Desarrollo y validación de biosensores de levadura para vías de señalización

TesisLa bioconversión eficiente de la pentosa Xylose es vital para el desarrollo de biorefinerías de lignocelulosa competentes. Aunque se han realizado muchos intentos adecuados de ingeniería metabólica para la utilización de xilosa recombinante en Saccharomyces cerevisiae, el crecimiento con xilosa está todavía lejos de ser óptimo. Los hallazgos previos señalan una explicación más compleja a esta característica que involucra interacciones entre la xilosa y las vías de señalización. Para evaluar esta cuestión, hemos desarrollado y validado un panel de cepas de biosensores de levadura GFP para la caracterización de tres vías de señalización (Snf3 / Rgt2, Snf1 / Mig1, cAMP / PKA) cuando se someten a diferentes condiciones de xilosa. Curiosamente, la presencia de 50 g / L de xilosa sola no desencadenó ningún efecto sobre estas vías de señalización, sin embargo, cuando se presentaba una condición mixta de 50 g / L de xilosa y 5 g / L, se observaron patrones de inducción más elevados tan In glucosa 5 g / L Para los transportadores de hexosa de baja afinidad (HXT2 y HXT4) y el gen UC2. En conjunto, estos resultados apoyan la hipótesis de que la xilosa sola produce una verdadera respuesta de inanición en cepas de S. cerevisiae W303 no modificadas en lugar de una respuesta de carbono no fermentable. Además, se ha adquirido suficiente información para proponer que las condiciones mixtas de glucosa y xilosa producen un efecto más profundo en la señalización que debería investigarse más a fondo.Tesi

Real-time monitoring of the sugar sensing in Saccharomyces cerevisiae indicates endogenous mechanisms for xylose signaling

The sugar sensing and carbon catabolite repression in Baker’s yeast Saccharomyces cerevisiae is governed by three major signaling pathways that connect carbon source recognition with transcriptional regulation. Here we present a screening method based on a non-invasive in vivo reporter system for real-time, single-cell screening of the sugar signaling state in S. cerevisiae in response to changing carbon conditions, with a main focus on the response to glucose and xylose.ResultsThe artificial reporter system was constructed by coupling a green fluorescent protein gene (yEGFP3) downstream of endogenous yeast promoters from the Snf3p/Rgt2p, SNF1/Mig1p and cAMP/PKA signaling pathways: HXT1p/2p/4p; SUC2p, CAT8p; TPS1p/2p and TEF4p respectively. A panel of eight biosensors strains was generated by single copy chromosomal integration of the different constructs in a W303-derived strain. The signaling biosensors were validated for their functionality with flow cytometry by comparing the fluorescence intensity (FI) response in the presence of high or nearly depleted glucose to the known induction/repression conditions of the eight different promoters. The FI signal correlated with the known patterns of the selected promoters while maintaining a non-invasive property on the cellular phenotype, as was demonstrated in terms of growth, metabolites and enzyme activity.ConclusionsOnce verified, the sensors were used to evaluate the signaling response to varying conditions of extracellular glucose, glycerol and xylose by screening in 96-well microtiter plates. We show that these yeast strains, which do not harbor any recombinant pathways for xylose utilization, are lacking a signaling response for extracellular xylose. However, for the HXT2p/4p sensors, a shift in the flow cytometry population dynamics indicated that internalized xylose does affect the signaling. These results suggest that the previously observed effects of this pentose on the S. cerevisiae physiology and gene regulation can be attributed to xylose and not only to a lack of glucose