulin resistance selectively in glucose metabolism with no effect on growth-related pathways regulated by the hormone

Differential Role of Insulin Receptor Substrate (IRS)-1 and IRS-2 in L6 Skeletal Muscle Cells Expressing the Arg1152 → Gln Insulin Receptor *

In L6 muscle cells expressing the Arg1152 --> Gln insulin receptor (Mut), basal tyrosine phosphorylation of insulin receptor substrate (IRS)-1 was increased by 35% compared with wild-type cells (WT). Upon exposure to insulin, IRS-1 phosphorylation increased by 12-fold in both the Mut and WT cells. IRS-2 was constitutively phosphorylated in Mut cells and not further phosphorylated by insulin. The maximal phosphorylation of IRS-2 in basal Mut cells was paralleled by a 4-fold increased binding of the kinase regulatory loop binding domain of IRS-2 to the Arg1152 --> Gln receptor. Grb2 and phosphatidylinositol 3-kinase association to IRS-1 and IRS-2 reflected the phosphorylation levels of the two IRSs. Mitogen-activated protein kinase activation and [3H]thymidine incorporation closely correlated with IRS-1 phosphorylation in Mut and WT cells, while glycogen synthesis and synthase activity correlated with IRS-2 phosphorylation. The Arg1152 --> Gln mutant did not signal Shc phosphorylation or Shc-Grb2 association in intact L6 cells, while binding Shc in a yeast two-hybrid system and phosphorylating Shc in vitro. Thus, IRS-2 appears to mediate insulin regulation of glucose storage in Mut cells, while insulin-stimulated mitogenesis correlates with the activation of the IRS-1/mitogen-activated protein kinase pathway in these cells. IRS-1 and Shc-mediated mitogenesis may be redundant in muscle cells

Nonsuppressed Glucagon After Glucose Challenge as a Potential Predictor for Glucose Tolerance

Glucagon levels are classically suppressed after glucose challenge. It is still not clear as to whether a lack of suppression contributes to hyperglycemia and thus to the development of diabetes. We investigated the association of postchallenge change in glucagon during oral glucose tolerance tests (OGTTs), hypothesizing that higher postchallenge glucagon levels are observed in subjects with impaired glucose tolerance (IGT). Glucagon levels were measured during OGTT in a total of 4,194 individuals without diabetes in three large European cohorts. Longitudinal changes in glucagon suppression were investigated in 50 participants undergoing a lifestyle intervention. Only 66-79% of participants showed suppression of glucagon at 120 min (fold change glucagon(120/0)Peer reviewe

Régulation négative de l'interaction entre les sous-unités adaptatrices de la PI3-kinase et les protéines de signalisation de l'insuline et l'IGF-1, recherche de nouveau(x) partenaire(s) de la phosphotyrosine phosphatase SHP-2 ainsi que de gênes dont l'expression est régulée par la serine/threonine kinase PKB

Les récepteurs à activité tyrosine kinase de l'insuline et l'IGF-1 s'autophosphorylent sur des résidus tyrosine après fixation de leur ligand respectif, créant des sites d'ancrages pour les différents substrats de ces récepteurs comme les protéines IRS (Insulin Receptor Substrat) ou Shc. Ces protéines substrats sont ensuite phosphorylées par les récepteurs puis recrutent et activent les protéines de signalisation possédant des domaines SH2 comme la tyrosine phosphatase Shp-2 ou les sous-unités régulatrices de la PI 3-kinase. Ces protéines sont impliquées dans la transduction du message intracellulaire dont le résultat est le contrôle d'activités enzymatiques ou de l'expression de gènes impliqués dans l'homéostasie du glucose ou la croissance cellulaire par exemple. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés au rôle de la sous-unité régulatrice p55PIK de la PI 3-kinase dans la voie de signalisation de l'IGF-1. Nous avons déterminé les régions importantes de p55PIK qui interagissent avec la sous-unité catalytique p110 de la PI 3-kinase ainsi qu'avec le récepteur de l'IGF-1. Nous avons déterminé in vitro que p55PIK interagie avec le récepteur de l'IGF-1 purifié et que cette interaction dépend de l'état d'activation du récepteur. De plus, dans des cellules intactes stimulées par l'IGF-1, p55PIK interagie avec le récepteur de l'IGF-1 et IRS-1. Grâce à un mutant dominant négatif de p55PIK, nous avons mis en évidence une boucle de rétrocontrôle négatif de l'interaction de p55PIK avec ses partenaires, due à la production de D3-phosphoinositides par l'activité PI 3-kinase. Dans un deuxième temps, nous avons voulu caractériser le rôle de résidus sérine de IRS-1 qui jouxtent les tyrosines constituant les sites potentiels d'association de IRS-1 aux sous unités régulatrices de la PI 3-kinase. Pour cela, nous avons utilisé un système de double hybride modifié dans la levure et nous avons démontré que la mutation des sérines 662 et 731 en alanines de IRS-1 (IRS-1 S662A/S731A) augmente son interaction avec les sous-unités régulatrices p85 et p55PIK de la PI 3-kinase par rapport à IRS-1 sauvage. Dans des cellules intactes exprimant IRS-1 S662A/S731A, nous avons mis en évidence une augmentation de l'activité de la sérine/thréonine PKB en absence de toute stimulation par l'insuline comparé à des cellules qui expriment IRS-1 sauvage. Nous avons ensuite recherché de nouvelles molécules qui interagissent avec Shp-2 et qui pourraient jouer un rôle dans la signalisation de l'insuline. Pour cela nous avons criblé une banque d'ADNc de placenta humain à l'aide du système double hybride modifié dans la levure. Nous avons mis en évidence que la protéine FRS2 peut s'associer à Shp-2 lorsque FRS2 est phosphorylée par le récepteur de l'insuline. Nous avons démontré que FRS2 est phosphorylée in vitro par le récepteur de l'insuline. Dans des cellules surexprimant le récepteur de l'insuline, nous avons trouvé que FRS2 est phosphorylée en réponse à l'insuline et s'associe avec Shp-2. FRS2 serait donc un nouveaux substrat du récepteur et s'associerait avec Shp-2 après stimulation par l'insuline. Enfin, nous avons cherché à mettre en évidence des gènes dont l'expression est contrôlée par PKB. Pour cela, nous avons transfecté des cellules HepG2 avec un mutant constitutivement actif de PKB (Myr-PKB) puis nous avons trié les cellules par la technique de MACS pour ne récupérer que les cellules exprimant Myr-PKB. Nous avons préparé ensuite les ARN totaux de ces cellules et comparé le profil d'expression des ARNm de ces cellules par rapport à celui de cellules contrôle par hybridation soustractive par suppression (HSS). Après isolement de clones positifs, le séquençage des ADNc a révélé deux clones dont l'identité est à 98 % homologue au gène de la phospholipase du groupe IIA sécrétée (sPLA2). Ainsi dans nos conditions expérimentales, nous avons mis en évidence que la sPLA2 voit l'expression de son gène augmenter dans des cellules exprimant le mutant Myr-PKB par rapport aux cellules contrôles. PKB régulerait positivement l'expression de sPLA2 dans les cellules HepG2.NICE-BU Sciences (060882101) / SudocSudocFranceF

Obésité, acides gras et cancer du foie (effets de l'oléate sur les cellules de cancer du foie)

La prévalence de l obésité ne cesse de croître dans les pays industrialisés et devient un véritable problème de santé publique. L obésité associée à l insulinorésistance sont des facteurs de risque de certain cancer. Le lien épidémiologique entre l obésité et le carcinome hépatocellulaire (CHC) qui constitue la 3ème cause de mortalité par cancer dans le monde, n est pas si évident. En effet, les mécanismes moléculaires à l origine de cette association ne sont pas déterminés. L obésité et l alimentation riche en lipides présentes dans les pays industrialisés induisent des variations physiologiques importantes à l origine entre autres, d une augmentation des taux circulants de palmitate (acide gras saturé) et de l oléate (acide gras mono-insaturé). En effet, une augmentation de 50 M d oléate chez les individus obèses est observée par rapport aux sujets de poids normal. Cette augmentation pourrait expliquer le lien épidémiologique entre obésité et augmentation de risque de développer un CHC. Le palmitate est connu pour ses effets toxiques sur les hépatocytes, à l inverse de l oléate, dont les effets sont encore très controversés. Quelques études montrent son implication dans l invasion et la progression de certains cancers. Néanmoins, son effet pro-ou anti-tumoral n est pas défini dans le CHC. Ce travail de thèse avait pour but d étudier les effets et les mécanismes moléculaires impliqués dans la prolifération de cellules de CHC induit par l oléate et indirectement par l obésité. Nous avons soumis des cellules d hépatocarcinome humain à différentes concentrations d oléate, dont une physiopathologique de 50 M. Nous avons montré que la voie mammalian Target Of Rapamycin Complex 1 (mTORC1) est responsable de la progression du cycle cellulaire et des effets prolifératifs de l oléate en concentration physiopathologique. En effet, mTORC1 est un effecteur majeur de la transduction du signal en réponse aux nutriments, impliqué dans la prolifération, la croissance cellulaire et souvent dérégulé dans les cancers, dont le CHC. Par ailleurs, nous avons observé qu en présence d oléate, nos cellules deviennent résistantes à l effet antiprolifératif de la rapamycine, un inhibiteur de la voie mTORC1 utilisé en thérapeutique. Les phospholipases D (PLD) produisent de l acide phosphatidique (PA), capable d activer mTORC1 et dans certain cas, de rendre cette kinase résistante à la rapamycine. Effectivement, l oléate induit la production de PA, responsable de l activation de la voie mTORC1/4E-BP1 et de l augmentation de la prolifération des cellules d hépatocarcinome. L inhibition de la production de PA réverse la résistance à la rapamycine induite par l oléate sur l axe mTORC1/4E-BP1. Nos travaux ont mis en évidence que l oléate constitue un lien moléculaire épidémiologique entre obésité et CHC, et aide à la compréhension moléculaire des effets de cet acide gras sur la progression du CHC. Par ailleurs, il est possible d envisager de nouvelles perspectives pour la prévention et/ou le traitement de ce cancer, réputé chimio- et radio-résistant dont seule la résection chirurgicale constitue un traitement efficace à ce jour. En effet, le traitement du CHC par des inhibiteurs de PLD pourrait être envisagé et constituerait une alternative à l utilisation de la rapamycine ou de ses dérivés, inefficaces en présence d obésité ou d insulinorésistance. De plus, nos résultats mèneront à d éventuelles recommandations nutritionnelles pour la prévention primaire ou secondaire du cancer du foie.NICE-BU Sciences (060882101) / SudocSudocFranceF

Etude de la Myotubularine, une phosphoinositide phosphatase (fonction et implication dans l'action de l'insuline)

L'élaboration de nouvelles thérapies contre le diabète nécessite la compréhension des bases moléculaires de la résistance à l'insuline. Au cours de ma thèse, je me suis intéressée à la Myotubularine, une phosphatase mutée dans la myopathie myotubulaire liée au chromosome X. Nous avons montré que cette enzyme déphosphoryle spécifiquement la position D3 des phosphatidylinositol (3) et (3,5)-phosphate [PI(3)P et PI(3,5)P2]. De plus, nous avons observé que la surexpression de la Myotubularine dans les cellules musculaires L6 inhibe la translocation du transporteur de glucose GLUT4 à la membrane plasmique. Dans une deuxième partie, j'ai étudié l'effet d'une exposition prolongée à l'insuline sur le niveau des protéines Insulin Receptor Substrate-1/2 (IRS-1/2). Cette étude, réalisée dans des cellules musculaires et adipocytaires, a permis de mettre en évidence des différences de régulation entre IRS-1 et IRS-2 mais également une spécificité cellulaire de ces mécanismes. Notamment, dans les adipocytes 3T3L1, l'inhibition des histones déacétylases (HDACs) empêche en partie la baisse de la quantité de protéine IRS-1 (dégradation), probablement via une acétylation d'IRS-1. En revanche, dans les cellules musculaires L6, l'inhibition des HDACs empêche la baisse de la quantité d'ARNm d'IRS-1, mais pas d'IRS-2, vraisemblablement via acétylation de la chromatine au niveau de ce gène. L'ensemble de nos résultats démontre que la transduction du signal de l'insuline est régulée de façon importante au niveau des D3-phosphoinositides et des protéines IRS. Cette étude a en outre permis de mettre en évidence, pour la première fois que les HDACs participent à la régulation des composants de la voie de signalisation de l'insuline par l'hormone elle-même.NICE-BU Sciences (060882101) / SudocSudocFranceF