Analysis of NPF and NRT transporter families regarding the nitrate nutrition in maritime pine (Pinus pinaster)

Nitrogen is an essential element for life and the main limiting nutrient for plant growth and development1. The main forms of inorganic nitrogen in soils are nitrate and ammonium, which relative abundances depend on environmental conditions such as temperature. In agricultural soils the most abundant nitrogen form is nitrate because the use of chemical fertilizers however in natural ecosystems nitrogen soil composition can be more complex. Conifers are tree gymnosperms with a wide distribution although their large forests dominate the boreal ecosystems where nitrification is limited and ammonium is the main nitrogen soil source2. In this context, conifers have an appreciable tolerance to ammonium. Maritime pine (Pinus pinaster Aiton) is a conifer from the western Mediterranean region of high economic and ecological interest in Spain, France and Portugal. This pine is also a research model tree with different genomic resources such as a reference transcriptome and a gene expression atlas3. Taking advantage of these resources the members of the NPF and NRT transporter families involved in nitrate uptake and transport have been identified and analyzed in maritime pine4. Among the transporter families, the NRT3 one is expanded and composed by six members. The capacity of maritime pine to use nitrate or ammonium has been analyzed in seedlings. The development and growth responses to nitrate nutrition are comparable to ammonium supply. At molecular level, there are strong gene expressions for genes involved in nitrate uptake and assimilation such as Nitrate Reductase, Nitrite Reductase, Glutamine Synthetase 1a, three NRT3 genes and different NPF family members in the different organs. Since the NPF proteins can transport different metabolites, peptides and hormones, the NPF transporters involved in nitrate transport are being identified.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. This project was supported by the grant MicroNUpE, BIO2015-73512-JIN; MINECO/AEI/FEDER, UE. JMVM was supported by a grant from the Spanish Ministerio de Educación y Formación Profesional (FPU17/03517) and FO by a grant from the Universidad de Málaga (Programa Operativo de Empleo Juvenil vía SNJG, UMAJI11, FEDER, FSE, Junta de Andalucía)

Transcriptomics of ammonium nutrition in the conifer Pinus pinaster Aiton

Nitrogen is an important element for all living beings because it is part of macromolecules as significant as nucleic acids or amino acids. For plants, it constitutes a limiting factor in their growth and development1 due to their low natural availability in soils thus limiting primary production in ecosystems2. Conifers are a group of gymnosperm plants that form large forest extensions of vegetation, being the main constituents of forests in boreal ecosystems3 where ammonium is the main source of inorganic nitrogen4. Due to the characteristics of the soils in which conifers usually grow, these plants have developed a high tolerance to the presence of ammonium, which may constitute their main source of inorganic nitrogen5. The maritime pine (Pinus pinaster Aiton) is a conifer that has a wide distribution in the western Mediterranean area and has been widely used in reforestation, soil stabilization tasks and industrially. In recent years, maritime pine has been the subject of multiple omic studies that have resulted in the acquisition of important tools and resources6,7. The present work is focused on the analysis of the ammonium uptake and management efficiency, and its relationship with the biomass accumulation in maritime pine. For this purpose, several experiments have been developed in which pine seedlings have undergone different levels of ammonium nutrition, both in the short and long term. As a result of short-term experiments, the characterization of transcriptomic response to the process of ammonium nutrition (uptake and assimilation) is being studied at mRNA, lncRNA and miRNA level in roots. In relation to long-term experiments, ten different provenances of maritime pine seedlings were treated with different ammonium levels and the biomass changes were measured. The results obtained suggest the existence a certain phenotypic plasticity grade for this conifer.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. This project was supported by a grant form the Spanish Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MicroNUpE, BIO2015-73512-JIN; MINECO/AEI/FEDER, UE). FO was supported by a grant from the Universidad de Málaga (Programa Operativo de Empleo Juvenil vía SNJG, UMAJI11, FEDER, FSE, Junta de Andalucía) and JMVM by a grant from the Spanish Ministerio de Educación y Formación Profesional (FPU17/03517

An unexpected actor in ammonium assimilation in conifer trees

Conifers are tree species with enormous environmental and economic interests but with several characteristics that complicate their investigation (big size, secondary compounds, large long-life cycles, megagenomes…). However, they are well adapted to ammonium-rich soils being a good model to study ammonium assimilation in plants. Although they have a special feature, only two glutamine synthetase (GS, EC 6.3.1.2) genes, GS1a and GS1b, coding for cytosolic proteins, have been identified. In angiosperms and in the gymnosperm Ginkgo biloba there are two types of this enzyme responsible of the ammonium assimilation: GS1 expressed in the cytosol and GS2 in the plastids. Until the date, the searches of new GS1 and GS2 genes in conifers have been made with classical biochemical and molecular biology techniques without satisfactory results. In the present context, the emergence of the next generation sequencing (NGS) techniques has open new opportunities in the resolution of old problems. They have allowed the whole sequencing of the massive conifer genomes and the analysis of their transcriptomes. Thus, in the framework of the European project ProCoGen, a gene expression atlas of the tissues of one-month seedlings was carried out using laser capture microdissection (LCM) and massive sequencing in maritime pine (Pinus pinaster), which is a conifer tree from the Southwestern Mediterranean region1. From the analysis of this work, a new gene coding for a new putative cytosolic GS has been identified, PpGS1c. 1Cañas, RA et al. (2017). Plant J, 91. 1064-1087Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. Project funding by Ministerio de Economía y Competitividad BIO2015-69285-R and MicroNUpE (BIO2015-73512-JIN; MINECO/AEI/FEDER, UE

Nuevas aproximaciones a la asimilación del amonio en la conífera Pinus pinaster

Comunicación oralLas coníferas son plantas bien adaptadas a crecer en suelos con considerables cantidades de amonio. Por este motivo son un buen modelo de estudio de la asimilación de amonio en plantas. El pino marítimo (Pinus pinaster Aiton) es una especie de conífera autóctona del Mediterráneo occidental con gran importancia medio ambiental y económica. En el marco del proyecto europeo ProCoGen se realizó un atlas trasncriptómico de los tejidos de plántulas de un mes de pino marítimo mediante el uso de microdisección por captura con láser (LCM)1. El análisis de este atlas de expresión génica ha permitido la caracterización de los genes implicados en metabolismo nitrogenado en plántulas de pino marítimo y la identificación de nuevos genes con expresión baja o muy localizada. Entre estos se encuentra un gen codificante para una glutamina sintetasa citosólica no conocida hasta el momento (PpGS1c). Cuando se realizan búsquedas tanto en la base de datos transcriptómica de pino marítimo como en los ensamblajes de los genomas de diferentes coníferas no se identifican GS de tipo plastidial pero sí las respectivas GS1c al igual que el resto de GS citosólicas de coníferas (GS1a y GS1b). La GS1c en pino marítimo presenta una expresión especialmente baja y muy localizada tanto en el meristemo apical como en el meristemo radicular. Al estudiar su promotor se encuentran posibles sitios de unión de factores de transcripción reguladores de la expresión génica en zonas en desarrollo. En paralelo al estudio de este gen se está desarrollando un estudio transcriptómico para identificar y caracterizar funcionalmente los genes implicados en la absorción y asimilación del amonio, y en la regulación de ambos procesos. Para ello se están realizando experimentos de nutrición amoniacal en los que se obtienen muestras de diferentes tejidos de la raíz utilizando la técnica de LCM.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. Financiación: Proyectos del Ministerio de Economía y Competitividad BIO2015-69285-R y MicroNUpE (BIO2015-73512-JIN; MINECO/AEI/FEDER, UE)

Análisis transcriptómico de la eficiencia en la captación de nitrógeno y la producción de biomasa en pino marítimo (Pinus pinaster)

PanelLas coníferas son un grupo de plantas gimnospermas que forman extensos bosques, principalmente en el hemisferio norte1, por lo que presentan importantes contribuciones ecológicas y económicas. Debido al tipo de suelos en los que suelen crecer las coníferas, estas plantas han desarrollado una gran tolerancia al amonio, muchas coníferas son capaces de usarlo como su principal fuente de nitrógeno inorgánico2. El pino marítimo (Pinus pinaster Aiton) es una conífera distribuida por el Mediterráneo occidental que ha sido utilizada en tareas de reforestación, estabilización de suelos e industrialmente para la obtención de madera y resina. En los últimos años, esta conífera ha sido objeto de múltiples estudios genéticos y ómicos, obteniéndose importantes herramientas para su estudio3. En el presente trabajo se pretende analizar la eficiencia en la captación de amonio y su relación con la producción de biomasa. Para ello se están desarrollando experimentos en los que se someten a plántulas de pino marítimo a diferentes niveles de nutrición amoniacal tanto a corto como a largo plazo. A partir de estos experimentos se quiere estudiar la respuesta génica de estas plantas a la nutrición amoniacal, la captación, su asimilación y la regulación de ambos procesos. El proyecto se centra en la respuesta que presenta la zona de desarrollo de la raíz, diferenciando los distintos tejidos que se pueden encontrar en ella mediante el uso de la técnica de microdisección por captura láser (LCM). Finalmente, el transcriptoma de estas muestras será analizado mediante RNA-Seq.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.Financiación: Proyectos del Ministerio de Economía y Competitividad BIO2015-69285-R y MicroNUpE (BIO2015-73512-JIN; MINECO/AEI/FEDER, UE). Francisco Ortigosa ha realizado el trabajo contratado por el Programa Operativo de Empleo Juvenil vía SNJG (UMAJI11)

Study of the NPF and NRT transporter families in the conifer Pinus pinaster

Nitrogen, in natural environments, is the main limiting nutrient for plant growth and development1. This essential element can be presented in different forms in the soils being the two main forms nitrate and ammonium, although the relative abundance of these compounds depends on environmental conditions. In plants, nitrate uptake and transport involve the function of specific transporters, mainly of the NRT and NPF families. Genes encoding these transporters have been well studied in crop plants since in agricultural soils nitrate has become the predominant nitrogen compound as a result of the intensive use of fertilizers2. However, in soils of the large conifer forests dominating the boreal ecosystems, ammonium is the main source of inorganic nitrogen due to the limited nitrification process3. Consequently, conifers have been told to have a preference for ammonium over nitrate and only limited information is available about nitrate transporters in these gymnosperms. Maritime pine (Pinus pinaster Aiton) is a conifer tree with a wide distribution in the western Mediterranean region and with a great morphological and physiological plasticity. This pine also has a good resistance to abiotic stress4. In maritime pine, the genomic resources have been improved in the last few years5 allowing the identification and molecular analysis of members of the NRT and NPF gene families6. Growth and development responses have been compared on pine seedlings cultured under different nitrate and ammonium supplies. Gene expression have been analyzed and the results show a strong expression of different genes related with the uptake, transport and assimilation of nitrate in plants such as nitrate and nitrite reductases, glutamine synthetase and some genes from the NRT and NPF families, suggesting they are involved in nitrate acquisition from soil.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. This project was supported by the grant MicroNUpE, BIO2015-73512-JIN; MINECO/AEI/FEDER, UE. JMVM was supported by a grant from the Spanish Ministerio de Educación y Formación Profesional (FPU17/03517) and FO by a grant from the Universidad de Málaga (Programa Operativo de Empleo Juvenil vía SNJG, UMAJI11, FEDER, FSE, Junta de Andalucía)

Determinación de parámetros cinéticos de una nueva glutamina sintetasa en Pinus pinaster

PanelEn las plantas, la glutamina sintetasa (GS, EC 6.3.1.2) es una enzima fundamental en el metabolismo del nitrógeno, siendo la responsable de la incorporación del nitrógeno inorgánico en las moléculas, catalizando la condensación de amonio y glutamato para producir glutamina con gasto de ATP1. Dentro de las gimnospermas, las coníferas conforman el grupo más importante. Constituido por plantas leñosas, es un grupo de gran interés comercial y ecológico2. En coníferas, con las técnicas moleculares clásicas únicamente se había detectado la expresión de dos isoformas citosólicas de esta enzima: GS1a y GS1b. La GS2 (isoforma plastidial), a pesar de encontrarse en angiospermas y en la gimnosperma Ginkgo biloba, no se ha detectado funcionalmente en coníferas2. En la base de datos ProCoGen que incluye el transcriptoma de Pinus pinaster, y que ha sido desarrollada por nuestro grupo3, se ha descubierto un gen que codifica para una nueva isoforma citosólica que denominamos, PpGS1c. La proteína ha sido expresada de forma recombinante en Escherichia coli con His-Tag en su extremo N-terminal que se ha usado para su purificación. Las propiedades físico-químicas y los parámetros cinéticos de GS1c han sido determinados a partir de la proteína recombinante purificada.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. Financiación: Proyectos del Ministerio de Economía y Competitividad BIO2015-69285-R y MicroNUpE (BIO2015-73512-JIN; MINECO/AEI/FEDER, UE). José Miguel Valderrama-Martín ha sido apoyado por una beca de la Universidad de Málaga (Ayudas para la iniciación a la investigación. Plan Propio de Investigación, Nº 201800200000776)

Implementing Associations among Classes in an Environment of Active Databases

The association is a native concept from relational databases, one that has been adapted to object oriented (OO) modelling. It is an interesting operator used to describe links among objects of a system, commonly included in the most popular diagram-based OO methodologies. However, those methodologies sometimes present a lack of formality that may undermine its use. In this paper we formalize the semantics of associations. Firstly, we will describe an OO model based on different kinds of constraints. Some of them will be especially useful for describing the semantics of associations. Finally, we will present some remarks about implementation by means of triggers, a new feature incorporated in databases to specify an inner active behavior.Comisión Interministerial de Ciencia y Tecnología TIC97-0593-C05-0

Métodos de secuenciación de ácidos nucleicos: Primera generación

Genome sequencing, since the discovery of DNA as a molecule that carries inheritable genetic informa- tion, has been gaining importance due to the large amount of information that provides and its usefulness in different fields of science.  This article begins  a series that reviews nucleic acid sequencing methods. The   first sequencing methods allowed the fundamental advancement of Molecular Biology, opened the doors for the development of new sequencing technologies and started the development of new scientific disciplines  that today have great repercussions such as Genomics and Transcriptomics.La secuenciación de genomas, desde el descubrimiento del ADN como molécula portadora de la infor- mación genética heredable, ha ido ganando importancia debido a la gran cantidad de información que aporta y a la utilidad de esta en diferentes campos de la ciencia. Con este artículo se inicia una serie en la que se revisan los métodos de secuenciación de ácidos nucleicos. Los primeros métodos de secuenciación permitieron el avance fundamental de la Biología Molecular, abrieron las puertas para el desarrollo de nuevas tecnologías de secuenciación e iniciaron el desarrollo de nuevas disciplinas científicas que hoy tienen gran repercusión como son la Genómica y la Transcriptómica

Métodos de secuenciación: tercera generación

The first techniques for massive sequencing of nucleic acids (2nd generation) have allowed an extraordi- nary development of Genomics and its «democratization». However, they present a series of weaknesses, mainly their inability to generate readings greater than 1 kb and the need for prior amplification of the samples. In recent years, so-called third-generation sequencing techniques have appeared, alleviating some of the shortcomings of previous technologies. On the one hand, they average read size reaches 30 kb, with maximums of 2.3 Mb in a read On the other hand, they do not need prior amplification of the nucleic acid samples, so the epigenetic marks that they may present are not lost. In addition, these third generation sequencing techniques can also perform direct sequencing of RNA, which is not possible with the preceding techniques. Thus, they point to a new path in nucleic acid sequencing, setting a new precedent in genomic science development unknown until now.Las primeras técnicas de secuenciación masiva de ácidos nucleicos (2.ª generación) han permitido un extraordinario desarrollo de la Genómica y su «democratización». Sin embargo, presentan una serie de flaquezas, principalmente su incapacidad para generar lecturas mayores de 1 kb y la necesidad de amplificación previa de las muestras. En los últimos años se han desarrollado las denominadas como técnicas de secuenciación de tercera generación, las cuales han venido a paliar algunos de los defectos de las tecnologías precedentes. Por un lado, estas técnicas permiten obtener tamaños medios de lecturas de 30 kb, con máximos de 2,3 Mb. Por otro lado, no necesitan amplificación previa de las muestras de ácidos nucleicos, por lo que no se pierden las marcas epigenéticas que puedan presentar. Además, estas técnicas de tercera generación realizan la secuenciación directa del ARN, algo que no es posible con las técnicas precedentes. Así mismo, abren un nuevo camino en la secuenciación de ácidos nucleicos, sentando un nuevo precedente en el desarrollo de las Ciencias Genómicas hasta ahora desconocido