Methods of genetic diversity creation and functional display for directed evolution experiments

Protein engineering aims to improve the properties of enzymes and affinity reagents by genetic changes. Typical engineered properties are affinity, specificity, stability, expression, and solubility. Because proteins are complex biomolecules, the effects of specific genetic changes are seldom predictable. Consequently, a popular strategy in protein engineering is to create a library of genetic variants of the target molecule, and render the population in a selection process to sort the variants by the desired property. This technique, called directed evolution, is a central tool for trimming protein-based products used in a wide range of applications from laundry detergents to anti-cancer drugs. New methods are continuously needed to generate larger gene repertoires and compatible selection platforms to shorten the development timeline for new biochemicals. In the first study of this thesis, primer extension mutagenesis was revisited to establish higher quality gene variant libraries in Escherichia coli cells. In the second study, recombination was explored as a method to expand the number of screenable enzyme variants. A selection platform was developed to improve antigen binding fragment (Fab) display on filamentous phages in the third article and, in the fourth study, novel design concepts were tested by two differentially randomized recombinant antibody libraries. Finally, in the last study, the performance of the same antibody repertoire was compared in phage display selections as a genetic fusion to different phage capsid proteins and in different antibody formats, Fab vs. single chain variable fragment (ScFv), in order to find out the most suitable display platform for the library at hand. As a result of the studies, a novel gene library construction method, termed selective rolling circle amplification (sRCA), was developed. The method increases mutagenesis frequency close to 100% in the final library and the number of transformants over 100-fold compared to traditional primer extension mutagenesis. In the second study, Cre/loxP recombination was found to be an appropriate tool to resolve the DNA concatemer resulting from error-prone RCA (epRCA) mutagenesis into monomeric circular DNA units for higher efficiency transformation into E. coli. Library selections against antigens of various size in the fourth study demonstrated that diversity placed closer to the antigen binding site of antibodies supports generation of antibodies against haptens and peptides, whereas diversity at more peripheral locations is better suited for targeting proteins. The conclusion from a comparison of the display formats was that truncated capsid protein three (p3Δ) of filamentous phage was superior to the full-length p3 and protein nine (p9) in obtaining a high number of uniquely specific clones. Especially for digoxigenin, a difficult hapten target, the antibody repertoire as ScFv-p3Δ provided the clones with the highest affinity for binding. This thesis on the construction, design, and selection of gene variant libraries contributes to the practical know-how in directed evolution and contains useful information for scientists in the field to support their undertakings.Proteiinien muokkauksella tähdätään entsyymien ja sitojareagenssien ominaisuuksien parantamiseen geneettisten muutosten avulla. Tyypillisiä parannettavia ominaisuuksia ovat sitomisvoimakkuus, spesifisyys, kestävyys, tuotto-ominaisuudet ja liukoisuus. Koska proteiinit ovat monimutkaisia biomolekyylejä, geneettisten muutosten vaikutukset ovat vain harvoin tarkkaan ennustettavissa. Siksi suosittu proteiinien muokkausstrategia on luoda kohdemolekyylistä lukuisia geenivariantteja ja asettaa luotu joukko valintakokeeseen, jonka perusteella variantit erottuvat toisistaan tavoitellun ominaisuuden perusteella. Tämä suunnattuna evoluutiona tunnettu tekniikka on keskeinen työkalu kehitettäessä proteiinituotteita, joita käytetään monenlaisissa sovelluksissa vaatteiden pesuaineista syöpälääkkeisiin. Proteiinituotteiden kehitystyön nopeuttaminen edellyttää jatkuvasti uusia menetelmiä, joilla voidaan rakentaa aiempaa laajempia geenikirjastoja ja niille yhteensopivia valintatyökaluja. Tässä työssä tutkittiin alukepidennysmutageneesitekniikan mahdollisuuksia korkealaatuisempien geenivarianttikirjastojen rakentamiseksi Escherichia coli-bakteerin soluihin. Toisessa osajulkaisussa tutkittiin rekombinaatiota menetelmänä, jolla voitaisiin lisätä seulottavissa olevien entsyymivarianttien lukumäärää. Kolmannessa osajulkaisussa kehitettiin valintaprosessi, jonka tarkoituksena oli parantaa vastaainefragmenttien ilmentymistä filamenttifaagin pinnalla näyttötekniikkaa varten. Neljännessä osajulkaisussa testattiin geenikirjaston suunnittelustrategioita käytännössä kahdella eri periaatteiden mukaan monimuotoistetulla vasta-ainekirjastolla. Viimeisessä osajulkaisussa vertailtiin faagin eri pintaproteiineihin fuusioidun vasta-ainekirjaston toimintaa valintakokeiden avulla. Samalla tutkittiin vasta-ainefragmenttien Fab (engl. antigen binding fragment) ja ScFv (engl. single-chain fragment of antibody variable domains) vaikutusta valintakokeen onnistumiseen, jotta selviäisi, mikä on käyttökelpoisin näyttötekniikka käytössä olevan kirjaston hyödyntämiseksi. Tutkimuksen tuloksena kehitettiin uusi geenivarianttikirjaston rakennusmenetelmä nimeltään sRCA (engl. selective rolling circle amplification), joka lisää merkittävästi mutageneesitehokkuutta ja jopa yli satakertaistaa kirjaston muodostavien transformanttien määrän verrattuna tavanomaiseen alukepidennysmutageneesiin. Toisessa osajulkaisussa havaittiin Cre-loxP-rekombinaation olevan sovelias työkalu RCA-satunnaismutageneesin tuloksena syntyvän DNA-vyyhdin pilkkomiseen kehämäisiksi plasmidiyksiköiksi. Uusi menetelmä lisäsikin DNA:n transformaatiotehokkuutta E. coli-bakteeriin. Kirjastoseulontojen avulla osoitettiin, että kirjastosta, jossa aminohappojen vaihtelua esiintyi lähempänä vasta-aineen sitomiskohdan keskustaa, löytyi enemmän pienmolekyylejä ja peptidejä tunnistavia vasta-aineita. Ulompana keskustasta sijaitsevien aminohappojen vaihtelu puolestaan tuki proteiineja tunnistavien vasta-aineiden kehitystyötä. Vasta-ainekirjaston faaginäyttötekniikkavertailun johtopäätökset olivat, että käyttämällä filamenttifaagin vasta-aineiden fuusiokumppanina lyhennettyä proteiini kolmea (p3Δ) pystyttiin eristämään runsaammin erilaisia kohdetta tunnistavia vasta-ainemolekyylejä kuin käyttämällä kokopitkää proteiini kolmea tai proteiini yhdeksää (p9). Erityisesti ScFvp3Δ- formaatissa oleva kirjasto tarjosi sitomisvoimakkuudeltaan parhaita vasta-aineita molekyylikooltaan pienen digoksigeniinin tunnistukseen. Tutkimus geenivarianttikirjastojen suunnittelusta, rakentamisesta ja seulontaan soveltuvista valintatyökaluista lisää käytännön tietoa suunnattujen evoluutiokokeiden toteuttamiseksi ja on arvokasta tietoa alan tutkijoille heidän tulevissa hankkeissaan.Siirretty Doriast

Suunnatun evoluution saavutuksia

Evoluutioteoriasta puhuttaessa viitataan yleisimmin biologiassa vallalla olevaan käsitykseen, jolla selitetään eliölajien syntyä. Sen sijaan vähemmälle huomiolle on jäänyt, että evoluutiota on hyödynnetty myös työkaluna lukuisissa laboratorioissa jo useamman vuosikymmenen ajan. Tämän suunnatuksi evoluutioksi kutsutun laboratoriotekniikan avulla on kehitetty lukuisia ihmiskuntaa hyödyttäviä proteiinipohjaisia tuotteita, kuten teollisuusentsyymejä ja lääkeainemolekyylejä. Tässä artikkelissa avataan suunnatun evoluutiotekniikan toimintaperiaatetta, historiaa ja tähänastisia saavutuksia. Artikkeli syventää viime vuoden Millennium-teknologiapalkintoon liittyvää uutisointia, jolloin suunnatun evoluutiotekniikan uranuurtaja professori Frances Arnold palkittiin elämäntyöstään.&nbsp

Yhdysvaltalaisjoukkojen taktisten käyttöperiaatteiden kehittyminen Irakin sodassa

Yhdysvallat hyökkäsi Irakiin vuoden 2003 maaliskuussa aloittaen Irakin sodan. Irakin tavan-omaiset asevoimat kukistuivat kolmessa viikossa. Sota muuttui pian kumoukselliseksi, mikä yllätti Yhdysvallat ja sen asevoimat. Tutkimustehtävänä oli selvittää, miten yhdysvaltalais-joukkojen taktiset käyttöperiaatteet kehittyivät Irakin sodassa vuosina 2004–2008. Tutkimus toteutettiin laadullisella otteella pyrkien ymmärtämään ilmiötä muutoksien taus-talla. Tutkimusstrategiaksi valittiin tapaustutkimus, ja vertailtaviksi tapauksiksi vuosien 2004 ja 2008 Bagdadin taistelut. Analyysi toteutettiin aineistolähtöisenä sisällönanalyysinä. Tut-kimuksen tärkein aineisto kerättiin yhdysvaltalaisista ohjesäännöistä sekä tutkimusrapor-teista. Sitä täydennettiin artikkeleilla ja historiateoksilla. Vuoden 2004 Bagdadin taisteluissa tärkeimmiksi taktisiksi käyttöperiaatteiksi nousivat sen-soritiedustelu, ratsiat, suorituskykyjen yhdistetty käyttö, taistelua tukevien elementtien alis-taminen sekä koulutustehtävät. Välivuosina havaittiin, että ohjesääntöjä tuli päivittää, mikä johti uuden ohjesäännön julkai-suun vuonna 2006. Lopputuotteena oli Field Manual 3-24 – Counterinsurgency, joka pyrki ratkaisemaan sodassa havaittuja ongelmia. Näitä olivat muun muassa sensoritiedustelun ra-joitukset ja henkilötiedustelun puute, liiallinen voimankäyttö, tukikohtien sijoittelu, johta-miskulttuuri sekä operaatioon valmistava koulutus. Osa näistä koki muutoksia jo ennen oh-jesäännön julkaisua. Vuoden 2008 Bagdadin taisteluissa uusiksi taktisiksi käyttöperiaatteiksi nousivat taistelutilan eristäminen, vartioasemien perustaminen, operointi pimeällä ja henkilötiedustelu. Partiointi ja suorituskykyjen yhdistetty käyttö pysyivät lähes samoina. Tulosten perusteella voidaan päätellä, että taktisista käyttöperiaatteista partiointi, ratsiat ja suorituskykyjen yhdistetty käyttö pysyivät melko samanlaisina tarkastelujakson alusta lop-puun. Suurimmat muutokset kokivat tiedustelutoimiala, tukikohtien ja joukkojen sijoittelu toiminta-alueelle, ratsioiden painottuminen pimeän aikaan sekä joukkojen käyttö taistelutilan eristämiseen. Ohjesäännön vaikutus tähän on selvästi nähtävissä. Kuitenkin yksittäisten käyt-töperiaatteiden kehittämisen sijasta tärkeämpää on sen vaikutus operaatioiden suunnitteluun ja johtamiseen. Vaikuttaa siltä, että ohjesääntö ja sen pohjalta annettu koulutus onnistui sito-maan eri toimijat ja operaatiolinjat paremmin yhteen. Se toi taisteluoperaatioihin pitkäjäntei-syyttä esittämällä yhdysvaltalaisille uusia näkökulmia vastakumouksellisuuteen. Täten yh-dessä muiden toimijoiden kanssa vihollinen onnistuttiin puhdistamaan Bagdadin asuinalu-eilta osana pitkän aikavälin vakauttamista

Effects of partial thermalization on HBT interferometry

Hydrodynamical models have generally failed to describe interferometry radii measured at RHIC. In order to investigate this ``HBT puzzle'', we carry out a systematic study of HBT radii in ultrarelativistic heavy-ion collisions within a two-dimensional transport model. We compute the transverse radii $R_o$ and $R_s$ as functions of $p_t$ for various values of the Knudsen number, which measures the degree of thermalization in the system. For realistic values of the Knudsen number estimated from $v_2$ data, we obtain $R_o/R_s \simeq 1.2$, much closer to data than standard hydrodynamical results. Femtoscopic observables vary little with the degree of thermalization. Azimuthal oscillations of the radii in non central collisions do not provide a good probe of thermalization.Comment: Proceedings for Quark Matter 2009, Knoxville, TN US

Synonymous Codons and Hydrophobicity Optimization of Post-translational Signal Peptide PelB Increase Phage Display Efficiency of DARPins

DsbA leader peptide targets proteins for cotransla-tional translocation by signal recognition particle (SRP) pathway and has been the standard signal sequence for filamentous phage display of fast-folding Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins). In contrast, translocation of DARPins via the post-translational pathway, for example, with the commonly used PelB leader, has been reported to be highly inefficient. In this study, two PelB signal sequence libraries were screened covering different regions of the leader peptide for identifying mutants with improved display of DARPins on phage. A PelB variant with the most favorable combination of synonymous mutations in the n-region and hydrophobic substitutions in the h-region increased the display efficiency of a DARPin library 44-and 12-fold compared to PelBWT and DsbA, respectively. Based on thioredoxin-1 (TrxA) export studies the triple valine mutant PelB DN5 V3 leader was capable of more efficient cotranslational translocation than PelBWT, but the overall display efficiency improvement over DsbA suggests that besides increased cotranslational translocation other factors contribute to the observed enhancement in DARPin display efficiency

Split & mix assembly of DNA libraries for ultrahigh throughput on-bead screening of functional proteins.

Site-saturation libraries reduce protein screening effort in directed evolution campaigns by focusing on a limited number of rationally chosen residues. However, uneven library synthesis efficiency leads to amino acid bias, remedied at high cost by expensive custom synthesis of oligonucleotides, or through use of proprietary library synthesis platforms. To address these shortcomings, we have devised a method where DNA libraries are constructed on the surface of microbeads by ligating dsDNA fragments onto growing, surface-immobilised DNA, in iterative split-and-mix cycles. This method-termed SpliMLiB for Split-and-Mix Library on Beads-was applied towards the directed evolution of an anti-IgE Affibody (ZIgE), generating a 160,000-membered, 4-site, saturation library on the surface of 8 million monoclonal beads. Deep sequencing confirmed excellent library balance (5.1% ± 0.77 per amino acid) and coverage (99.3%). As SpliMLiB beads are monoclonal, they were amenable to direct functional screening in water-in-oil emulsion droplets with cell-free expression. A FACS-based sorting of the library beads allowed recovery of hits improved in Kd over wild-type ZIgE by up to 3.5-fold, while a consensus mutant of the best hits provided a 10-fold improvement. With SpliMLiB, directed evolution workflows are accelerated by integrating high-quality DNA library generation with an ultra-high throughput protein screening platform.ERC, EU H202

Site-Specific Linking of an Oligonucleotide to Mono- and Bivalent Recombinant Antibodies with SpyCatcher-SpyTag System for Immuno-PCR

Antibody-oligonucleotide conjugates (AOCs) are a versatile class of chimeric biomolecules for therapeutics and biotechnological applications. Most widely employed chemical labeling methods for proteins are based on targeting of Lys or Cys residues that leads to mixed stoichiometry in the degree of conjugation and may interfere with antigen binding, thus, compromising the function of the antibody. A site-specific oligonucleotide conjugation technology providing full control over valency in mild reaction conditions would be an advancement to the state-of-the-art in bioconjugation. Herein, we demonstrate the production of single-chain variable fragment antibodies with fused SpyCatcher (scFv-SpyCatcher, monovalent) and alkaline phosphatase-SpyCatcher (scFv-AP-SpyCatcher, bivalent) on C-terminus and their conjugation to SpyTag002-oligonucleotide in phosphate-buffered saline (PBS). The formation of a covalent isopeptide bond between the protein and SpyTag002-oligonucleotide was confirmed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis, and the functionality of the obtained AOCs was confirmed in immuno-polymerase chain reaction (PCR) assays for the detection of microcystin-LR and 17β-estradiol. Based on time-resolved fluorescence immunoassays with scFv-AP fusion constructs, we observed that the SpyCatcher and SpyCatcher-SpyTag002-oligonucleotide part lowered the absolute signal obtained from the assay by 27.6 and 48.4% at 2 nM and by 26.2 and 27.6% at 100 pM microcystin-LR and 17β-estradiol concentrations, respectively. Nevertheless, the overall sensitivity of the immuno-PCR assays was similar to the time-resolved fluorescence immunoassays performed with the same components. In this study, vectors for SpyCatcher-fusion construction were created for directional cloning with SfiI sites enabling the rapid generation of AOC constructs for site-specific SpyTag-oligonucleotide conjugation.</p

Primer Extension Mutagenesis Powered by Selective Rolling Circle Amplification

Primer extension mutagenesis is a popular tool to create libraries for in vitro evolution experiments. Here we describe a further improvement of the method described by T.A. Kunkel using uracil-containing single-stranded DNA as the template for the primer extension by additional uracil-DNA glycosylase treatment and rolling circle amplification (RCA) steps. It is shown that removal of uracil bases from the template leads to selective amplification of the nascently synthesized circular DNA strand carrying the desired mutations by phi29 DNA polymerase. Selective RCA (sRCA) of the DNA heteroduplex formed in Kunkel's mutagenesis increases the mutagenesis efficiency from 50% close to 100% and the number of transformants 300-fold without notable diversity bias. We also observed that both the mutated and the wild-type DNA were present in at least one third of the cells transformed directly with Kunkel's heteroduplex. In contrast, the cells transformed with sRCA product contained only mutated DNA. In sRCA, the complex cell-based selection for the mutant strand is replaced with the more controllable enzyme-based selection and less DNA is needed for library creation. Construction of a gene library of ten billion members is demonstrated with the described method with 240 nanograms of DNA as starting material

Tulenjohtamisen tarkkuuden ja nopeuden kehittäminen

Tulenjohtaminen on prosessi, joka alkaa vihollisen havaitsemisesta ja päättyy tulitehtävän toteutumiseen. Tulenjohtamisen nopeuden ja tarkkuuden kannalta kriittisimmät alueet ovat maalinpaikannuksessa ja mittaustöissä. Puolustusvoimien käynnisti vuonna 2009 hankkeen, jonka tarkoituksena oli luoda integroitu tiedustelu-, valvonta- ja tulenjohtojärjestelmä. Osana tätä järjestelmää hankittiin muun muassa uusia maalinpaikannuslaitteita. Tutkimus toteutettiin lähdeaineistoanalyysinä, ja johtopäätöksiin päädyttiin vertailemalla vanhaa tulenjohtokalustoa uuteen kalustoon. Tällä luotiin näkemys vanhan ja uuden järjestelmän suorituskykyeroista, haasteista ja mahdollisuuksista. Pääosan lähdeaineistosta muodostivat puolustusvoimien oppaat ja ohjesäännöt. Vanhalla tulenjohtokalustolla päästään noin viiden piirun ja metrin mittaustarkkuuteen. Uusi maalinpaikannuslaite 15 tuottaa suunnan samalla tarkkuudella ja hyrräsuuntakehän ollessa kytketty laitteeseen suunta saadaan mitattua kahden piirun tarkkuudella. Etäisyys mitataan alle kahden metrin tarkkuudella. Maalinpaikannuslaite 15 kykenee siirtämään tuotetun paikkatiedon suoraan MATI-päätelaitteen tulenjohtosovellukselle. Tutkimuksessa perusteella voidaan sanoa, että uusi tulenjohtokalusto parantaa tulenjohdon tarkkuutta, ja antaa perusteet metriluokan maalinpaikannukselle. Lisäksi se nopeuttaa tulenjohtoprosessia automaattisten tiedonsiirto-ominaisuuksiensa puolesta. Se vähentää myös ihmisen toimista johtuvia virheitä ja nopeuttaa niiden havaitsemista, sillä maalinpaikannuslaite 15 tuottaa mitatusta kohteesta kuvan, jonka avulla tulenjohtaja varmistuu mitatun koh-teen oikeellisuudesta. Automaattinen tiedonsiirto vähentää näppäilyvirheiden määrää. Tällä hetkellä tulenjohtosovellus itsessään ei ymmärrä metriluokan koordinaatteja, vaan pyöristää ne lähimpään kymmeneen metriin. Kun tämä ominaisuus lisätään sovellukseen ja AHJO-järjestelmään, perusteet metriluokan tulenjohtoon ovat olemassa. Pitää kuitenkin huomioida, että perinteinen epäsuora tuli ei vaadi metriluokan paikannusta, vaan on edullisempaa, että tulen tiheys ei ole liian suuri. Metriluokan paikannusta saatetaan tarvita muun muassa ohjuksissa ja tykistön hakeutuvissa ammuksissa, jolloin uudesta suorituskyvystä saadaan hyöty irti

Multiplexed Affinity Characterization of Protein Binders Directly from a Crude Cell Lysate by Covalent Capture on Suspension Bead Arrays.

The precise determination of affinity and specificity is a crucial step in the development of new protein reagents for therapy and diagnostics. Paradoxically, the selection of protein binders, e.g., antibody fragments, from large combinatorial repertoires is a rapid process compared to the subsequent characterization of selected clones. Here we demonstrate the use of suspension bead arrays (SBA) in combination with flow cytometry to facilitate the post-selection analysis of binder affinities. The array is designed to capture the proteins of interest (POIs) covalently on the surface of superparamagnetic color-coded microbeads directly from expression cell lysate, based on SpyTag-SpyCatcher coupling by isopeptide bond formation. This concept was validated by analyzing the affinities of a typical phage display output, i.e., clones consisting of single-chain variable fragment antibodies (scFvs), as SpyCatcher fusions in 12- and 24-plex SBA formats using a standard three-laser flow cytometer. We demonstrate that the equilibrium dissociation constants (Kd) obtained from multiplexed SBA assays correlate well with experiments performed on a larger scale, while the antigen consumption was reduced >100-fold compared to the conventional 96-well plate format. Protein screening and characterization by SBAs is a rapid and reagent-saving analytical format for combinatorial protein engineering to address specificity maturation and cross-reactivity profiling of antibodies.Acknowledgements (....) This work was supported by the Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) and the EU’s Horizon 2020 programme. TH and LL received individual postdoctoral EU Marie-Curie fellowships. FH is an ERC Advanced Investigator (695669)