Estrutura versus função : aspectos estruturais e funcionais do Jaburetox e da urease de Proteus mirabilis

Ureases são proteínas moonlighting, com mapeamento da estrutura-atividade ainda pouco compreendido. A urease de Proteus mirabilis (PMU) é um importante fator de virulência. PMU apresenta-se em solução como um trímero onde cada monômero apresenta três subunidades estruturais: PmUreα, PmUreβ e PmUreγ. Neste trabalho, identificamos que a PMU se comporta como agonista, promovendo agregação plaquetária e é tóxica a leveduras, provocando alterações morfológicas. Estas características foram já descritas para outras ureases e também identificadas para a PmUreβ. As subunidades γ e β da PMU são capazes de ativar o sistema imune do inseto Rhodnius prolixus e quando testadas em Dysdercus peruvianus, PmUreβ apresentou maior toxicidade que as subunidades recombinantes γ e α quando administrados por via oral a este inseto. A atividade de agonista da PMU acredita-se que seja devido à porção contida na PmUreβ identificada como uma duplicação gênica entre a PmUreβ e a urease de Canavalia ensiformis (JBU) correspondente à porção α na PMU. A atividade entomotóxica da JBU é devido à liberação do polipeptídeo jaburetox (Jbtx) após hidrólise da JBU por enzimas do tipo catepsina. A PMU e sua subunidade β apresentam um overlap de toxicidade com o Jbtx, devido à existência de uma duplicação gênica entre as sequências de nucleotídeos do Jbtx e da PmUreβ. Outro fator determinante para a toxicidade apresentada pela PmUreβ seria a perda de estrutura quando em solução, conforme descrito para o Jbtx, foi classificado como uma proteína intrinsicamente desordenada capaz de interagir com lipídios presentes na membrana celular alterando a permeabilidade da mesma, sugerindo a interação Jbtx-membrana como base para sua entomotoxicidade. Visando investigar esta interação, foram analisadas soluções contendo Jbtx em presença de modelos de membrana artificiais. Quando em presença de micelas compostas por SDS, Jbtx teve um aumento de estruturas secundária e terciária. Em presença de vesículas e bicelas, o polipeptídeo apresentou uma pequena alteração estrutural nas porções N e C-terminal. Nossos resultados sugerem que o Jbtx é capaz de ancorar-se à membrana celular de insetos, devido uma interação com os lipídios presentes na mesma, de modo a facilitar seu contato com um alvo específico presente na membrana plasmática.Ureases are moonlighting proteins, with poorly structure-activity mapping properties characterized. Urease from Proteus mirabilis (PMU) is an important virulence factor for this bacteria. PMU is a trimeric protein in which each monomer is composed by three structural subunits: PmUreα, PmUreβ and PmUreγ. In this work, we identified that PMU acts as an agonist, promoting platelet aggregation and was shown to be toxic against yeasts causing morphological alterations, the same characteristics observed for PmUreβ and already described for other ureases. PmUreγ and PmUreβ subunits are able to activate the immune system of the insect Rhodnius prolixus. In addition, when tested against Dysdercus peruvianus, PmUreβ showed higher toxicity to this insect than the recombinant subunits α or γ if administered orally. The agonist activity of PMU is due to a portion of intragenic duplication at PmUreβ, this duplication was found between ureB and Canavalia ensiformis (JBU) gene corresponding to a subunit from PMU. Entomotoxic activity of JBU is mainly due to a polypeptide release, this polypeptide is called jaburetox (Jbtx), after urease hydrolysis by cathepsin-like enzymes. Both PmUreβ and Jbtx present regions of intragenic duplication, which seem to be an explanation for the toxicity of PMU and Jbtx overlap. A second issue is that PmUreβ looses its structure when in solution, the same characteristic described for Jbtx that is an intrinsically disordered polypeptide able to interact with lipids present on cellular membranes. That interaction alters its permeability hinting to a role of Jbtx-membrane interaction as the basis for its toxicity. Intending to investigate the interaction between Jbtx and cellular membranes we performed experiments of Jbtx in presence of artificial membranes (micelles, large unilamellar vesicles - LUVs, and bicelles). The polypeptide when in presence of SDS micelles had an increase of its secondary and tertiary structures. When Jbtx interacted with LUVs, and bicelles as well, the polypeptide presented a slight change of structure at its terminal regions. Our results suggest that Jbtx could anchor to the cellular membrane by an interaction with lipids in order to facilitate its interaction with a membrane-bound target present at the plasma membrane

Soyuretox, an intrinsically disordered polypeptide derived from soybean (Glycine max) ubiquitous urease with potential use as a biopesticide

Ureases from different biological sources display non-ureolytic properties that contribute to plant defense, in addition to their classical enzymatic urea hydrolysis. Antifungal and entomotoxic effects were demonstrated for Jaburetox, an intrinsically disordered polypeptide derived from jack bean (Canavalia ensiformis) urease. Here we describe the properties of Soyuretox, a polypeptide derived from soybean (Glycine max) ubiquitous urease. Soyuretox was fungitoxic to Candida albicans, leading to the production of reactive oxygen species. Soyuretox further induced aggregation of Rhodnius prolixus hemocytes, indicating an interference on the insect immune response. No relevant toxicity of Soyuretox to zebrafish larvae was observed. These data suggest the presence of antifungal and entomotoxic portions of the amino acid sequences encompassing both Soyuretox and Jaburetox, despite their small sequence identity. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) and circular dichroism (CD) spectroscopic data revealed that Soyuretox, in analogy with Jaburetox, possesses an intrinsic and largely disordered nature. Some folding is observed upon interaction of Soyuretox with sodium dodecyl sulfate (SDS) micelles, taken here as models for membranes. This observation suggests the possibility for this protein to modify its secondary structure upon interaction with the cells of the affected organisms, leading to alterations of membrane integrity. Altogether, Soyuretox can be considered a promising biopesticide for use in plant protection.Fil: Kappaun, Karine. Pontificia Universidade Católica do Rio Grande do Sul; BrasilFil: Martinelli, Anne H. S.. Universidade Federal do Rio Grande do Sul; BrasilFil: Broll, Valquiria. Universidade Federal do Rio Grande do Sul; BrasilFil: Zambelli, Barbara. Universidad de Bologna; ItaliaFil: Lopes, Fernanda C.. Universidade Federal do Rio Grande do Sul; BrasilFil: Ligabue-Braun, Rodrigo. Universidade Federal do Rio Grande do Sul; BrasilFil: Fruttero, Leonardo Luis. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; ArgentinaFil: Moyetta, Natalia Rita. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; ArgentinaFil: Bonan, Carla D.. Pontificia Universidade Católica do Rio Grande do Sul; BrasilFil: Carlini, Célia Regina R. S.. Pontificia Universidade Católica do Rio Grande do Sul; BrasilFil: Ciurli, Stefano. Universidad de Bologna; Itali

Síntese multicomponente de octahidroquinazolinas : análogos dos agentes antimitóticos Enastron e Dimetilenastron

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Síntese multicomponente de octahidroquinazolinas : análogos dos agentes antimitóticos Enastron e Dimetilenastron

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Purificação e caracterização da urease recombinante de Proteus mirabilis

Ureases são metaloenzimas dependentes de níquel, amplamente distribuída em bactérias, fungos e plantas. Estas enzimas atuam na catálise da hidrólise da ureia a amônia e dióxido de carbono. Proteus mirabilis é uma bactéria patogênica, produtora de urease, um de seus mais importantes fatores de virulência. Esta bactéria Gram-negativa se comporta como um uropatógeno oportunista responsável por severas infecções em pacientes hospitalizados. A amônia liberada pela hidrólise da ureia catalisada pela urease de Proteus mirabilis (PMU) causa um aumento no pH levando à formação de microclima, possibilitando a colonização do patógeno no trato urinário do hospedeiro. A PMU apresenta alta similaridade com outras ureases, como a urease de sementes de “Jack bean” (JBU) e a urease de Helicobacter pylori (HPU), para as quais nosso grupo descreveu diversas atividades biológicas que são independentes da hidrólise de ureia. Neste trabalho, nós produzimos PMU, e logo depois investigamos se esta, assim como a JBU e a HPU, apresenta atividades não relacionadas à atividade enzimática. As condições de cultivo para expressão da PMU expressa em Escherichia coli HB101 foram otimizadas pela metodologia de superfície de resposta. Concentrações de níquel, ureia e tempos de indução foram testados. A purificação da enzima recombinante foi obtida em 3 etapas cromatográficas. A primeira, uma HiTrapQTM HP (pH 7,5) onde a urease foi eluida com 400 mMol.L-1 de KCl. O pico das frações eluídas foram reunidas, dialisadas e aplicadas na coluna HiLoad 26/10 Q-SepharoseTM HP, usando o mesmo tampão e sal para eluição. As frações ativas foram novamente reunidas e a PMU foi submetida a cromatografia de gel filtração (Superdex 200TM 26/60-pg). A PMU apresenta estabilidade na faixa de pH 7,0 a 8,5, com seu pH ótimo estimado em 8,0. Alta atividade ureolítica pode ser detectada de 37 oC a 48 oC. Diferentes soluções salinas induzem o aumento na atividade enzimática desta urease, e quanto maior o tempo de exposição, maior a tendência a este aumento. Assim como a JBU, esta urease é capaz de inibir o crescimento de leveduras, mas diferentemente desta e da HPU, a PMU não apresenta atividade inibitória sobre a germinação de esporos e o crescimento de fungos filamentosos. As ureases de P. mirabilis e de H. pylori apresentam regiões de semelhança com o peptídeo proveniente do colágeno, e de acordo com testes de modelagem, esta região estaria exposta para interação com receptores localizados nas membranas de plaquetas, visto que ambas ativam plaquetas resultando na formação de agregados.Ureases are Ni-dependent metalloenzymes, widespread in bacteria, fungi and plants, that catalyze the hydrolysis of urea into ammonium and carbon dioxide. The pathogenic bacteria Proteus mirabilis produces urease as virulence factor. Proteus mirabilis is a Gram negative opportunistic uropathogen, which causes severe infections in hospitalized patients. Ammonia released from urea hydrolysis by Proteus mirabilis urease (PMU) increases the local pH and forms a microclimate which allows the colonization of the host urinary tract. PMU presents high similarity to other ureases, such as that from Jack bean seeds (JBU) or from Helicobacter pylori (HPU), for which our group has described biological activities unrelated to urea hydrolysis. Here we aimed to investigate whether PMU shares with JBU and HPU other properties unrelated to enzyme activity. Growth conditions of PMU-expressing Escherichia coli HB101 were optimized by response surface methodology prior to purification. Concentrations of nickel, urea, and induction time were tested. A partially purified recombinant enzyme was obtained after 3 chromatographic steps. In the first, a HiTrapQTM HP (pH 7.5), urease eluted with 400 mMol.L-1 KCl. Peak fractions were pooled, dialyzed and loaded in a HiLoad 26/10 Q-SepharoseTM HP column using same buffer and eluting salt. The active fractions were pooled and PMU was submitted to gel filtration (Superdex 200TM26/60-pg). The enzyme was stable in the range of pH 7.0 up to 8.5, with optimum pH at 8.0. The ureolitic activity is high from 37 oC up to 48 oC. Different salts increased the ureolytic activity of PMU, the longer the exposition, the higher was the increase in activity. PMU inhibited yeast growth, similarly to the effect induced by JBU. Differently from JBU and HPU, this urease did not inhibit spore germination and growth of different filamentous fungi. Ureases from P. mirabilis and H. pylori presented regions of homology with collagen, and according to modeling tests, these region are exposed to receptor recognition localized in platelets membrane, which might explain their platelet aggregating effect

Reações de adição de compostos 1, 3-dicarbonílicos a nitroestireno catalisadas por hidrotalcitas (HT-LDH)

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Reações de adição de compostos 1, 3-dicarbonílicos a nitroestireno catalisadas por hidrotalcitas (HT-LDH)

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Purificação e caracterização da urease recombinante de Proteus mirabilis

Ureases são metaloenzimas dependentes de níquel, amplamente distribuída em bactérias, fungos e plantas. Estas enzimas atuam na catálise da hidrólise da ureia a amônia e dióxido de carbono. Proteus mirabilis é uma bactéria patogênica, produtora de urease, um de seus mais importantes fatores de virulência. Esta bactéria Gram-negativa se comporta como um uropatógeno oportunista responsável por severas infecções em pacientes hospitalizados. A amônia liberada pela hidrólise da ureia catalisada pela urease de Proteus mirabilis (PMU) causa um aumento no pH levando à formação de microclima, possibilitando a colonização do patógeno no trato urinário do hospedeiro. A PMU apresenta alta similaridade com outras ureases, como a urease de sementes de “Jack bean” (JBU) e a urease de Helicobacter pylori (HPU), para as quais nosso grupo descreveu diversas atividades biológicas que são independentes da hidrólise de ureia. Neste trabalho, nós produzimos PMU, e logo depois investigamos se esta, assim como a JBU e a HPU, apresenta atividades não relacionadas à atividade enzimática. As condições de cultivo para expressão da PMU expressa em Escherichia coli HB101 foram otimizadas pela metodologia de superfície de resposta. Concentrações de níquel, ureia e tempos de indução foram testados. A purificação da enzima recombinante foi obtida em 3 etapas cromatográficas. A primeira, uma HiTrapQTM HP (pH 7,5) onde a urease foi eluida com 400 mMol.L-1 de KCl. O pico das frações eluídas foram reunidas, dialisadas e aplicadas na coluna HiLoad 26/10 Q-SepharoseTM HP, usando o mesmo tampão e sal para eluição. As frações ativas foram novamente reunidas e a PMU foi submetida a cromatografia de gel filtração (Superdex 200TM 26/60-pg). A PMU apresenta estabilidade na faixa de pH 7,0 a 8,5, com seu pH ótimo estimado em 8,0. Alta atividade ureolítica pode ser detectada de 37 oC a 48 oC. Diferentes soluções salinas induzem o aumento na atividade enzimática desta urease, e quanto maior o tempo de exposição, maior a tendência a este aumento. Assim como a JBU, esta urease é capaz de inibir o crescimento de leveduras, mas diferentemente desta e da HPU, a PMU não apresenta atividade inibitória sobre a germinação de esporos e o crescimento de fungos filamentosos. As ureases de P. mirabilis e de H. pylori apresentam regiões de semelhança com o peptídeo proveniente do colágeno, e de acordo com testes de modelagem, esta região estaria exposta para interação com receptores localizados nas membranas de plaquetas, visto que ambas ativam plaquetas resultando na formação de agregados.Ureases are Ni-dependent metalloenzymes, widespread in bacteria, fungi and plants, that catalyze the hydrolysis of urea into ammonium and carbon dioxide. The pathogenic bacteria Proteus mirabilis produces urease as virulence factor. Proteus mirabilis is a Gram negative opportunistic uropathogen, which causes severe infections in hospitalized patients. Ammonia released from urea hydrolysis by Proteus mirabilis urease (PMU) increases the local pH and forms a microclimate which allows the colonization of the host urinary tract. PMU presents high similarity to other ureases, such as that from Jack bean seeds (JBU) or from Helicobacter pylori (HPU), for which our group has described biological activities unrelated to urea hydrolysis. Here we aimed to investigate whether PMU shares with JBU and HPU other properties unrelated to enzyme activity. Growth conditions of PMU-expressing Escherichia coli HB101 were optimized by response surface methodology prior to purification. Concentrations of nickel, urea, and induction time were tested. A partially purified recombinant enzyme was obtained after 3 chromatographic steps. In the first, a HiTrapQTM HP (pH 7.5), urease eluted with 400 mMol.L-1 KCl. Peak fractions were pooled, dialyzed and loaded in a HiLoad 26/10 Q-SepharoseTM HP column using same buffer and eluting salt. The active fractions were pooled and PMU was submitted to gel filtration (Superdex 200TM26/60-pg). The enzyme was stable in the range of pH 7.0 up to 8.5, with optimum pH at 8.0. The ureolitic activity is high from 37 oC up to 48 oC. Different salts increased the ureolytic activity of PMU, the longer the exposition, the higher was the increase in activity. PMU inhibited yeast growth, similarly to the effect induced by JBU. Differently from JBU and HPU, this urease did not inhibit spore germination and growth of different filamentous fungi. Ureases from P. mirabilis and H. pylori presented regions of homology with collagen, and according to modeling tests, these region are exposed to receptor recognition localized in platelets membrane, which might explain their platelet aggregating effect

Estrutura versus função : aspectos estruturais e funcionais do Jaburetox e da urease de Proteus mirabilis

Ureases são proteínas moonlighting, com mapeamento da estrutura-atividade ainda pouco compreendido. A urease de Proteus mirabilis (PMU) é um importante fator de virulência. PMU apresenta-se em solução como um trímero onde cada monômero apresenta três subunidades estruturais: PmUreα, PmUreβ e PmUreγ. Neste trabalho, identificamos que a PMU se comporta como agonista, promovendo agregação plaquetária e é tóxica a leveduras, provocando alterações morfológicas. Estas características foram já descritas para outras ureases e também identificadas para a PmUreβ. As subunidades γ e β da PMU são capazes de ativar o sistema imune do inseto Rhodnius prolixus e quando testadas em Dysdercus peruvianus, PmUreβ apresentou maior toxicidade que as subunidades recombinantes γ e α quando administrados por via oral a este inseto. A atividade de agonista da PMU acredita-se que seja devido à porção contida na PmUreβ identificada como uma duplicação gênica entre a PmUreβ e a urease de Canavalia ensiformis (JBU) correspondente à porção α na PMU. A atividade entomotóxica da JBU é devido à liberação do polipeptídeo jaburetox (Jbtx) após hidrólise da JBU por enzimas do tipo catepsina. A PMU e sua subunidade β apresentam um overlap de toxicidade com o Jbtx, devido à existência de uma duplicação gênica entre as sequências de nucleotídeos do Jbtx e da PmUreβ. Outro fator determinante para a toxicidade apresentada pela PmUreβ seria a perda de estrutura quando em solução, conforme descrito para o Jbtx, foi classificado como uma proteína intrinsicamente desordenada capaz de interagir com lipídios presentes na membrana celular alterando a permeabilidade da mesma, sugerindo a interação Jbtx-membrana como base para sua entomotoxicidade. Visando investigar esta interação, foram analisadas soluções contendo Jbtx em presença de modelos de membrana artificiais. Quando em presença de micelas compostas por SDS, Jbtx teve um aumento de estruturas secundária e terciária. Em presença de vesículas e bicelas, o polipeptídeo apresentou uma pequena alteração estrutural nas porções N e C-terminal. Nossos resultados sugerem que o Jbtx é capaz de ancorar-se à membrana celular de insetos, devido uma interação com os lipídios presentes na mesma, de modo a facilitar seu contato com um alvo específico presente na membrana plasmática.Ureases are moonlighting proteins, with poorly structure-activity mapping properties characterized. Urease from Proteus mirabilis (PMU) is an important virulence factor for this bacteria. PMU is a trimeric protein in which each monomer is composed by three structural subunits: PmUreα, PmUreβ and PmUreγ. In this work, we identified that PMU acts as an agonist, promoting platelet aggregation and was shown to be toxic against yeasts causing morphological alterations, the same characteristics observed for PmUreβ and already described for other ureases. PmUreγ and PmUreβ subunits are able to activate the immune system of the insect Rhodnius prolixus. In addition, when tested against Dysdercus peruvianus, PmUreβ showed higher toxicity to this insect than the recombinant subunits α or γ if administered orally. The agonist activity of PMU is due to a portion of intragenic duplication at PmUreβ, this duplication was found between ureB and Canavalia ensiformis (JBU) gene corresponding to a subunit from PMU. Entomotoxic activity of JBU is mainly due to a polypeptide release, this polypeptide is called jaburetox (Jbtx), after urease hydrolysis by cathepsin-like enzymes. Both PmUreβ and Jbtx present regions of intragenic duplication, which seem to be an explanation for the toxicity of PMU and Jbtx overlap. A second issue is that PmUreβ looses its structure when in solution, the same characteristic described for Jbtx that is an intrinsically disordered polypeptide able to interact with lipids present on cellular membranes. That interaction alters its permeability hinting to a role of Jbtx-membrane interaction as the basis for its toxicity. Intending to investigate the interaction between Jbtx and cellular membranes we performed experiments of Jbtx in presence of artificial membranes (micelles, large unilamellar vesicles - LUVs, and bicelles). The polypeptide when in presence of SDS micelles had an increase of its secondary and tertiary structures. When Jbtx interacted with LUVs, and bicelles as well, the polypeptide presented a slight change of structure at its terminal regions. Our results suggest that Jbtx could anchor to the cellular membrane by an interaction with lipids in order to facilitate its interaction with a membrane-bound target present at the plasma membrane