Evolution of cell populations in vitro: peculiarities, driving forces, mechanisms and consequences

This review outlines the major features and distinctions of cell populations, types and directions of selection in such populations. Population-genetic basis for cell adaptation to growth conditions in vitro is elucidated; in particular, peculiarities of genome evolution in the course of cell dedifferentiation and further cell adaptation to growth conditions in passaged culture are evaluated. Main factors of variation and selection in cell populations in vitro, influence of growth conditions on structure of cell populations and some regularities of cultured cells and regenerated plants are considered. Details of creation of stable cell lines-producers of biologically active substances are presented. Views and suppositions of author resulting from analysis of both literature data and own multiyear studies on cell population genetics are set forth. Among others are substantiated such key statements: cell culture in vitro presents dynamically-heterogeneous biological system, clone population, which is developing (evolving) as a result of major driving factors of evolution – variation, heredity, selection and drift of genes (genotypes); interaction between these processes determines the biological characteristics of each particular cell line grown in specific conditions; in adaptation of cells to growth conditions in vitro one can single out three periods: the initial population of isolated cells, the period of strain (cell line) formation and the established strain. The division into periods is determined by the type, direction and intensity of «natural» selection that acts in cell population. The formed (adapted to growth in vitro) strains are genetically heterogeneous, they are characterized by the presence of physiological and genetic homeostasis, which are mostly caused by the action of stabilizing selection; cultured cells of higher plants are able to synthesize practically all classes of secondary (specialized) compounds (alkaloids, steroids, terpenoids, etc.); any somatic cell with living (functionally active) nucleus during its isolation and further cultivation in tissue culture, as a result of the process of «somaclonal» variability occurring according to the N. I. Vavilov’s law of homologous series in hereditary variability, can restore in it’s descendants, including regenerated plants, the entire genetic polymorphism (or at least a significant part of it) characteristic of the plant’s species and may be even it’s genus. This provides an opportunity to preserve and restore the natural polymorphism in cultured cells and tissues in vitro.Розглянуто основні ознаки та відмінності клітинних популяцій, типи і напрями дії добору у таких популяціях. Висвітлено популяційно-генетичні основи адаптації клітин до умов росту in vitro, зокрема, проаналізовано особливості еволюції геному в процесі дедиференціювання клітин та подальшої адаптації їх до умов росту в пересадній культурі. Обговорено головні чинники мінливості та добору в клітинних популяціях in vitro, вплив умов вирощування на структуру клітинних популяцій та деякі закономірності мінливості культивованих клітин і рослин-регенерантів. Наведено особливості створення стабільних клітинних ліній – продуцентів біологічно активних речовин. Викладено погляди і припущення автора, сформовані в результаті аналізу як літературних даних, так і багаторічних власних досліджень з генетики клітинних популяцій. Серед низки інших обгрунтовано такі ключові положення: 1) культура клітин in vitro є динамічно-гетерогенною біологічною системою – клоновою популяцією, яка розвивається (еволюціонує) в результаті дії основних рушійних чинників еволюції – мінливості, спадковості, добору і дрейфу генів (генотипів); взаємодія цих процесів зумовлює біологічні особливості кожної конкретної клітинної лінії, що вирощується за конкретних умов. 2) У процесі адаптації клітин до умов росту in vitro виявляються три періоди: первинної популяції ізольованих клітин, становлення штаму (клітинної лінії), сформованого штаму; поділ на періоди визначається типом, напрямом та жорсткістю «природного» добору, що діє в клітинній популяції; сформовані (адаптовані до росту in vitro) штами є генетично гетерогенними, для них характерна наявність фізіологічного і генетичного гомеостазу, що визначається здебільшого дією стабілізуючого добору. 3) Культивовані клітини вищих рослин здатні до синтезу практично усіх класів сполук вторинного (спеціалізованого) обміну (алкалоїди, стероїди, терпеноїди та ін.). Будь-яка соматична клітина з живим (функціонально активним) ядром при її ізолюванні та подальшому вирощуванні за умов культури тканин внаслідок процесів «сомаклональної» мінливості, що відбуваються в рамках закону гомологічних рядів у спадковій мінливості М. І. Вавилова, може відновити у своїх нащадках, у тому числі серед рослин-регенерантів, увесь генетичний поліморфізм (або, принаймні, значну його частину), властивий даному виду, та, ймовірно, навіть і роду рослин. Це відкриває можливість збереження і відновлення природного поліморфізму в культурі клітин і тканин in vitro.Рассмотрены основные признаки и отличия клеточных популяций, типы и направления действия отбора в таких популяциях. Освещены популяционно-генетические основы адаптации клеток к условиям роста in vitro, в частности, проанализированы особенности эволюции генома в процесссе дедифференцирования клеток и последующей адаптации их к условиям роста в пересадной культуре. Обсуждены главные факторы изменчивости и отбора в клеточных популяциях in vitro, влияние условий выращивания на структуру клеточных популяций и некоторые закономерности изменчивости культивированных клеток и растений-регенерантов. Приведены особенности создания стабильных клеточных линий – продуцентов биологически активных веществ. Изложены взгляды и предположения автора, сформированные в результате анализа как литературных данных, так и многолетних собственных исследований по генетике клеточных популяций. Среди прочего обоснованы следующие ключевые положения: 1) культура клеток in vitro является динамично-гетерогенной биологической системой – клоновой популяцией, развивающейся (эволюционирующей) в результате действия основных движущих факторов эволюции – изменчивости, наследственности, отбора и дрейфа генов (генотипов); взаимодействие этих процессов обусловливает биологические особенности каждой конкретной клеточной линии, выращиваемой в конкретных условиях. 2) В процессе адаптации клеток к условиям роста in vitro выявляются три периода: первичной популяции изолированных клеток, становления штамма (клеточной линии), сформированного штамма; разделение на периоды определяется типом, направлением и жесткостью «природного» отбора, действующего в клеточной популяции; сформированные (адаптированные к росту in vitro) штаммы являются генетически гетерогенными, для них характерно наличие физиологического и генетического гомеостаза, что обусловлено в основном действием стабилизирующего отбора; 3) Культивированные клетки высших растений способны к синтезу практически всех классов соединений вторичного (специализированного) обмена (алкалоиды, стероиды, терпеноиды и др.). Любая соматическая клетка с живым (функционально активным) ядром при ее изолировании и последующем выращивании в условиях культуры тканей вследствие процессов «сомаклональной» изменчивости, происходящих в рамках закона гомологичных рядов в наследственной изменчивости Н. И. Вавилова, может восстановить в своих потомках, в том числе среди растений-регенерантов, весь генетический полиморфизм (или, в крайнем случае, значительную его часть), присущий данному виду, и, вероятно, даже и роду растений, что открывает возможность сохранения и восстановления природного полиморфизма в культуре клеток и тканей in vitro

Введення в культуру in vitro півників низьких (Iris pumila L.)

Conditions for efficient germination of Iris pumila L. seeds were described. Tissue culture and plants of this species were obtained in vitro. The explants of root origin were found to be able to produce callus on the Murashige and Skoog medium with half content of macro- and micronutrients supplemented with 0.1 mg/L 6-benzylaminopurine and 0.5 mg/L 2, 4-Dichlorophenoxyacetic acid. Conditions for growth of I. pumila plants in greenhouse with a view to their further reintroduction into natural environments were specified.Описано умови для ефективного проростання насіння Iris pumila L. Отримано рослини in vitro та культуру тканин цього виду. Встановлено, що експланти кореневого походження здатні формувати калус на середовищі Мурасіге–Скуга з половинним вмістом макро- та мікросолей, доповненому 0,1 мг/л 6-бензиламінопурину та 0,5 мг/л 2,4-дихлорфеноксіоцтової кислоти. Підібрано умови для росту рослин I. pumila в умовах закритого ґрунту з метою реінтродукції в природне середовище

Genome variability of some Gentiana L. species in nature and in culture in vitro: RAPD-analysis

Aim. Investigation of intraspecies and somaclonal variability of G. acaulis, G. cruciata and G. punctata. Methods. Random amplified polymorphic DNA-polymerase chain reaction (RAPD-PCR), gel-electrophoresis. Results. It was established a species specificity for indicators of gentians genetic heterogeneity – the proportion of polymorphic amplicons and genetic distances. A level of intraspecies variation decreased in the direction of G. acaulis > G. punctata > G. cruciata. Changes in gentians tissue culture by the proportion of polymorphic amplicons were shown to vary within the range of 10–15 % and failed to extend beyond the intraspecies variation. Conclusions. Genome variation of G. acaulis, G. cruciata and G. punctata was studied through the use of RAPD-PCR. The gentians were found to be characterized by different variability in both nature and culture in vitro. In the tissue culture there were discovered considerably smaller number changes as compared to intraspecies variation.Мета. Дослідити внутрішньовидову та сомаклональну мінливість Gentiana acaulis, G. cruciata та G. punctata. Методи. Полімеразна ланцюгова реакція з праймерами довільної послідовності (RAPD- ПЛР), гель-електрофорез. Результати. Виявлено видоспецифічність показників генетичної гетерогенності тирличів – відсотка поліморфних ампліконів і генетичних відстаней. Рівень внутрішньовидової мінливості зменшується у напрямку G. acaulis > G. punctata > G. cruciata. Показано, що зміни в культурі тканин тирличів за вмістом поліморфних ампліконів лежать у діапазоні 10– 15 % і не виходять за межі внутрішньовидової варіабельності. Висновки. Методом RAPD-ПЛР досліджено геномну мінливість G. acaulis, G. cruciata та G. punctata. Встановлено, що тирличі характеризуються різною варіабельністю як у природі, так і в культурі in vitro. У культурі тканин виявлено зміни, які значно менші порівняно з внутрішньовидовою мінливістю.Цель. Исследовать внутривидовую и сомаклональную изменчивость Gentiana acaulis, G. cruciata и G. punctata. Методы. Полимеразная цепная реакция с праймерами произвольной последовательности (RAPD-ПЦР), гель-электрофорез. Результаты. Обнаружена видоспецифичность показателей генетической гетерогенности горечавок – процента полиморфных ампликонов и генетических расстояний. Уровень внутривидовой изменчивости уменьшается в ряду G. acaulis > G. punctata > G. cruciata. Показано, что изменения в культуре тканей горечавок по содержанию полиморфных ампликонов лежат в диапазоне 10– 15 % и не выходят за границы внутривидовой вариабельности. Выводы. Методом RAPD-ПЦР исследована геномная изменчивость G. acaulis, G. cruciata и G. punctata. Установлено, что горечавки характеризуются различной вариабельностью как в природе, так и в культуре in vitro. В культуре тканей обнаружены значительно меньшие изменения по сравнению с внутривидовой изменчивостью

The influence of some environmental factors on cytological and biometric parameters and chlorophyll content of Deschampsia antarctica Desv. in the maritime Antarctic

Under the environmental conditions of the Point Thomas Oasis (King George Island, the South Shetland Islands), we studied the influence of month-long artificial treatment with fresh water, salt water, and guano solution on the biometric characteristics, chlorophyll content, as well as the nuclear area of leaf parenchymal cells and nuclear DNA content, in a maritime Antarctic aboriginal plant Deschampsia antarctica. The modeled factors induced an increase in the generative shoot height and the length of the largest leaf, but did not influence the number of flowers. Treatment with guano caused an increase in the chlorophyll a and b contents, while fresh water treatment only led to some increase in chlorophyll a. Fluctuations of physiologically significant traits, such as the nuclear area and DNA content in the leaf parenchyma cells of D. antarctica, have been traced under the influence of the studied factors. Understanding of the hierarchy of influence of these factors as well as and sensitivity of plants of this species to external agents require further investigation.В условиях оазиса Поинт Томаса (остров Короля Георга, Южные Шетлендские острова) было изучено влияние искусственной обработки в течение месяца пресной, морской водой и раствором гуано на биометрические показатели, содержание хлорофиллов, а также площадь ядра паренхимных клеток листка и содержание ядерной ДНК в них у растений аборигенного вида Прибрежной Антарктики – antarctica. Искусственное влияние факторов окружающей среды вызвало увеличение высоты генеративного побега и длины наибольшего листа, но не влияло на количество цветков. Обработка раствором гуано увеличивала содержание хлорофиллов a и b, а пресной водой – только содержание хлорофилла a. Выявлены признаки флуктуации физиологически значимых параметров: площади ядра и содержания ДНК клеток паренхимы листа D. antarctica, для выяснения иерархии которых, а также степени чувствительности к внешним факторам требуются более детальные исследования.В умовах оази Поінт Томаса (острів Короля Георга, Південні Шетлендські острови) було вивчено вплив штучної обробки протягом місяця прісною, морською водою та розчином гуано на біометричні показники, вміст хлорофілів, а також площу ядра паренхімних клітин листка та вміст ядерної ДНК в них, у рослин аборигенного виду Прибережної Антарктики – antarctica. Штучний вплив факторів довкілля викликав збільшення висоти генеративного пагону та довжини найбільшого листка, але не впливав на кількість квіток. Обробка розчином гуано збільшувала вміст хлорофілів a та b, а прісною водою – тільки вміст хлорофілу a. Виявлено ознаки флуктуації фізіологічно-значущих параметрів: площі ядра та вмісту ДНК клітин паренхіми листка D. antarctica, з’ясування ієрархії яких, а також ступеню чутливості до зовнішніх факторів потребує детальнішого дослідження

Establishment and analysis of tissue and fast-growing normal root cultures of four Gentiana L. species, rare highland medicinal plants

Aim. To obtain tissue and isolated root cultures of four Gentiana L. species from Ukraine (G. lutea L., G. punctata L., G. acaulis L. and G. asclepiadea L.) and study peculiarities of their growth and content of flavonoids and xanthones. Methods. In vitro culture, chromatography, spectrophotometry and statistical methods. Results. The conditions were developed for callus induction, proliferation, and long-term maintenance of fast-growing root cultures from gentians. A comparative study of total flavonoid and xanthone content in the cultured tissues, isolated cultured roots and wild plants of gentians was carried out. The capacity was ascertained for synthesizing these biologically active substances in vitro. The content of compounds varied both in calli and isolated roots derived from the plants of different gentian species, and in tissue and organ cultures of these species. The morphogenic and non-morphogenic cultures showed much lower flavonoid and xanthone content than the shoots of intact plants, but similar to that of natural roots. The fast-growing normal root cultures displayed higher concentrations of these biologically active compounds than the callus tissues in most cases. Conclusions. A high yield of biomass from gentian cultures in vitro and their ability to synthesize and accumulate flavonoids and xanthones make them as a promising source of these biologically active compounds.Мета. Отримання культури тканин та ізольованих коренів чотирьох видів Gentiana L. флори України (G. lutea L., G. punctata L., G. acaulis L. і G. asclepiadea L.), а також дослідження особливостей їхнього росту і вмісту флавоноїдів та ксантонів. Методи. Культивування in vitro, хроматоспектрофотометричні і статистичні методи. Результати. Розроблені умови для індукції і проліферації калюсів, а також тривалого культивування швидкорослих культур коренів тирличів. Проведено порівняльні дослідження загального вмісту флавоноїдів і ксантонів у калюсах, культурах ізольованих коренів та дикорослих рослинах тирличів. Встановлено здатність культур до синтезу цих біологічно активних речовин in vitro. Кількість таких сполук варіювала як у калюсах і культурах ізольованих коренів, отриманих з рослин різних видів тирличів, так і в культурах тканин й органів, отриманих з різних рослин одного виду. Вміст флавоноїдів і ксантонів у морфогенних і неморфогенних культурах був значно нижчий, ніж у пагонах, але більший або близький до такого в коренях інтактних рослин. Швидкоросла культура коренів у більшості випадків характеризувалася вищою концентрацією цих біологічно активних сполук, ніж калюс. Висновок. Високий вихід біомаси культур in vitro тирличів та їх здатність синтезувати і накопичувати флавоноїди та ксантони дозволяють розглядати їх як перспективне джерело цих біологічно активних сполук.Цель. Получение культуры тканей и изолированных корней четырех видов Gentiana L. флоры Украины (G. lutea L., G. punctata L., G. acaulis L. и G. asclepiadea L.), а также исследование особенностей их роста и содержания флавоноидов и ксантонов. Методы. Культивирование in vitro, хроматоспектрофотометрические и статистические методы. Результаты. Разработаны условия для индукции и пролиферации каллусов, а также длительного культивирования быстрорастущих культур корней горечавок. Проведены сравнительные исследования общего содержания флавоноидов и ксантонов в каллусах, культурах изолированных корней и дикорастущих растениях горечавок. Установлена способность культур к синтезу этих биологически активных веществ in vitro. Количество таких соединений варьировало как в каллусах и культурах изолированных корней, полученных из растений различных видов горечавки, так и в культурах тканей и органов, полученных из различных растений одного вида. Содержание флавоноидов и ксантонов в морфогенных и неморфогенных культурах было значительно ниже, чем в побегах, но больше или близкое к таковому в корнях интактных растений. Быстрорастущая культура корней в большинстве случаев характеризовалась высшей концентрацией этих биологически активных соединений, чем каллус. Выводы. Высокий выход биомассы культур in vitro горечавок, а также их способность синтезировать и накапливать флавоноиды и ксантоны, позволяют рассматривать их как перспективный источник этих биологически активных веществ

New forms of chromosome polymorphism in Deschampsia antarctica Desv. from the Argentine islands of the Maritime Antarctic region

Cytogenetic analysis of D. antarctica plants from the Argentine Islands of the Maritime Antarctic region was performed. Chromosome number 2n = 26 was determined for most of the samples. New forms of chromosome polymorphism for the species were demonstrated for the first time. In particular, the plants from Darboux Island were found, to have some cells that contained one supernumerary B-chromosome along with 26 chromosomes of a regular set. The plants from Great Yalour Island were determined to be mixoploid – the number of chromosomes ranged from 13 to 39. The occurrence of new and unknown earlier karyotypic forms of D. antarctica might have resulted from increased genome instability due to the extreme environmental conditions in the Argentine Islands region.Проведено цитогенетичний аналіз рослин D. antarctica з регіону Аргентинських островів Прибережної Антарктики. Для більшості досліджених зразків встановлено хромосомне число 2n = 26. Вперше для виду показано нові форми хромосомної мінливості. Зокрема, в клітинах апікальної меристеми рослин з острова Дарбо, окрім 26 хромосом основного набору, виявлено одну додаткову В-хромосому. Для рослин з о. Великий Ялур показано наявність міксоплоїдії: розмах мінливості за числом хромосом становив від 13 до 39 хромосом. Поява нових, невідомих раніше форм хромосомної мінливості D. antarctica може бути наслідком підвищеної геномної нестабільності, зумовленої екстремальними умовами зростання в районі Аргентинських островів.Проведен цитогенетический анализ растений D. antarctica из региона Аргентинских островов Прибрежной Антарктики. Для большинства исследованных образцов установлено хромосомное число 2n = 26. Впервые для вида показаны новые формы хромосомной изменчивости. В частности, в клетках апекальной меристемы растений с острова Дарбо, кроме 26 хромосом основного набора, обнаружена одна дополнительная В-хромосома. Для растений с о. Большой Ялур показано наличие миксоплоидии: размах изменчивости по числу хромосом составлял от 13 до 39 хромосом. Появление новых, неизвестных ранее форм хромосомной изменчивости D. antarctica может быть следствием повышенной геномной нестабильности, обусловленной экстремальными условиями роста в районе Аргентинских островов

Genome variability of some Gentiana L. species in nature and in culture in vitro: RAPD-analysis

Aim. Investigation of intraspecies and somaclonal variability of G. acaulis, G. cruciata and G. punctata. Methods. Random amplified polymorphic DNA-polymerase chain reaction (RAPD-PCR), gel-electrophoresis. Results. It was established a species specificity for indicators of gentians genetic heterogeneity – the proportion of polymorphic amplicons and genetic distances. A level of intraspecies variation decreased in the direction of G. acaulis > G. punctata > G. cruciata. Changes in gentians tissue culture by the proportion of polymorphic amplicons were shown to vary within the range of 10–15 % and failed to extend beyond the intraspecies variation. Conclusions. Genome variation of G. acaulis, G. cruciata and G. punctata was studied through the use of RAPD-PCR. The gentians were found to be characterized by different variability in both nature and culture in vitro. In the tissue culture there were discovered considerably smaller number changes as compared to intraspecies variation.Мета. Дослідити внутрішньовидову та сомаклональну мінливість Gentiana acaulis, G. cruciata та G. punctata. Методи. Полімеразна ланцюгова реакція з праймерами довільної послідовності (RAPD- ПЛР), гель-електрофорез. Результати. Виявлено видоспецифічність показників генетичної гетерогенності тирличів – відсотка поліморфних ампліконів і генетичних відстаней. Рівень внутрішньовидової мінливості зменшується у напрямку G. acaulis > G. punctata > G. cruciata. Показано, що зміни в культурі тканин тирличів за вмістом поліморфних ампліконів лежать у діапазоні 10– 15 % і не виходять за межі внутрішньовидової варіабельності. Висновки. Методом RAPD-ПЛР досліджено геномну мінливість G. acaulis, G. cruciata та G. punctata. Встановлено, що тирличі характеризуються різною варіабельністю як у природі, так і в культурі in vitro. У культурі тканин виявлено зміни, які значно менші порівняно з внутрішньовидовою мінливістю.Цель. Исследовать внутривидовую и сомаклональную изменчивость Gentiana acaulis, G. cruciata и G. punctata. Методы. Полимеразная цепная реакция с праймерами произвольной последовательности (RAPD-ПЦР), гель-электрофорез. Результаты. Обнаружена видоспецифичность показателей генетической гетерогенности горечавок – процента полиморфных ампликонов и генетических расстояний. Уровень внутривидовой изменчивости уменьшается в ряду G. acaulis > G. punctata > G. cruciata. Показано, что изменения в культуре тканей горечавок по содержанию полиморфных ампликонов лежат в диапазоне 10– 15 % и не выходят за границы внутривидовой вариабельности. Выводы. Методом RAPD-ПЦР исследована геномная изменчивость G. acaulis, G. cruciata и G. punctata. Установлено, что горечавки характеризуются различной вариабельностью как в природе, так и в культуре in vitro. В культуре тканей обнаружены значительно меньшие изменения по сравнению с внутривидовой изменчивостью