BMP-2 induces osterix expression through upregulation of DLX5 and its phosphorylation by p38

Osterix, a zinc-finger transcription factor, is specifically expressed in osteoblasts and osteocytes of all developing bones. Because no bone formation occurs in Osterix null mice, Osterix is thought to be an essential regulator of osteoblast differentiation. We report that bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) induces an increase in Osterix expression, which is mediated through a homeodomain sequence located in the proximal region of the Osterix promoter. Our results demonstrate that induction of Dlx5 by BMP-2 mediates Osterix transcriptional activation. First, BMP-2 induction of Dlx5 precedes the induction of Osterix. Second, Dlx5 binds to the BMP-responsive homeodomain sequences both in vitro and in vivo. Third, Dlx5 overexpression and knock-down assays demonstrate its role in activating Osterix expression in response to BMP-2. Furthermore, we show that Dlx5 is a novel substrate for p38 MAPK in vitro and in vivo and that Ser-34 and Ser-217 are the sites phosphorylated by p38. Phosphorylation at Ser-34/217 increases the transactivation potential of Dlx5. Thus, we propose that BMP activates expression of Osterix through the induction of Dlx5 and its further transcriptional activation by p38-mediated phosphorylation

Regulació d'Osterix, un gen clau per a la diferenciació osteoblàstica induïda per BMP-2

[cat] L'osteogènesi és un procés del desenvolupament dels vertebrats controlat per molècules senyalitzadores que proporcionen a les cèl·lules mesenquimals la informació necessària per a diferenciar al llinatge osteogènic. D´entre aquestes, les citoquines de la família BMP (Bone Morphogenetic Protein) estan implicades en nombrosos aspectes del desenvolupament sent especialment importants en el desenvolupament de l'os. La unió d'aquestes BMPs als seus receptors inicia diferents vies de transducció de senyal que es classifiquen com a dependents o independents de Smads. S'ha comprovat en cultius cel·lulars com les BMP estimulen l'expressió de factors de transcripció específics d'osteoblasts com són Runx2 i Osterix, així com marcadors de la diferenciació osteoblàstica com la Fosfatasa Alcalina, el Col·lagen tipus I o l'Osteocalcina. Els objectius que ens vam platejar foren: - Identificació de les vies de transducció de senyals induïdes per BMP-2 i altres mecanismes moleculars involucrats en l'activació d'Osterix. a) Anàlisi de la regió promotora d'osterix i identificació de les regions de resposta a BMP-2. b) Identificació dels factors de transcripció que s'uneixen a aquestes regions i estudi de la seva regulació en resposta a BMP-2. -Establiment de clons estables induïbles que ens permetin estudiar in vivo la regulació transcripcional d'Osterix. -Estudi d'altres gens modulats transcripcionalment per BMP-2 i la seva implicació en l'osteogènesi. El primer pas de la recerca fou aïllar dues seqüències del promotor d'osterix que es troben molt conservades entre humans i ratolins i clonar-les en un vector pGL2 que codifica per un gen reporter luciferasa. Mitjançant la transfecció i la deleció d'aquestes construccions vam observar una seqüència de 55 parells de bases a la regió més proximal que és la responsable de la resposta a BMP-2. Mitjançant mutagènesi vam identificar una seqüència homeobox palindròmica (TAATTA) que és la responsable de la inducció d'osterix per BMP-2. La proteïna Dlx5, un factor de transcripció involucrat en l'osteogènesi, és capaç d'unir-se i activar el promotor d'osterix en aquesta seqüència. Aquesta observació es complementà amb estudis del patró d'expressió temporal d'aquests gens en que es comprovà que l'activació de Dlx5 per BMP-2 precedeix temporalment a la d'Osterix. Mitjançant experiments de sobreexpressió i silenciació en cèl·lules C2C12 descrivim que Dlx5 és imprescindible per a l'expressió d'Osterix en resposta a BMP-2. No obstant, els experiments de sobreexpressió també indicaven que la BMP-2 té un efecte additiu a Dlx5 que ens permeté deduir que algun altre mecanisme havia d'estar implicat en l'activació d'Osterix per BMP-2. Descartada una possible interacció de Dlx5 amb les proteïnes Smad, vam investigar les vies independents de Smads i observàrem que la proteïna p38-MAPK, que també és activada en resposta a BMP-2, és important per a l'activació d'Osterix induïda per BMP-2. Usant una variant constitutivament activa de MKK6, capaç d'activar p38, i SB203580, que és un inhibidor específic d'aquesta via, vam confirmar la fosforilació de Dlx5 per acció de p38 i que aquesta és funcional. Per tal de confirmar aquestes observacions sobre el promotor del gen osterix endogen, es realitzaren experiments d'immunoprecipitació de cromatina (ChIP) que confirmaren la unió de Dlx5 al promotor d'osterix in vivo que s´incrementa en presència de MKK6 constitutivament activa. També vam observar l'acetilació de la histona H3 en presència de Dlx5 i el paper sinèrgic de l'activitat histona actetil-transferasa de la proteïna p300. Així doncs, descrivim que Dlx5 integra les vies dependents i independents de Smad en la regulació d'Osterix. A més d'aquests resultats, s'ha estudiat el paper de Msx2 i p53 en la repressió de l'expressió d'Osterix i s'ha identificat un nou gen reprimit per BMP-2 que sembla estar implicat en la regulació del patró d'expressió d'aquest gen.[eng] Commitment of mesenchymal cells to the osteoblast phenotype is controlled by a specific set of transcription factors activated by signals and regulatory pathways. Among them, Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP-2) signalling has been shown to be involved in bone formation. Binding of BMP-2 to its type I and type II receptors induces both Smad dependent and Smad independent signal transduction pathways. BMPs are able to induce osteogenic factors like Runx2 or Osterix, as well as bone phenotype markers such are Alkaline Phosphatase, Collagen or Osteocalcin. The main objectives for this thesis are: -Identification of the signal transduction pathways induced by BMP-2 and other molecular mechanisms involved in Osterix activation. a) Analysis of the osterix promoter region and identification of the BMP-2 responsive regions. b) Identification of the transcription factors that binds to these regions and study of its regulation by BMP-2. -To obtain stable inducible clones which allow us to study the Osterix transcriptional activity in vivo. -To study other BMP-2 modulated genes and its possible role in the osteogenesis. Our results demonstrate that induction of Dlx5 by BMP-2 mediates Osterix transcriptional activation. First, BMP-2 induction of Dlx5 precedes the induction of Osterix. Second, Dlx5 binds to the BMP-responsive sequences that we indentified in the Osterix promoter. Third, Dlx5 overexpression and knock-down assays demonstrate its role in activating Osterix expression in response to BMP-2. Furthermore, we show that Dlx5 is a novel substrate for p38-MAPK in vitro and in vivo and that phosphorylated Dlx5 increases the transactivation potential of Dlx5. Thus, BMP activates expression of Osterix through the induction of Dlx5 and its further transcriptional activation by p38-mediated phosphorylation. In addition, we studied the repressive role of Msx2 and p53 in the Osterix promoter, and indentified a possible new gene involved in the regulation of the Osterix's expression pattern