Ultraestructura y conectividad de la corteza cerebral

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Anatomía, Histología y Neurociencia. Fecha de Lectura: 26-10-2022Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 26-04-2024El estudio de la corteza cerebral es el tema preferido por muchos científicos teóricos y experimentalis-tas por su implicación directa en diversos aspectos del comportamiento de los mamíferos y porque es la estructura más “humana” del sistema nervioso del ser humano. El objetivo de la presente tesis doctoral es contribuir al conocimiento de la microanatomía de la corteza cerebral, uno de los pasos esenciales para conocer su funcionamiento. Este estudio se ha realizado en el neuropilo de la corteza somatosensorial del ratón adulto. Hemos es-tudiado, en primer lugar, el número, la distribución, la forma y el tamaño de las sinapsis en las diferen-tes capas corticales. En segundo lugar, hemos cuantificado la fracción de volumen mitocondrial y esta-blecido su localización en axones, dendritas y elementos no sinápticos. En tercer lugar, hemos estudia-do la distribución de los cuerpos multivesiculares, como representantes de la vía endocítica, responsa-ble del transporte, mantenimiento y reciclaje de sustancias. Para llevar a cabo este estudio se han utili-zado técnicas de microscopía electrónica tridimensional y técnicas estereológicas. Nuestros resultados indican que la densidad de sinapsis del ratón es más alta que en la rata y que en el humano, siendo las sinapsis asimétricas o excitadoras predominantes respecto a las simétricas o inhibi-doras. Además, las sinapsis asimétricas muestran preferencia por las espinas dendríticas, mientras que las sinapsis simétricas se establecen preferentemente en los tallos dendríticos. A pesar de ello, en los tallos dendríticos predominan las sinapsis asimétricas sobre las simétricas. Por otra parte, existen dife-rencias significativas en el tamaño y forma de los diferentes tipos de sinapsis. En nuestras muestras, un 8% de volumen del tejido está ocupado por mitocondrias, localizándose mayoritariamente en las den-dritas. Algunas capas corticales (I, IV y VI) muestran una correlación entre la densidad de sinapsis y la fracción de volumen mitocondrial. Además, los cuerpos multivesiculares también muestran una correla-ción positiva con la densidad sináptica y se localizaron predominantemente en los axones. Tomado en su conjunto, nuestro estudio nos ha permitido reconocer, en gran detalle, las diferencias microanatómicas existentes entre las capas corticales. Los análisis que hemos realizado ayudan a com-prender la organización funcional del cerebro a través de su diseño estructural, y a correlacionarlo con las características moleculares y fisiológicas de la región que hemos estudiado. De este modo, el estu-dio de las sinapsis y de los orgánulos más relevantes en el mantenimiento de la función sináptica nos permitirá entender mejor la estructura de los microcircuitos que componen la corteza cerebra

Ultraestructura y conectividad de la corteza cerebral

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Anatomía, Histología y NeurocienciaEl estudio de la corteza cerebral es el tema preferido por muchos científicos teóricos y experimentalis-tas por su implicación directa en diversos aspectos del comportamiento de los mamíferos y porque es la estructura más “humana” del sistema nervioso del ser humano. El objetivo de la presente tesis doctoral es contribuir al conocimiento de la microanatomía de la corteza cerebral, uno de los pasos esenciales para conocer su funcionamiento. Este estudio se ha realizado en el neuropilo de la corteza somatosensorial del ratón adulto. Hemos es-tudiado, en primer lugar, el número, la distribución, la forma y el tamaño de las sinapsis en las diferen-tes capas corticales. En segundo lugar, hemos cuantificado la fracción de volumen mitocondrial y esta-blecido su localización en axones, dendritas y elementos no sinápticos. En tercer lugar, hemos estudia-do la distribución de los cuerpos multivesiculares, como representantes de la vía endocítica, responsa-ble del transporte, mantenimiento y reciclaje de sustancias. Para llevar a cabo este estudio se han utili-zado técnicas de microscopía electrónica tridimensional y técnicas estereológicas. Nuestros resultados indican que la densidad de sinapsis del ratón es más alta que en la rata y que en el humano, siendo las sinapsis asimétricas o excitadoras predominantes respecto a las simétricas o inhibi-doras. Además, las sinapsis asimétricas muestran preferencia por las espinas dendríticas, mientras que las sinapsis simétricas se establecen preferentemente en los tallos dendríticos. A pesar de ello, en los tallos dendríticos predominan las sinapsis asimétricas sobre las simétricas. Por otra parte, existen dife-rencias significativas en el tamaño y forma de los diferentes tipos de sinapsis. En nuestras muestras, un 8% de volumen del tejido está ocupado por mitocondrias, localizándose mayoritariamente en las den-dritas. Algunas capas corticales (I, IV y VI) muestran una correlación entre la densidad de sinapsis y la fracción de volumen mitocondrial. Además, los cuerpos multivesiculares también muestran una correla-ción positiva con la densidad sináptica y se localizaron predominantemente en los axones. Tomado en su conjunto, nuestro estudio nos ha permitido reconocer, en gran detalle, las diferencias microanatómicas existentes entre las capas corticales. Los análisis que hemos realizado ayudan a com-prender la organización funcional del cerebro a través de su diseño estructural, y a correlacionarlo con las características moleculares y fisiológicas de la región que hemos estudiado. De este modo, el estu-dio de las sinapsis y de los orgánulos más relevantes en el mantenimiento de la función sináptica nos permitirá entender mejor la estructura de los microcircuitos que componen la corteza cerebral

Multivesicular bodies and their relationship with mitochondria in the rodent somatosensory cortex

Multivesicular bodies (MVBs) are spherical organelles that are surrounded by a single membrane and contain small vesicles in their lumen. They are involved in degradation of cell components as an intermediary of the endosomal pathway. They also recycle cell components and are able to insert receptors in membranes that are far away from the neural soma. MVBs can fuse to plasma membrane and release exosomes that are essential for cell-to-cell communication. It has recently been described that MVBs store and transport damaged cargo from mitochondria and break it down by fusing with lysosomes. MVBs are also known to accumulate the protein aggregates that are involved in pathological conditions like Alzheimer’s disease and Parkinson disease. We used three dimensional electron microscopy with combined focused ion beam milling and scanning electron microscopy (FIB/SEM) to reconstruct MVBs in the rodent somatosensory cortex. We obtained ten stacks of serial sections from the neuropil of layer III. Using specifically developed software (Espina), we segmented and three-dimensionally reconstructed 678 MVBs. This revealed differences in their size and content (dark or clear vesicles). Some of them (7%) contained dark electron-dense laminar material in addition to the usual vesicles. We then classified MVBs based on their location. Our preliminary results indicate that MVBs located in dendrites outnumber those located on axons in approximately a 3:1 proportion. We also determined whether MVBs were related to other subcellular organelles, with special attention to mitochondria. We found that 19% were in contact with mitochondria. These MVBs are probably incorporating the damaged protein cargo contained in mitochondrial-derived vesicles, thereby acting as a defense mechanism that helps maintain normal mitochondrial function. The quantitative method that we have developed here will help determine the possible alterations of the endosomal pathway in pathological conditions

Pre-Embedding Immunostaining of Brain Tissue and Three-Dimensional Imaging with FIB-SEM

FIB-SEM is an electron microscopy technique that allows the acquisition of serial sections in an automated manner. A Focused Ion Beam (FIB) is directed toward the specimen, removing material from its surface. Since the FIB can be positioned and controlled on a nanometer scale, the specimen surface can be milled so that a thin layer of a specified thickness is removed. The Scanning Electron Microscope (SEM) column is then used to acquire an image from the freshly milled surface. To obtain a series of images, the milling/imaging cycle is repeated automatically. This technique can be used with any pre-embedding method that yields an electron-dense end product. We describe here an immunocytochemical protocol to be used on vibratome brain sections. After the immunocytochemical procedure, the sections are flat embedded in epoxy resin and prepared for FIB-SEM imaging. Serial image acquisition, visualization, and analysis in 3D are also briefly described.This work was partially supported by grants from the following entities: Centro de Investigación en Red sobre Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED, CB06/05/0066, Spain); and the Spanish Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (grant PGC2018-094307-B-I00 and the Cajal Blue Brain Project [the Spanish partner of the Blue Brain Project initiative from EPFL, Switzerland])

Neuroanatomy from Mesoscopic to Nanoscopic Scales: An Improved Method for the Observation of Semithin Sections by High-Resolution Scanning Electron Microscopy

Semithin sections are commonly used to examine large areas of tissue with an optical microscope, in order to locate and trim the regions that will later be studied with the electron microscope. Ideally, the observation of semithin sections would be from mesoscopic to nanoscopic scales directly, instead of using light microscopy and then electron microscopy (EM). Here we propose a method that makes it possible to obtain high-resolution scanning EM images of large areas of the brain in the millimeter to nanometer range. Since our method is compatible with light microscopy, it is also feasible to generate hybrid light and electron microscopic maps. Additionally, the same tissue blocks that have been used to obtain semithin sections can later be used, if necessary, for transmission EM, or for focused ion beam milling and scanning electron microscopy (FIB-SEM)