Zellbiologische und biochemische Charakterisierung des Ustilago maydis Virulenzfaktors Mcs1(Myosin-Chitinsynthase 1)

Infektionen von Wirtspflanzen durch pathogene Pilze erfordert polares Spitzenwachstum, ein Prozess, der die kontinuierliche polare Anlieferung von Zellwandkomponenten und Enzymen, wie Chitinsynthasen (CHS), entlang des Cytoskeletts benötigt. Klasse V CHS sind als Virulenzfaktoren für die pathogene Entwicklung essentiell. Diese potentiellen molekularen Motoren bestehen aus einer Myosin-Motordomäne (MMD), die mit einer CHS-Domäne fusioniert sind. Letztere ist am Aufbau der pilzlichen Zellwand beteiligt, die Rolle der MMD bleibt bisher ungeklärt. Eine nahe liegende Rolle könnte die MMD-vermittelte Anlieferung sekretorischer Vesikel (Chitosomen) zur Wachstumszone sein. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss beider Domänen in Mcs1, der Klasse V CHS in U. maydis, untersucht. Durch quantitative Analysen von Krankheitssymptomen, Besiedlung der Pflanze und Auswertungen morphometrischer Parameter wurde gezeigt, dass beide Domänen essentielle, jedoch ungleiche Rollen, für die pathogene Entwicklung von U. maydis spielen. Während der Phänotyp der G3Mcs1Chsdead-Mutante dem der Deletionsmutante ähnelt, konnte die Besiedelung des Pflanzengewebes durch Stämme, die Defekte in der Motordomäne aufwiesen, noch teilweise erfolgen. mcs1-Deletionsmutanten und CHS-aktivitätsdefekte Stämme werden schnell durch das pflanzliche Abwehrsystem erkannt und getötet. Mutanten bei denen die MMD deletiert wurden verursachen nur eine abgeschwächte Abwehrreaktion. Der Verlust der Klasse V CHS Aktivität führt vermutlich zu gravierenden Mängeln in der Zellwandzusammensetzung, wodurch polares in planta Wachstum gestört und der Infektionsprozess verlangsamt wird. Eine Folge dessen ist eine starke pflanzliche Abwehrreaktion, die durch die Bildung von H2O2 und lokalem Zelltod charakterisiert ist. Mikroskopische Untersuchungen zeigten, dass die apikale Mcs1-Lokalisierung von der eigenen MMD abhängt. Jedoch wurde auch beobachtet, dass noch wenige Chitosomen die Plasmamembran erreichen. Dadurch kann intrazelluläres Hyphenwachstum in begrenztem Maße erfolgen und U. maydis kann die Pflanzenzelle besiedeln. Eine Strukturanalyse verdeutlichte, dass trotz geringer Sequenzidentitäten die Mcs1 MMD der Struktur veröffentlichter Myosinmotoren ähnelt. Des Weiteren konnte belegt werden, dass die Mcs1 MMD an Aktin bindet und in der Lage ist Dimere auszubilden. In in vivo Motilitätsversuche wurde nachgewiesen, dass sich Mcs1-gebundende Chitosomen schnell und bi-direktional über lange Strecken bewegen und kurz bevor sie sekretiert werden in subapikalen Bereichen der Plasmamembran verharren. Die Insertion in die Membran erfolgt dabei selten und zufällig und es wurde gezeigt, dass die Verweildauer am Apex bei MMD-defizienten Mutanten signifikant verkürzt war. Wohingegen die apikale Mcs1-Akkumulation von F-Aktin und der eigenen MMD abhängt, spielen bei der Motilität von Chitosomen sowohl Aktin als auch Mikrotubuli eine Rolle und ist nicht abhängig von der MMD. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass die eigene MMD nicht für die apikale Anlieferung verantwortlich ist, sondern eher lokale Funktionen in der Exozytose von Chitosomen übernimmt

Disseminated cancer cells detected by immunocytology in lymph nodes of NSCLC patients are highly prognostic and undergo parallel molecular evolution

In melanoma, immunocytology (IC) after sentinel lymph node disaggregation not only enables better quantification of disseminated cancer cells (DCCs) than routine histopathology (HP) but also provides a unique opportunity to detect, isolate, and analyse these earliest harbingers of metachronous metastasis. Here, we explored lymph node IC in non-small cell lung cancer (NSCLC). For 122 NSCLC patients, 220 lymph nodes (LNs) were split in half and prepared for IC and HP. When both methods were compared, IC identified 22% positive patients as opposed to 4.5% by HP, revealing a much higher sensitivity of IC (p < 0.001). Assessment of all available 2,952 LNs of the same patients by HP uncovered additional patients escaping detection of lymphatic tumour spread by IC alone, consistent with the concept of skip metastasis. A combined lymph node status of IC and complete HP on a larger cohort of patients outperformed all risk factors in multivariable analysis for prognosis (p < 0.001; RR = 2.290; CI 1.407–3.728). Moreover, isolation of DCCs and single-cell molecular characterization revealed that (1) LN-DCCs differ from primary tumours in terms of copy number alterations and selected mutations and (2) critical alterations are acquired during colony formation within LNs. We conclude that LN-IC in NSCLC patients when combined with HP improves diagnostic precision, has the potential to reduce total workload, and facilitates molecular characterization of lymphatically spread cancer cells, which may become key for the selection and development of novel systemic therapies. © 2022 The Authors. The Journal of Pathology published by John Wiley & Sons Ltd on behalf of The Pathological Society of Great Britain and Ireland

Molecular profiling of single circulating tumor cells with diagnostic intention

Several hundred clinical trials currently explore the role of circulating tumor cell (CTC) analysis for therapy decisions, but assays are lacking for comprehensive molecular characterization of CTCs with diagnostic precision. We therefore combined a workflow for enrichment and isolation of pure CTCs with a non-random whole genome amplification method for single cells and applied it to 510 single CTCs and 189 leukocytes of 66 CTC-positive breast cancer patients. We defined a genome integrity index (GII) to identify single cells suited for molecular characterization by different molecular assays, such as diagnostic profiling of point mutations, gene amplifications and whole genomes of single cells. The reliability of >90% for successful molecular analysis of high-quality clinical samples selected by the GII enabled assessing the molecular heterogeneity of single CTCs of metastatic breast cancer patients. We readily identified genomic disparity of potentially high relevance between primary tumors and CTCs. Microheterogeneity analysis among individual CTCs uncovered pre-existing cells resistant to ERBB2-targeted therapies suggesting ongoing microevolution at late-stage disease whose exploration may provide essential information for personalized treatment decisions and shed light into mechanisms of acquired drug resistance

Zellbiologische und biochemische Charakterisierung des Ustilago maydis Virulenzfaktors Mcs1(Myosin-Chitinsynthase 1)

Infektionen von Wirtspflanzen durch pathogene Pilze erfordert polares Spitzenwachstum, ein Prozess, der die kontinuierliche polare Anlieferung von Zellwandkomponenten und Enzymen, wie Chitinsynthasen (CHS), entlang des Cytoskeletts benötigt. Klasse V CHS sind als Virulenzfaktoren für die pathogene Entwicklung essentiell. Diese potentiellen molekularen Motoren bestehen aus einer Myosin-Motordomäne (MMD), die mit einer CHS-Domäne fusioniert sind. Letztere ist am Aufbau der pilzlichen Zellwand beteiligt, die Rolle der MMD bleibt bisher ungeklärt. Eine nahe liegende Rolle könnte die MMD-vermittelte Anlieferung sekretorischer Vesikel (Chitosomen) zur Wachstumszone sein. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss beider Domänen in Mcs1, der Klasse V CHS in U. maydis, untersucht. Durch quantitative Analysen von Krankheitssymptomen, Besiedlung der Pflanze und Auswertungen morphometrischer Parameter wurde gezeigt, dass beide Domänen essentielle, jedoch ungleiche Rollen, für die pathogene Entwicklung von U. maydis spielen. Während der Phänotyp der G3Mcs1Chsdead-Mutante dem der Deletionsmutante ähnelt, konnte die Besiedelung des Pflanzengewebes durch Stämme, die Defekte in der Motordomäne aufwiesen, noch teilweise erfolgen. mcs1-Deletionsmutanten und CHS-aktivitätsdefekte Stämme werden schnell durch das pflanzliche Abwehrsystem erkannt und getötet. Mutanten bei denen die MMD deletiert wurden verursachen nur eine abgeschwächte Abwehrreaktion. Der Verlust der Klasse V CHS Aktivität führt vermutlich zu gravierenden Mängeln in der Zellwandzusammensetzung, wodurch polares in planta Wachstum gestört und der Infektionsprozess verlangsamt wird. Eine Folge dessen ist eine starke pflanzliche Abwehrreaktion, die durch die Bildung von H2O2 und lokalem Zelltod charakterisiert ist. Mikroskopische Untersuchungen zeigten, dass die apikale Mcs1-Lokalisierung von der eigenen MMD abhängt. Jedoch wurde auch beobachtet, dass noch wenige Chitosomen die Plasmamembran erreichen. Dadurch kann intrazelluläres Hyphenwachstum in begrenztem Maße erfolgen und U. maydis kann die Pflanzenzelle besiedeln. Eine Strukturanalyse verdeutlichte, dass trotz geringer Sequenzidentitäten die Mcs1 MMD der Struktur veröffentlichter Myosinmotoren ähnelt. Des Weiteren konnte belegt werden, dass die Mcs1 MMD an Aktin bindet und in der Lage ist Dimere auszubilden. In in vivo Motilitätsversuche wurde nachgewiesen, dass sich Mcs1-gebundende Chitosomen schnell und bi-direktional über lange Strecken bewegen und kurz bevor sie sekretiert werden in subapikalen Bereichen der Plasmamembran verharren. Die Insertion in die Membran erfolgt dabei selten und zufällig und es wurde gezeigt, dass die Verweildauer am Apex bei MMD-defizienten Mutanten signifikant verkürzt war. Wohingegen die apikale Mcs1-Akkumulation von F-Aktin und der eigenen MMD abhängt, spielen bei der Motilität von Chitosomen sowohl Aktin als auch Mikrotubuli eine Rolle und ist nicht abhängig von der MMD. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass die eigene MMD nicht für die apikale Anlieferung verantwortlich ist, sondern eher lokale Funktionen in der Exozytose von Chitosomen übernimmt

Sequence conservation of Pit2 in related smut fungi and the role of a conserved domain for interaction with cysteine proteases.

<p>(<b>A</b>) Alignment of <i>U. maydis</i> Pit2 (Um01375) and orthologs from the barley covered smut fungus <i>Ustilago hordei</i> (Uh02064) and the maize anther smut <i>Sporisorium reilianum</i> (Sr10529). Red box marks predicted secretion signals. Magenta labels identical (dark) and similar (light) amino acid residues. Orange box shows a 14 amino acid, highly conserved sequence stretch (residues 44–57). Green box marks the four aromatic residues that were addressed by targeted mutagenesis (see <a href="http://www.plospathogens.org/article/info:doi/10.1371/journal.ppat.1003177#ppat-1003177-t001" target="_blank">Table 1</a>). (<b>B</b>) Y2H analysis of Pit2 mutants carrying deletions of the conserved domain shown in (A). (<b>C</b>) Y2H of Pit2 mutants carrying mutations of the conserved domain shown in (A) and <a href="http://www.plospathogens.org/article/info:doi/10.1371/journal.ppat.1003177#ppat-1003177-t001" target="_blank">Table 1</a>. BD: Gal4 Binding Domain. AD: Gal4 Activation Domain.</p

Protease activity in apoplastic fluids of maize plants infected with <i>U. maydis</i>.

<p>Apoplastic fluid was isolated from maize leaves two days after infection with <i>U. maydis</i> strain SG200 or SG200Δpit2, respectively. Buffer: Apoplastic fluid extracts showing increased protease activity in SG200Δpit2 infected maize plants compared to SG200 wild type infections. E-64: Activity after treatment with 5 µM E-64. Pit2: Treatment with 10 µM recombinant Pit2 reduced protease activity in both samples below wild-type infected level. The same concentration of Pit2^mut49–53 did not cause reduction of protease activity. PID14: Treatment with 10 µM of the PID14 peptide completely inhibited protease activity; PID14^mut did not inhibit proteases. The experiment was carried out in three independent replicates; error bars represent SEM.</p

Activity of <i>N. benthamiana</i> expressed maize cysteine proteases and their inhibition by Pit2.

<p>Activity of CP2, CP1A, XCP2 and CatB that were transiently expressed in <i>N. benthamiana</i> using <i>A. tumefaciens</i> mediated transformation. Protease activity of CP2, CP1A and XCP2 was significantly inhibited by 10 µM of recombinant Pit2, while activity of CatB was not sensitive to Pit2. E-64 (5 µM) inhibited all four maize proteases. The experiment was carried out in three independent replicates; error bars represent SEM; P values were calculated by an unpaired t test. *P<0.05.</p