Removal of pharmaceuticals from WWTP streams by biological and physical processes

Les actuals activitats humanes han comportat la contaminació del medi ambient, la qual cosa ha esdevingut una amenaça global. En concret, l'ineficient eliminació de productes d'ús diari a les plantes de tractament d'aigües residuals (EDARs) es una font de contaminació en si mateixa; especialment quan els llots no tractats i l'aigua resultant són valoritzats en activitats agrícoles. En el present treball s'han desenvolupat dues tècniques de bioremediació amb Trametes versicolor per tal de tractar diferents llots. A més a més, s'ha proposat i estudiat un post-tractament físic per tal d'incrementar la qualitat de l'efluent final d'una EDAR. En tots dos casos, l'eliminació de fàrmacs en cada corrent ha estat avaluada. En la primera secció, es va estudiar l'ús de Trametes versicolor en biopiles a escala de laboratori per tractar llots d'EDAR secs; tot avaluant la seva capacitat per eliminar fàrmacs i l'evolució de les comunitats microbianes. ·Es va escollir un substrat lignocel·lulosic per les biopiles inoculades amb el fong en base a la revisió de dades experimentals publicades i no publicades. ·Es va avaluar l'eliminació total de fàrmacs a concentració real en llots de depuradora tractats en biopiles inoculades i no inoculades amb el fong, provant si la re-inoculació de les biopiles milloraria l'eliminació final. ·L'estudi de les comunitats bacterianes i fúngiques de les biopiles inoculades i no inoculades amb el fong va mostrar que totes dues comunitats van acabar evolucionant cap a poblacions similars. En la segona secció, es va avaluar el creixement i la capacitat per eliminar fàrmacs de Trametes versicolor en llots provinents d'un reactor biològic de membrana (MBR) en sistemes de bioslurry. ·Es va avaluar la capacitat del fong per eliminar compostos en medis líquids dopats, provant diferents medis de cultiu i condicions. ·Es va avaluar l'eliminació d'un gran ventall de fàrmacs per part del fong en bioslurries no estèrils i no dopats. Les anàlisis microbiològics van demostrar un increment de la diversitat microbiana després de 15 dies de tractament. ·Es va incrementar l'escala dels bioslurries de Erlenmeyer a reactor de 5L i el seu corrent de sortida es va digerir anaeròbicament, per tal de comprovar si el tractament amb el fong podia ser re-valoritzat. ·Els resultats finals mostren que Trametes versicolor pot eliminar PPCPs en bioslurry en condicions no esterils. En la tercera secció, es va avaluar l'eliminació de fàrmacs en aigua sintètica mitjançant l'esmena de sòls amb adsorbents de baix cost, per tal de determinar si era posible millorar la qualitat de l'efluent d'una EDAR. ·Es va determinar la capacitat d'adsorció del sòl sense esmenar amb experiments en discontinu de 24h per tal de determinar els coeficients de distribució dels fàrmacs seleccionats. ·Per tal de determinar quina proporció d'esmena seria la mes adequada, es va estudiar l'adsorció en 24h de 3 compostos amb un coeficient octanol/aigua similar en experiments en discontinu. ·Es va mesurar el percentatge d'eliminació de cadascun dels fàrmacs provats per cada esmena de baix cost (biochar i NUA) utilitzada. Els resultats van mostrar alts percentatges d'eliminació per tots els fàrmacs, demostrant l'eficàcia dels adsorbents de baix cost com a esmenes de sòl. Els experiments de les dues primeres seccions es va realitzar al grup d'investigació BioremUAB (Grup de Biodegradació de Contaminants Industrials i Valorització de Residus) del departament d'Enginyeria Química, Biològica i Ambiental de la Universitat Autònoma de Barcelona (UAB). L'objectiu d'aquest grup es el desenvolupament de nous processos biològics pel tractament de contaminants emergents en diferents matrius. Els experiments de l'última secció es van desenvolupar al centre Land & Water del CSIRO. L'objectiu d'aquest centre és el de proporcionar solucions innovadores als complexos desafiaments que sorgeixen de les activitats humanes sobre el medi ambient.Las actuales actividades humanas han conllevado a la contaminación del medio ambiente, lo que se ha convertido en una amenaza global. En concreto, la ineficiente eliminación de productos de uso diario en las plantas de tratamiento de aguas residuales (EDARs) es una fuente de contaminación en sí misma; especialmente cuando los lodos no tratados y el agua resultante son valorizados en actividades agrícolas. En el presente trabajo se han desarrollado dos técnicas de biorremediación con Trametes versicolor para tratar diferentes lodos. Además, se ha propuesto y estudiado un post-tratamiento físico para incrementar la calidad del efluente final de una EDAR. En ambos casos, se ha evaluado la eliminación de fármacos en cada corriente. En la primera sección, se estudió el uso de Trametes versicolor en biopilas a escala de laboratorio para tratar lodos de una EDAR secos; evaluando su capacidad para eliminar fármacos y la evolución de las comunidades microbianas. • Se escogió un sustrato lignocelulósico para las biopilas inoculadas con el hongo en base a datos experimentales publicados y no publicados. • Se evaluó la eliminación total de fármacos a concentración real en lodos de depuradora tratados en biopilas inoculadas y no inoculadas con el hongo, probando si la re-inoculación de las biopilas mejoraría la eliminación final. • El estudio de las comunidades bacterianas y fúngicas de las biopilas inoculadas y no inoculadas con el hongo mostraron que ambas comunidades acabaron evolucionando hacia poblaciones similares. En la segunda sección, se evaluó el crecimiento y la capacidad para eliminar fármacos por parte de Trametes versicolor en lodos provenientes de un reactor biologico de membrana (MBR) en sistemas de bioslurry. • Se evaluó la capacidad del hongo para eliminar compuestos en medios líquidos dopados, probando diferentes medios de cultivo y condiciones. • Se evaluó la eliminación de un amplio número de fármacos por parte del hongo en bioslurries no estériles y no dopados. Los análisis microbiológicos demostraron un incremento de la diversidad microbiana después de 15 días. • Se incrementó la escala de los bioslurries: de Erlenmeyer a reactor de 5L; y su corriente de salida se digerió anaeróbicamente, a fin de comprobar si el tratamiento con el hongo podía ser re-valorizado. • Los resultados finales muestran que Trametes versicolor puede eliminar fármacos en bioslurry en condiciones no estériles. En la tercera sección, se evaluó la eliminación de fármacos en agua sintética mediante la enmienda de suelos con adsorbentes de bajo coste, con el objetivo de determinar si era posible mejorar la calidad de un efluente de EDAR. • Se determinó la capacidad de adsorción del suelo sin enmendar con experimentos en discontinuo de 24h para determinar los coeficientes de distribución de los fármacos seleccionados. • Para determinar qué proporción de enmienda sería la más adecuada, se estudió la adsorción en 24h en experimentos en discontinuo de 3 compuestos con un coeficiente octanol / agua similar. • Se midió el porcentaje de eliminación de cada uno de los fármacos probados por cada enmienda de bajo coste (biochar y NUA) utilizada. Los resultados indicaron altos porcentajes de eliminación para todos los fármacos, demostrando la eficacia de los adsorbentes de bajo coste como enmiendas. Los experimentos de las dos primeras secciones se realizó en el grupo de investigación BioremUAB (Grupo de Biodegradación de Contaminantes Industriales y Valorización de Residuos) del departamento de Ingeniería Química, Biológica y Ambiental de la Universitat Autònoma de Barcelona (UAB). El objetivo de este grupo es el desarrollo de nuevos procesos biológicos para el tratamiento de contaminantes emergentes en diferentes matrices. Los experimentos de la última sección se desarrollaron en el centro Land & Water del CSIRO. El objetivo de este centro es el de proporcionar soluciones innovadoras a los complejos desafíos que surgen de las actividades humanas sobre el medio ambiente.Current human activities have led to the pollution of the environment, which has aroused as a global threat. In particular, the inefficient treatment of every-day products in wastewater treatment plants (WWTPs) is an important source of contaminants; especially when untreated sewage sludge and reclaimed water are valorised for agricultural porpoises. The present work describes the development of two bioremediation processes mediated with Trametes versicolor in order to treat different types of sludge. Additionally, one physical post-treatment has been proposed and studied so as to improve the final quality of a WWTP effluent. In both cases, the removal of pharmaceuticals (PhACs) in each stream has been assessed. In the first section, the use of Trametes versicolor in biopiles at lab scale with dried sewage sludge from the WWTP of El Prat de Llobregat was studied, evaluating its capacity to remove Pharmaceutical and Personal Care Products (PPCPs) and assessing the evolution of the biopiles microbial communities. • Appropriate lignocellulosic substrate for fungal biopiles was selected according to the review of published and unpublished experimental data. • Total removal of drugs at real concentrations from sewage sludge was assessed for non-inoculated and fungal inoculated biopiles, testing if the re-inoculation of the biopiles would improve the removal yields. • The study of the bacterial and fungal communities revealed that fungal inoculated and non-inoculated biopiles evolved to similar communities. In the second section, the growth of Trametes versicolor on Membrane Biological Reactor (MBR) sludge in bioslurry systems was assessed, and its capacity to remove PPCPs was evaluated. • The ability of the fungus to remove a spiked compound in liquid medium cultures was assessed, testing different media and conditions for the bioslurry. • In non-spiked Erlenmeyer fungal bioslurries under non-sterile conditions, the removal of a wide set of PhACs was assessed and microbial analysis were performed, showing that microbial diversity increased after 15 days of treatment. • The fungal bioslurry treatment scale was improved to reactor scale and coupled to an anaerobic digestion process. • Results showed that Trametes versicolor can remove PPCPs in bioslurry systems under non-sterile conditions in matrices as complex as an MBR sludge. In the third section, the efficiency removal of PhACs in synthetic water was assessed in soil amended with low-cost sorbents in order to determine if it was possible to improve the final quality of a WWTP effluent. • The capacity of bare soil to adsorb the PhACs was assessed in 24h batch experiments in order to quantify the distribution coefficient of the drugs. • The adsorption of three drugs with similar octanol/water coefficient at different soil:amendment ratios was assessed and carried out in 24h batch experiments, in order to determine which ratio would be the most suitable. • The removal percentage of each pharmaceutical compound was measured in soil amended with two low-cost sorbents (biochar and NUA) during 21 days. The results showed high removal percentages for all the tested PhACs, proving the efficiency of sorbents to remove emerging pollutants from water by amending the soil. The experiments of the two first sections were performed in the research group BioremUAB (Grup de Biodegradació de Contaminants Industrials i Valorització de Residus) from the Department of Chemical, Biological and Environmental Engineering in Universitat Autònoma de Barcelona (UAB). The aim of this group is the development of novel biological techniques to degrade emerging pollutants in different matrices. The experiments of the last section of this thesis were carried out in the centre Land & Water from the CSIRO. The scope of this centre is to deliver innovative solutions to the complex challenges that arise from the demands and impacts of human activities

L'Increment de la dosi gènica com a estratègia de millora de la producció de proteïnes recombinants al llevat Pichia pastoris : revertint les limitacions genètiques del sistema biològic /

BibliografiaLa producció de proteïnes recombinants ha esdevingut la opció predilecta per la producció de productes biofarmacèutics i enzims industrials. Com a factories cel·lulars, els llevats presenten nombroses avantatges enfront d'altres microorganismes, com la seva capacitat per realitzar modificacions post-traduccionals a les proteïnes, l'ampli ventall d'eines genètiques i la facilitat per créixer a altes densitats, entre d'altres. En aquest context, la idoneïtat del llevat metilotròfic Pichia pastoris en la producció de proteïnes recombinants ha destacat per sobre del llevat clàssic Saccharomyces cerevisiae, presentant una rellevància creixent en la producció de productes comercials recombinants. Entre d'altres factors, la presència del promotor AOX1 (PAOX1), d'expressió elevada i fortament regulat pel metanol, ha contribuït a la popularitat d'aquest sistema d'expressió. Per tal de millorar la producció de proteïna recombinant, s'han provat diverses estratègies, sent l'increment de la dosi gènica una de les més populars. Tot i que es pot obtenir una millora de la productivitat heteròloga amb aquesta metodologia, elevades dosis gèniques normalment comporten una sobrecàrrega metabòlica que deriva en productivitats baixes. Durant el transcurs d'aquesta tesi, s'ha utilitzat la lipasa de Rhizopus oryzae (Rol) com a proteïna model, expressada sota el control de PAOX1. Primer, es va construir una col·lecció de soques de P. pastoris amb un nombre creixent de còpies de ROL, i es va descriure per primer cop l'ús de la ddPCR (de l'anglès Droplet Digital PCR) per la determinació acurada de la dosi gènica a P. pastoris, demostrant una precisió més elevada que amb l'ús de la qPCR (de l'anglès quantitative real-time PCR) convencional. Segon, es va realitzar un estudi transcriptòmic mitjançant microarrays d'un grup de soques multicòpia, per tal d'entendre millor l'impacte de la dosi gènica de ROL a les rutes metabòliques. Concretament, les dades van revelar una forta regulació negativa de les rutes relacionades amb el metanol (entre d'altres), en consonància amb les dades fisiològiques obtingudes, que mostraven que les taxes de consum de la font de carboni i el creixement cel·lular eren dependents del nombre de còpies. A partir d'aquestes observacions, es va modificar una soca amb 4 còpies de ROL per tal que expressés una variant desregulada del factor de transcripció Mxr1, principal regulador de la ruta del metanol. Les dades fisiològiques i els nivells transcripcionals dels principals gens implicats en el metabolisme del metanol van confirmar la millora en la producció de Rol i l'increment en l'expressió dels gens relacionats amb el metanol i ROL. Finalment, es va dur a terme un estudi comparatiu a nivell transcriptòmic de la resposta de P. pastoris a l'expressió de tres proteïnes recombinants diferents, per tal d'estudiar l'impacte de la complexitat proteica i l'ús de sistemes d'expressió constitutius o induïbles. En resum, el present estudi descriu per primera vegada una aproximació a nivell de sistema de l'impacte d'una dosi gènica creixent en el llevat P. pastoris, permetent així el disseny de noves estratègies d'enginyeria cel·lular per tal de generar soques més productores, mitjançant la biologia sintètica i l'enginyeria metabòlica.Recombinant protein production is becoming the preferred option to synthesized biopharmaceutical and industrial enzymes. As a host system, yeast factories provide numerous advantages over other microorganisms, such as their capacity to perform post-translational protein modifications, the wide genetic available tools, and the facility to growth at high densities, among others. In this context, the suitability of methylotrophic yeast Pichia pastoris for recombinant protein production has stand out over the classical yeast Saccharomyces cerevisiae, presenting an increasing relevance for the production of commercial recombinant products. Among several factors, the presence of the strong and tightly regulated AOX1 promoter (PAOX1) has contributed to the popularity of this expression system. To further increase the recombinant protein production, several strategies have been attempted, being the increase of the heterologous gene dosage one of the most widely reported. Although a heterologous productivity improvement can be achieved with this methodology, high gene dosages normally entail a metabolic burden in the cell that results in lower productivities. In the course of this thesis, it has been used the lipase of Rhizopus oryzae (Rol) as a protein model expressed under the control of the PAOX1. Firstly, we constructed a series of P. pastoris strains harbouring an increase gene dosage of ROL, and we reported for the first time the use of Droplet Digital PCR (ddPCR) for an accurate copy number determination in P. pastoris, allowing a higher precision than using conventional quantitative real-time PCR (qPCR). Secondly, a transcriptomic study of a set of multicopy strains was carried out using microarrays, to better understand the impact of ROL gene dosage on the metabolic pathways. Concretely, transcriptomic data revealed a high downregulation of methanol-related pathways (among others), in agreement with the physiological data that had been showed that C-source uptake rate and growth yields were gene dosage dependents. Based on these observations, a strain carrying 4 copies of ROL was remodified to express a deregulated variant of the Mxr1 transcription factor, the main regulator of methanol metabolism. Physiological data and transcriptional levels of the main genes involved in methanol metabolism confirmed the improvement of Rol production and the increasing expression levels of methanol-related genes and ROL. Finally, it was performed a comparative transcriptomic analysis of the response of P. pastoris to the expression of three different recombinant proteins, to study the impact of protein complexity and the use of constitutive or inducible expression systems. Overall, in the present study we describe the first systems-level approach to determine the impact of increasing gene dosage in the yeast P. pastoris, hence allowing the design of novel cell engineering strategies to generate high-producing strains by means of the synthetic biology and metabolic engineering

Development of Pichia pastoris for the production of human α-galactosidase A as a model lysosomal enzyme

L'α-galactosidasa A humana (GLA) pertany a la família d'hidrolases lisosomals involucrades en malalties d'emmagatzemat enzimàtic (MEEs). Les teràpies de reemplaçament enzimàtic (TREs), basades en l'administració de l'enzim disfuncional, són una mesura eficient per alentir l'avanç d'algunes MEEs. Tanmateix, el cost de les TREs disponibles actualment es extremadament elevat. Per tant, es proposa com a solució l'ús de sistemes de producció alternatius. P. pastoris és un sistema prometedor per la producció de productes terapèutic biològics, tot i que el seu patró de glicosilació ha de ser adaptat per a aquest ús. GLA, involucrat en la malaltia de Fabry, és l'enzim seleccionat per Bioingenium per avaluar la viabilitat del llevat per produir hidrolases lisosomals, i en tal cas, per al seu ús com a proteïna model per a la modificació del patró de glicosilació P. pastoris. En primer lloc, es va avaluar l'expressió GLA recombinant (rhGLA) en diferents soques de P. pastoris. Un cop seleccionada la més adient, els nivells d'expressió és van millorar mitjançant la sobreexpressió de HAC1p, un activador transcripcional. A continuació, es va optimitzar la productivitat específica de rhGLA mitjançant el clonatge de múltiples còpies del gen codificant. En conjunt, es va aconseguir millorar 7 vegades la productivitat comparat amb els valors inicials. Addicionalment, es van expressar amb èxit variants de l'enzim amb tag, amb un domini d'internalització cel·lular, o mancat d'una seqüència C-terminal. En darrer lloc, es va obtenir un clon lliure de marcadors de resistència per al seu ús com a soca base per la modificació del patró de glicosilació. Es va establir un procés escalable de producció en bioreactor basat en condicions d'O2 limitant, permetent la producció d'elevades quantitats d'enzim. A més, es van desenvolupar mètodes cromatogràfics per a l'aïllament de rhGLA. En concret, s'ha descrit un procés basat en 3 passos cromatogràfics per la purificació de quantitats significants d'enzim lliure de tag, així com procediments de cromatografia d'afinitat per la purificació de petites quantitats de variants de rhGLA destinades a ser caracteritzades. Finalment, s'ha implementat un conjunt de tècniques per la caracterització de l'enzim, incloent anàlisis de glicans i assajos in vitro. Mitjançant l'ús de fibroblasts provinents d'un pacient de Fabry, s'ha pogut valorar amb simplicitat la eficiència d'internalització de l'enzim recombinant. Tal i com s'esperava, la rhGLA amb estructures de glicosilació pròpies de llevat va mostrar nivells d'internalització pobres. En general, s'ha demostrat que P. pastoris és un sistema d'expressió adequat per a la producció de rhGLA. Els mètodes desenvolupats en aquest treball són de gran valor per futures investigacions relacionades amb la humanització dels patrons de glicosilació de P. pastoris. A més, els resultats són d'utilitat per l'escalat dels processos de producció, que habilitaran el llevat per la producció de diferents enzims lisosomals destinats a l'ús en TREs.Human α-galactosidase A (GLA) belongs to the family of lysosomal hydrolases involved in lysosomal storage diseases (LSDs). Enzyme replacement therapies (ERTs), based on the administration of the recombinant missing enzyme, are an efficient measure to slow the advance of some LSDs. However, the cost of currently available ERTs is extraordinarily high. Therefore, the use of alternative production systems is proposed as a solution. P. pastoris is a promising system for the production of biopharmaceuticals, even though its glycosylation pattern needs to be engineered for such purpose. GLA, involved in Fabry disease, is the enzyme selected by Bioingenium to evaluate the feasibility of the yeast to produce human lysosomal hydrolases and, if so, to use it as the model protein in strain glycoengineering. First, the expression of recombinant human GLA (rhGLA) in P. pastoris was evaluated in different strains. Once selected the most suitable one, the expression levels were significantly improved by overexpression of HAC1p, a transcriptional activator. Then, the specific productivity of rhGLA was optimized by cloning multiple copies of the coding gene. Overall, the productivity was improved about 7-fold compared to the initial. Additionally, variants of the enzyme containing a tag, a cell internalization motif or lacking a C-terminal sequence were successfully expressed. Lastly, a markerless clone expressing rhGLA was generated for its use as a base strain for glycan modification. A scalable bioreactor process based on O2-limiting conditions has been established for the production of high quantities of the enzyme. Moreover, purification methods have been developed for the isolation rhGLA. Specifically, a 3-step chromatography process is described for the purification of significant amounts of untagged enzyme, while affinity-chromatography procedures were defined for the fast isolation of small amounts of rhGLA variants aimed for product characterization. Finally, a set of analytical methods have been implemented for the characterization of rhGLA, including glycan analysis and in vitro assays. By using fibroblasts from a Fabry patient, the uptake efficiency of the recombinant enzyme could be easily assessed. As expected, the rhGLA having yeast-like glycans showed poor internalization levels. Overall, P. pastoris has been shown as a suitable production system for rhGLA. The methods developed in this work are of great value for future strain glycoengineering and production scale-up, which will ultimately qualify the yeast for the production of different lysosomal enzymes for ERTs

Degradation of pharmaceutical compounds by microalgae : photobioreactor wastewater treatment, biomass harvesting and methanization /

Premi Extraordinari de Doctorat concedit pels programes de doctorat de la UAB per curs acadèmic 2017-2018Els contaminants emergents (ECs) són un ampli grup de compostos orgànics detectats en diversos compartiments ambientals que degut a la seva presència en el medi ambient i la seva difícil degradació han aixecat un gran interès en la comunitat científica. Tot i que la seva concentració normalment està compresa entre els ng/L i els μg/L, poden representar una amenaça per a la salut humana i el medi ambient ja que són excretats per la orina i els fems, ja sigui en forma de compost actiu o com a metabòlit, ja que no són completament assimilats. D'entre tots els emergents, els compostos disruptors endocrins (EDCs) i els principis actius dels fàrmacs (PhACs) generen especial preocupació. Està àmpliament acceptat que la seva principal font d'entrada al medi ambient és a través dels efluents de les plantes depuradores (WWTP), on els tractaments convencionals de llots actius no són capaços de degradar-ne la majoria, sent capaços d'arribar a les aigües superficials, subterrànies i, posteriorment, a l'aigua potable. Per tant, s'han de buscar tractaments alternatius. Un d'aquests tractaments podria ser l'ús de les microalgues aprofitant la seva capacitat pel tractament d'aigües residuals, eliminant els nutrients de l'aigua residual i la seva posterior conversió en biocombustibles. Aquesta tesi avalua diferents aspectes relacionats amb la degradació de contaminants emergents i tractament d'aigües amb microalgues. A més de l'estudi d'un dels principals colls d'ampolla dels sistemes de microalgues, la collita, que té l'avantatge de clarificar l'aigua residual tractada i concentrar la biomassa algal per a la seva conversió a biogàs. Tant, cultius purs com efluents de microalgues s'han considerat. Primerament, s'ha estudiat la degradació individual de dos compostos estrogènics. Aquests dos compostos estrogènics s'han introduït recentment a la llista de substàncies prioritàries de la directiva de l'aigua: 17α-etinileestradiol (EE2) i 17β- estradiol (E2). La seva degradació s'ha monitoritzat a partir dels cultius purs de Chlamydomonas reinhardtii i Pseudokirchneriella subcapitata a nivell de laboratori. Per tal d'obtenir més informació sobre els mecanismes de degradació s'ha fet la identificació dels productes de transformació. A més, la degradació d'una mescla de 10 fàrmacs (9 antibiòtics i un antidepressiu) s'ha avaluat en cultius purs de microalgues a escala laboratori. S'ha realitzat la identificació dels productes de transformació de tres PhACs seleccionats. Posteriorment, un dels antibiòtics, la ciprofloxacina, s'ha analitzat. Els seus mecanismes d'eliminació han estat estudiats en sistemes algals, tant en reactors a escala laboratori com en escala pilot. Per altra banda, s'ha dissenyat un fotobioreactor (PBR) d'algues tractant aigua residual urbana i en operació durant 6 mesos. S'ha monitoritzat el seu seguiment i s'han provat diferents condicions d'operació. A més, un cop a l'estat estacionari l'eliminació de PhACs s'ha estimat i s'ha caracteritzat la població microbiana. També s'ha estudiat l'eliminació del compost estrogènic E2 en el PBR. En aquesta tesi també es remarca la importància de la collita de microalgues. Tres tècniques de collita (i.e., sedimentació natural, coagulació-floculació i la tècnica innovadora de co-pel·letització utilitzant el fong Trametes versicolor) s'han aplicat en dos efluents reals de microalgues i a una suspensió pura de Chlamydomonas reinhardtii. Finalment, s'ha dut a terme la metanització de biomassa exhausta. Abans del procés de digestió anaeròbia, per tal de solubilitzar la paret cel·lular les algues han estat sotmeses a un pretractament enzimàtic. S'han provat enzims específics i no específics, així com l'efecte combinat utilitzant una mescla d'enzims. Aquest estudi es completa amb la valorització de biomassa fúngica que prové del tractament d'efluents.Emerging contaminants (ECs) are a wide range of organic compounds detected in many environmental compartments that have raised an increasing interest in the scientific community due to their ubiquitous presence in the environment and their difficult degradation. Even though their environmental concentration is usually in the range of ng/L to μg/L, they still represent a threat to human health and environment since they are excreted with urine and faeces either as active substances or metabolites, because they are not completely assimilated. Among emerging contaminants, endocrine disrupting compounds (EDCs) and pharmaceutical active compounds (PhACs) are of major concern. It is widely accepted that the main source to the environment are the effluents of wastewater treatment plants (WWTP), where conventional activated sludge treatments are not able to degrade most of them being able to reach surface, groundwater and subsequently, drinking water. Therefore, alternative treatments should be found. One of those alternatives might be the use of microalgae by taking advantage of their capacity for wastewater treatment removing the nutrients contained in the wastewater and further microalgal biomass conversion into biofuels. The present thesis assesses different factors related to microalgal degradation of emerging contaminants and wastewater treatment. As well as the study of one of the major bottlenecks on microalgal systems, the harvesting, which has the advantage to clarify the treated wastewater and concentrate the microalgal biomass for further biogas production. Pure microalgal cultures and real microalgal effluents have been considered. First of all, individual degradation of two estrogenic compounds has been studied. The two estrogenic compounds evaluated have been recently incorporated in the priority substances in the Water Framework Directive: 17α-ethinylestradiol (EE2) and 17β- estradiol (E2). Their degradation by Chlamydomonas reinhardtii and Pseudokirchneriella subcapitata pure cultures at laboratory scale conditions has been monitored. To obtain further insights in the mechanism of degradation the transformation products have been identified. Moreover, the removal of a mixture of 10 PhACs (9 antibiotics and an antidepressant) has also been assessed in pure microalgal cultures at laboratory scale conditions. Transformation products from three chosen PhACs have been identified. One of the antibiotics, ciprofloxacin, was further evaluated. The removal mechanisms have been studied in real algal ponds in both, laboratory and pilot scale reactors. On the other hand, an algal photobioreactor (PBR) treating urban wastewater has been designed and operated during 6 months. Its performance has been monitored and different operating conditions have been tested. Furthermore, PhACs removal has been evaluated during the steady state and microbial diversity has been identified. The estrogenic compound E2 removal in the PBR has been studied. The importance of microalgal harvesting has been highlighted in the thesis. Three different harvesting techniques (i.e., natural sedimentation, coagulation-flocculation and the novel technique of co-pelletization using Trametes versicolor fungus) have been evaluated using two real microalgal effluents and a pure Chlamydomonas reinhardtii suspension. Finally, methanization of exhausted biomass has been conducted. Prior the anaerobic digestion process microalgal biomass has been submitted to an enzymatic pretreatment for its cell wall solubilisation. Specific and non-specific enzymes have been tested as well as the synergistic effects between an enzymatic mixture. The study is completed valorising fungal biomass coming from the treatment of effluents

Feasibility assessment of rooftop greenhouses in Latin America. The case study of a social neighborhood in Quito, Ecuador

Unidad de excelencia María de Maeztu MdM-2015-0552Today, food security has a critical place in the government agendas of developing countries. In Latin American case, urban contexts have been subject to radical transformations in the last decades, most apparently through the expansion of social housing, which may limit or condition access to food for the neediest population. Nowadays, in Latin America, there are numerous cases of urban agriculture. Quito (Ecuador) stands out for the development of urban agriculture through the Participatory Urban Agriculture Project - AGRUPAR; initiative that has led to the implementation of orchards with organic production, raising of small animals, food processing and marketing of surpluses for food-nutrition security. Above all, it has transcended its urban and peri-urban intervention to rural areas, favoring the urban-rural connection. Also, worldwide the urban agriculture is developed in different forms, one of which is through crops protected by a greenhouse on the roofs: Rooftop greenhouse (RTG). This form of UA uses specific substrates for hydroponic crops and has modern irrigation systems often combined with rainwater harvesting and provides a unique opportunity to improve urban agriculture in Quito. The purpose of this study is to identify the implementation potential of rooftop greenhouses in social neighborhoods in Quito. Standard methods to assess the potential use of rooftop greenhouses were adapted to a social neighborhood. The guidelines follow three steps: Step 1: Characterization based on criteria; Step 2: Available surface determination and Step 3: Production, self-sufficiency and self-supply. "La Comuna Santa Clara de San Millán" was selected as study area. The results showed that 33.2% (7.70 ha) of the neighborhood rooftops had a short-term feasibility to install rooftop greenhouses, with the potential to produce 1,579,140 and 56,720 kg/year of tomato and lettuce respectively. The research has developed reliable guidelines that prove the feasibility to install rooftop greenhouses in similar large Latin-American cities area

Winter Greenhouse Tomato Cultivation : Matching Leaf Pruning and Supplementary Lighting for Improved Yield and Precocity

Unidad de excelencia María de Maeztu CEX2019-000940-MSolar radiation entering a high-wire tomato greenhouse is mostly intercepted by the top of the crop canopy, while the role of lower leaves diminishes with age, turning them into sink organs rather than sources. Accordingly, the defoliation of basal leaves is a widely applied agronomic practice in high-wire greenhouse cultivation management. However, the recent increase in the application of supplemental light emitting diode (LED) lighting for high-density tomato production may affect the role of basal leaves, promoting their source role for fruit development and growth. The present research aims to explore the application of supplementary LED lighting on Solanum lycopersicum cv. Siranzo in the Mediterranean area during the cold season in combination with two regimes of basal defoliation. The defoliation factors consisted of the early removal of the leaves (R) right under the developing truss before the fruit turning stage and a non-removal (NR) during the entire cultivation cycle. The lighting factors consisted of an artificial LED lighting treatment with red and blue diodes for 16 h d−1 (h 8-00) with an intensity of 180 µmol s−1 m−2 (RB) and a control cultivated under natural light only (CK). The results demonstrated a great effect of the supplemental LED light, which increased the total yield (+118%), favoring fruit setting (+46%) and faster ripening (+60%) regardless of defoliation regimes, although the increased energy prices hinder the economic viability of the technology. Concerning fruit quality, defoliation significantly reduced the soluble solid content, while it increased the acidity when combined with natural light

Development of novel electrochemical and optical Lab-on-a-chip platforms for contaminants and biomarkers sensing /

Bibliografia.La detección de contaminantes peligrosos requiere especial atención debido a su posible toxicidad, baja concentración en muestras reales y, en la mayoría de los casos, una imposibilidad de llevar a cabo la detección a través de un metodo tan específico como el inmunoensayo. Una de las estrategias orientadas a la fácil detección de compuestos nocivos es el uso de plataformas microfluídicas llamadas Lab-on-a-chip. En el Capítulo 3, una innovadora plataforma microfluídica en miniatura es desarrollada para la detección simultánea y extracción de polibromodifenil éteres (PBDEs). La plataforma consiste en un chip microfluídico de polidimetilosiloxano (PDMS) para el paso de la inmunoreacción, un chip de PDMS con un electrodo serigrafiado de carbono (SPCE) integrado para la detección, y un chip de PDMS-óxido de grafeno reducido (rGO) para la adsorción física y posterior eliminación de residuos de PBDE. La detección se basó en un inmunoensayo competitivo entre PBDE y PBDE modificado con Peroxidasa de Rábano Silvestre (HRP-PBDE) seguido de un monitoreo de oxidación enzimática de o-aminofenol (o-AP), utilizando voltamperometría de onda cuadrada y resolución anódica (SW-ASV). PBDE fue detectado con una buena sensibilidad y un límite de detección similar al obtenido a través de una prueba colorimétrica comercial (0.018 ppb), pero con la ventaja de utilizar volúmenes reactivos más bajos y un tiempo de análisis reducido. Con el objetivo de diseñar un sistema de detección apropiado para compuestos tóxicos como PBDEs, un compósito de óxido de grafeno reducido y PDMS ha sido desarrollado y optimizado para obtener mayor adsorción (basados en hidropobicidad e interacción π-π entre moléculas de rGO y PBDE) comparado con los PDMS sin modificación. Este sistema se puede aplicar perfectamente para detectar cualquier análito utilizando el inmunoensayo apropiado y facilitar el funcionamiento en matrices tan complejas como el agua marina. En el Capítulo 4 se desarrolla un dispositivo LOC para la preconcentración y la detección simultánea de metales pesados. Dicho dispositivo consta de un electrodo serigrafiado de carbono, un chip de PDMS y otro de GO-PDMS. El chip de GO-PDMS fue fabricado y los factores más esenciales fueron optimizados, incluidos la concentración de GO y aquella del curador de PDMS. Se descubrió que la habilidad de adsorción es inversamente proporcional a la concentración de curador de PDMS en el compósito y proporcional a la concentración de GO. El mecanismo de adsorción está basado en una reacción de complejación , donde grupos activos de oxígeno con cargas negativas se pueden enlazar con metales bivalentes como el Pb. La adsorción más alta fue obtenida en pH=7. El GO-PDMS tiene una capacidad relativamente grande de adsorción, ya que incluso las muestras que contienen niveles más altas que 500 ppb (mayores a 500 ppb) son totalmente adsorbidas, teniendo en cuenta que tal concentración es muy alta. El proceso de desorción ha sido también optimizado. Gracias a ello, metales que habían sido previamente adsorbidos se pueden liberar y detectar en voltamperometría de Onda Cuadrada y Resolución Anódica. El límite de detección de esta técnica (utilizando electrodos serigrafiados de carbono) fue de 0.5 ppb para el plomo (Pb). Esto significa que utilizando una plataforma de preconcentración GO-PDMS, se pueden cuantificar cantidades más bajas de Pb, ya que las muestras preconcentradas mostraron una corriente de hasta 30 veces más alta que las no preconcentradas. Esta plataforma se puede utilizar para la detección mejorada de metales pesados y también para su eliminación

Reglament del Departament d'Enginyeria Química, Biològica i Ambiental

Acord del Consell de Govern de 8 de juliol de 2004 i modificat per acord de 16 de juliol de 201

Use of fungi and bacteria for the removal of recalcitrant compounds from tannery wastewater /

Els tanins són polifenols produïts per plantes que s'utilitzen en l'adobat vegetal. Aquests es diferencien de la majoria dels fenols naturals perquè fan precipitar les proteïnes i s'utilitzen en el procés d'adobament per unirse a les proteïnes del col·lagen de la pell de l'animal, fent que el cuir sigui més durador. Es tracta d'una substància de baixa biodegradabilitat, amb una elevada demanda química d'oxigen soluble. A més, la presència d'aquests tanins en grans concentracions poden inhibir el tractament biològic. Generalment aquest fragment soluble i inflexible dels efluents de les adoberies s'elimina mitjançant processos químics. Es per això que un tractament biològic que pogués eliminar-los eficaçment tindria avantatges tant ambientals com econòmics. D'aquesta manera els fongs podrien ser utilitzats al tractament d'aigües residuals d'aquest tipus d'indústria. Tot i així continua sent un desafiament important l'aplicació d'un bioreactor a base de fongs que, en operacions a llarg termini, tingui un rendiment similar en condicions estèrils i no estèrils. La present tesi s'ha centrat en desenvolupar i testejat diverses tècniques amb l'objectiu d'eliminar els tanins. Es fa mitjançant la creació d'un ecosistema dissenyat a base de fongs i bacteris. Aquest s'aplica a processos típics de tractament d'aigües residuals d'adoberies. Aspergillus tubingensis MUT 990 ha sigut la soca fúngica més adequada. S'han fet servir tant recerques bibliogràfiques com la pròpia experiència prèvia per dissenyar i construir reactors a escala laboratori (4 litres) i a escala pilot (1.5 m3). La soca fúngica es va immobilitzar en portadors cúbics i es va inocular en un nou reactor giratori de llit submergit. La primera prova en bioreactors es va dur a terme per avaluar l'efecte de la rotació i l'efecte de l'addició del co-substrat en l'eliminació dels tanins. La segona prova es va realitzar de forma paral·lela en dos reactors de llit submergit fix; el primer es va alimentar amb un taní condensat (Quebracho) i el segon amb un taní hidrolitzable (Tara). Tots dos es van inocular amb Aspergillus tubingensis. El temps de retenció hidràulic i la concentració de tanins en el medi es van anar modificant per maximitzar la capacitat d'eliminació i per analitzar la inhibició del substrat. Es va mantenir estable un biofilm en el primer reactor durant 180 dies d'operació. D'altra banda, en el segon reactor va haver un despreniment de biomassa durant la posada en marxa; després va créixer com un cultiu suspès durant el període operatiu (226 dies). L'eliminació de la demanda d'oxigen soluble va ser, sense l'addició de co-substrats, de fins el 53% i 90% en el primer i segon bioreactor respectivament. Les comunitats microbianes formades per fongs i bacteris dels reactors es van caracteritzar amb un anàlisi d'ADN. A més es va aplicar la respirometria heterogènia per avaluar l'activitat biològica del biofilm. Les dades obtingudes es van utilitzar per desenvolupar un model matemàtic i realitzar una caracterització cinètica i estequiomètrica de la biomassa. Es van establir experiments específics juntament amb un procediment respiromètric per a la biomassa fúngica. Els resultats a escala de laboratori es van utilitzar per dissenyar un reactor a escala pilot. Finalment, després d'una fase de posada en marxa, el reactor a escala pilot es va alimentar amb aigües residuals riques en tanins recollides d'adoberies. Al final de l'experiment, el biofilm era estable i s'havia aconseguit un exercici encoratjador. Creiem que els resultats obtinguts representen el primer pas per a una futura aplicació a escala real i aconseguir eficientment l'eliminació biològica de tanins en aigües residuals d'adoberies.Los taninos son compuestos polifenólicos producidos por plantas que se utilizan en el curtido vegetal. Los taninos se diferencian de la mayoría de los fenoles naturales porque precipitan las proteínas y se usan en el proceso del curtido para unirse a las proteínas del colágeno de la piel del animal para hacer que el cuero sea más duradero. Representan una de las sustancias de baja biodegradabilidad en las aguas residuales de la curtiduría con una alta y recalcitrante demanda química de oxígeno soluble. Además en grandes concentraciones, dichos taninos pueden inhibir el tratamiento biológico. Este fragmento soluble y inflexible de los efluentes de las curtiduría generalmente se elimina mediante procesos químicos. Por tanto, un tratamiento biológico que pudiera eliminarlos eficazmente, tendría ventajas tanto ambientales como económicas. Los hongos podrían ser utilizados para el tratamiento de aguas residuales de la industria del curtido. La aplicación de un bioreactor a base de hongos que tenga un rendimiento similar en condiciones estériles y no estériles en operaciones de largo plazo sigue siendo una tarea desafiante. La presente tesis se ha centrado en desarrollar y probar técnicas para eliminar los taninos con un ecosistema diseñado a base de hongos y bacterias para su aplicación en trenes típicos de tratamiento de aguas residuales en las curtidurías. El Aspergillus tubingensis MUT 990 fue seleccionado como la cepa fúngica adecuada. La investigación bibliográfica y las experiencia previa se utilizó para diseñar y construir reactores a escala de laboratorio (4 litros) y piloto (1.5 m3). La cepa fúngica se inmovilizó en portadores cúbicos y se inoculó en un nuevo reactor giratorio de lecho sumergido. La primera prueba en bioreactores se llevó a cabo para evaluar el efecto de la rotación y la adición del co-sustrato en la eliminación de los taninos. La segunda prueba se realizó de forma paralela en dos reactores de lecho sumergido fijo; el primero se alimentó con un tanino condensado (Quebracho) y el segundo con un tanino hidrolizable (Tara). Ambos se inocularon con el Aspergillus tubingensis. El tiempo de retención hidráulico y la concentración de taninos en el medio se fueron variando para maximizar la capacidad de eliminación y para analizar la inhibición del sustrato. Se mantuvo estable una biopelícula en el primer reactor durante 180 días de operación. Por otro lado, en el segundo reactor hubo un desprendimiento de biomasa durante la puesta en marcha y luego creció como un cultivo suspendido durante el período operativo (226 días). La eliminación de la demanda de oxígeno soluble fue hasta del 53% y del 90% y se logró en el primer y en el segundo bioreactor respectivamente sin la adición de co-sustratos. Las comunidades microbianas de los reactores formadas por hongos y bacterias se caracterizaron con un análisis de ADN. Además se aplicó la respirometría heterogénea, para evaluar la actividad biológica de la biopelícula. Los datos obtenidos se utilizaron para desarrollar un modelo matemático y realizar una caracterización cinética y estequiométrica de la biomasa. Se establecieron experimentos específicos junto con un procedimiento respirométrico para la biomasa fúngica. Los resultados a escala de laboratorio se utilizaron para diseñar un reactor a escala piloto. Finalmente, después de una fase de puesta en marcha, el reactor a escala piloto se alimentó con aguas residuales ricas en taninos recolectadas en las curtiembres. Al final del experimento, la biopelícula era estable y se había logrado un desempeño alentador. Creemos que los resultados obtenidos representan el primer paso para una futura aplicación a escala real y lograr eficientemente la eliminación biológica de los taninos en las aguas residuales de las curtidurías.I tannini sono composti polifenolici prodotti dalle piante e sono utilizzati nella concia al vegetale a scala industriale. I tannini si differenziano dalla maggior parte degli altri composti fenolici naturali per la loro capacità di far precipitare le proteine ​​e sono utilizzati nel processo di concia per legarsi al collagene delle pelli animali, al fine di renderle più resistenti e non putrescibili. I tannini sono una delle sostanze solubili a bassa biodegradabilità presenti nelle acque di scarico della concia e presentano un'elevata domanda chimica di ossigeno recalcitrante. Inoltre, ad elevate concentrazioni possono inibire i trattamenti biologici. Questa frazione recalcitrante e solubile delle acque di scarico della concia è solitamente rimossa tramite processi chimici. Pertanto, un trattamento biologico in grado di rimuovere efficacemente questa frazione presenterebbe vantaggi sia ambientali che economici. Nonostante le proprietà antimicrobiche dei tannini, esistono organismi in grado di usarli come substrato di crescita, la loro biodegradazione nell'ambiente è principalmente associata ai funghi piuttosto che ai batteri. I funghi quindi possono essere sfruttati per il biorisanamento delle acque reflue dell'industria conciaria. Tuttavia, in questa tipologia di biotecnologie ambientali, i funghi non riescono a competere con batteri. L'utilizzo di un bioreattore fungino, con simili prestazioni in condizioni sterili e non sterili in prove a lungo termine, rappresenta ancora un compito impegnativo. La presente tesi si è focalizzata nello sviluppo e sperimentazione di tecnologie atte a rimuovere i tannini sfruttando un ecosistema di funghi e batteri, il fine ultimo è stato quello di sviluppare un trattamento da integrare a quelli convenzionali per le acque reflue (condizioni non sterili). Il ceppo fungino Aspergillus tubingensis MUT 990 è stato selezionato come il più adatto per il presente studio. La letteratura di settore e le esperienze precedenti hanno fornito un importante contributo per la progettazione e costruzione dei reattori a scala di laboratorio (4 litri) e un reattore a scala pilota (1.5 m3). Il ceppo fungino selezionato è stato immobilizzato in supporti costituiti da cubi di schiuma poliuretanica ed è stato inoculato in un innovativo reattore a letto rotante e sommerso. La prima prova con i bioreattori ha avuto il fine di valutare l'effetto della rotazione e dell'aggiunta del co-substrato sulla rimozione del tannino. La seconda prova è stata effettuata in parallelo in due reattori, il primo è stato alimentato con un tannino condensato (Quebracho) e il secondo con tannino idrolizzabile (Tara), entrambi sono stati inoculati con Aspergillus tubingensis immobilizzato sul supporto sopradescritto. Il tempo di ritenzione idraulico e la concentrazione di tannino sono stati i principali parametri studiati per massimizzare la capacità di rimozione e per analizzare l'inibizione del substrato. Nel primo reattore si è mantenuto un biofilm stabile durante i 180 giorni di funzionamento. Nel secondo reattore invece si è verificato un distacco del biofilm e lo sviluppo di una biomassa in sospensione per tutto il periodo sperimentale (226 giorni). Nel primo reattore è stata raggiunta una rimozione della domanda chimica di ossigeno solubile del 53% e nel secondo reattore del 90%, in entrambi senza l'aggiunta di co-substrati. Le comunità microbiche dei reattori, costituite da funghi e batteri, sono state caratterizzate da un'analisi metagenomica. Inoltre, è stata applicata una tecnica innovativa, la respirometria eterogenea, per valutare l'attività biologica del biofilm. I dati ottenuti sono stati utilizzati per sviluppare un modello matematico e per eseguire una caratterizzazione dei parametri cinetici e stechiometrici della biomassa. Poiché in letteratura la respirometria e la modellistica sono scarsamente applicate alle biomasse fungine è stata messa a punto una procedura respirometrica ed esperimenti dedicati. I risultati delle prove di laboratorio sono stati impiegati per la progettazione del reattore a scala pilota. Infine, dopo una fase di avviamento, il reattore a scala pilota è stato alimentato con refluo conciario contenente un'elevata concentrazione di tannini. Al termine della sperimentazione il biofilm è rimasto stabile mostrando una buona capacità di rimozione. I risultati ottenuti rappresentano il primo passo per una futura applicazione, su scala reale, di efficace trattamento biologico delle acque reflue conciarie.Tannins are polyphenolic compounds produced by plants that are used in the vegetable tanning of leather at an industrial scale. Tannins differ from most other natural phenols since they precipitate proteins and are used in the tanning process to bind to the collagen proteins of the animal skin to make leather more durable and not putrescible. Tannins represent one of the low-biodegradability substances in tannery wastewaters with a highly recalcitrant soluble chemical oxygen demand; moreover, at high concentrations they can inhibit biological treatment. This soluble recalcitrant fraction of tannery effluents is usually removed by means of chemical processes. Therefore, a biological treatment that could remove effectively this fraction would have both environmental and economic advantages. Despite the antimicrobial properties of tannins, there are organisms that are able to grow on them; in fact their biodegradation in the environment is mainly associated with fungi rather than bacteria. Fungi could thus be exploited for the bioremediation of wastewater streams of the tanning industry. However, in environmental biotechnology applications, fungi tend to be outcompeted by bacteria. The application of a fungal-based bioreactor, that has a similar performance under sterile and non-sterile conditions in long-term operations, is still a challenging task. The present thesis was aimed at developing and testing technologies to remove tannins with an engineered ecosystem based on fungi and bacteria for application in typical tannery wastewater treatment trains (non-sterile conditions). Aspergillus tubingensis MUT 990 was selected as a suitable fungal strain. Literature research and previous experiences were used to design and build lab-scale (4 litres volume) and pilot-scale (1.5 m3 volume) reactors. The selected fungal strain was immobilised in polyurethane foam cubes carriers and inoculated in a novel rotating, submerged, packed bed reactor. The first test in bioreactors was carried out to evaluate the effect of rotation and the co-substrate addition on tannin removal. The second test in bioreactors was carried out in two submerged packed bed reactors run in parallel, the first one was fed with a condensed tannin (Quebracho tannin), and the second with hydrolysable tannin (Tara tannin), both were inoculated with Aspergillus tubingensis in attached form. The hydraulic retention time and the concentration of tannins in the medium were varied to maximise the removal capacity and to analyse the substrate inhibition. A stable biofilm was maintained in the first reactor during the 180 days of operation. On the other hand, in the second reactor there was a biomass detachment during the start-up and then grown as a suspended culture throughout the operational period (226 days). Soluble chemical oxygen demand removal up to 53% and 90% were achieved in the first and second bioreactor, respectively, without the addition of co-substrates. The microbial communities of the reactors, made up of fungi and bacteria, were characterised with a metagenomic analysis. In addition, an innovative technique, the heterogeneous respirometry, was applied to assess the biological activity of immobilised cells (biofilm). The data obtained were used to develop a mathematical model and to perform a kinetic and stoichiometric characterisation of the biomass. Since fungal biomass is poorly characterised with modelling and respirometry, dedicated experiments were set-up along with a respirometric procedure. The lab-scale results were used to design a pilot-scale reactor. Finally, after a start-up phase the pilot-scale reactor was fed with real tannin-rich wastewater collected from tanneries. At the end of the experimentation the biofilm was stable and an encouraging performance had been achieved. We believe the results obtained represent the first step for a future real-scale application to reach an efficient biological removal of tannins from tannery wastewater

Enzymatic synthesis of biodiesel from high free fatty acid feedstock using a recombinant Rhizopus oryzae lipase /

La tesi que es presenta a continuació està encarada, en termes generals, en la utilització d'una lipasa recombinant de Rhizopus oryzae (rROL) expressada en un llevat metilotròfic (Picchia pastoris) i immobilitzada en un suport de polimetacrilat, per a la síntesi enzimàtica de biodièsel. La característica més important d'aquest enzim és la seva regió-especificitat, que permet catalitzar l'alcohòlisi dels enllaços èsters sn-1 i sn-3 del triglicèrid en dos alquil-èsters d'àcid gras (biodièsel). La utilització de la rROL esdevé un punt clau per al procés ja que no es forma glicerol, sinó 2-monoglicèrid, un producte de valor afegit. La primera part de la tesi està enfocada en l'avaluació d'una nova matèria primera com a substrat per a la producció de biodièsel. L'oli d'orujo (o de pinyolada) és un oli vegetal que pot ser representatiu d'olis amb alt contingut en àcids grassos lliures, com la majoria d'olis de rebuig. Així doncs, es realitzen estudis preliminars per conèixer el rol d'aquests àcids grassos en termes de velocitat inicial de reacció i estabilitat de la rROL. D'altra banda, es procedeix a la immobilització de l'enzim per enllaç covalent per tal d'assegurar-ne l'estabilitat i reutilització. Després, l'èmfasi es posa sobretot en la millora de la reacció en vials de 10 mL. Per tal de millorar la velocitat inicial de reacció i l'estabilitat de l'enzim, es realitzen proves a diferents temperatures i activitat inicial d'aigua. També es compara la forma d'addicionar els dos acceptors d'acil més utilitzats actualment, el metanol i l'etanol, en reaccions d'un, cinc i deu polsos. Després, es compara l'estabilitat i es calculen les productivitats per tal de trobar el més adequat. Seguidament es duu a terme el canvi d'escala del procés a través d'un reactor de 50 mL reproduint els experiments anteriors. Estudis posteriors permeten calcular la vida mitja de l'enzim en les diferents reaccions, com també les productivitats. Finalment, s'addiciona de forma semi-continua, per mitjà d'una micro-bureta automatitzada, l'acceptor d'acil amb el que s'obtenen els millors resultats. L'últim capítol es basa en la simulació d'un procés industrial per a la síntesi enzimàtica de biodièsel amb els resultats prèviament obtinguts. Es planteja un procés per a la producció i la purificació tant del biodièsel com del subproducte, 2-monoglicèrid i s'utilitza un software específic (SuperPro Designer®) per al desenvolupament del projecte. Se n'estudia la viabilitat i els canvis suggerits per aconseguir la seva rendibilitat.The present thesis is focused, in general terms, on the enzymatic synthesis of biodiesel using a recombinant Rhizopus oryzae lipase (rROL), expressed in a methylotrophic yeast (Pichia pastoris) as a cell factory and immobilised onto a polymethacrylate support. The main feature of this enzyme is its regioespecificity, which allows to catalyse the alcoholysis of sn-1 and sn-3 ester bonds of the triglyceride into two fatty acid alkyl esters (biodiesel). The use of rROL becomes a key factor since glycerol is not formed as a by-product in favour of 2-monoglyceride. The first part of the thesis is focused on the evaluation of a novel feedstock as a substrate for biodiesel production. Alperujo oil is a vegetable oil, which can be representative of other high-FFA feedstocks, considered waste-oils. Preliminary studies are performed to find out the role of this FFA in terms of initial reaction rate and stability of the rROL. Moreover, the enzyme has been immobilised by covalent binding to ensure its stability and recovery. During the following parts, emphasis is put on the improvement of the enzymatic reaction itself using 10-mL vials. Temperature and initial water activity are set up in order to increase initial rate and enzyme stability. In addition, the two most used acyl-acceptors are compared. Methanol and ethanol are added using three stepwise strategies: one, five and ten pulses. Stability and productivity are also compared in order to find out the best one. Then, scale up to a 50-mL stirred-reactor is carried out by reproducing the previous experiments. Initial rates and stability are compared. Further analysis allowed to calculate enzyme's half-life times and productivities in the different reactions. Semi-continuous addition of the acyl-acceptor which best results were obtained with, is attempted by using an automatised micro-burette. Last chapter is focused on the simulation of an industrial process of enzymatic production of biodiesel using all the previous obtained results. Specific software (SuperPro Designer®) is used to raise and develop a process to produce and purify the biodiesel as well as its by-product (2-monoglyceride). Then, viability studies are performed and some modifications are suggested in order to find out a profitable and feasible process