On-target restoration of a split T cell-engaging antibody for precision immunotherapy

T cell-engaging immunotherapies are changing the landscape of current cancer care. However, suitable target antigens are scarce, restricting these strategies to very few tumor types. Here, we report on a T cell-engaging antibody derivative that comes in two complementary halves and addresses antigen combinations instead of single molecules. Each half, now coined hemibody, contains an antigen-specific single-chain variable fragment (scFv) fused to either the variable light (V-L) or variable heavy (V-H) chain domain of an anti-CD3 antibody. When the two hemibodies simultaneously bind their respective antigens on a single cell, they align and reconstitute the original CD3-binding site to engage T cells. Employing preclinical models for aggressive leukemia and breast cancer, we show that by the combinatorial nature of this approach, T lymphocytes exclusively eliminate dual antigen-positive cells while sparing single positive bystanders. This allows for precision targeting of cancers not amenable to current immunotherapies

CD70-restricted specific activation of TRAILR1 or TRAILR2 using scFv:CD70-TRAIL mutants

Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, den T-Zell-inhibierenden Effekt eines CD70-blockierenden Antikörpers mit einer Fc-unabhängigen Zelltod-induzierenden Aktivität auf CD70-exprimierende Tumoren zu kombinieren. Dazu wurden Fusionsproteine hergestellt und untersucht, die aus einer CD70-bindenden scFv-Domäne sowie aus einer TRAIL-Domäne bestehen. Der CD70-spezifische monoklonale Antikörper lαhCD70 sowie der beretis bekannte hCD70-spezifische Antikörper 1F6 blockieren mit hoher Effizienz die CD27/CD70-Interaktion von CD70-exprimierenden Zelllinien (Mino, OVCAR-3, U-266) und inhibieren dadurch die Induktion der IL8-Produktion durch diese Zellen in kokultivierten HT1080-CD27-Zellen. IL8 wird durch den klassischen NFκB-Signalweg reguliert und ist für den pro-angiogenetischen Effekt von entscheidender Bedeutung (Abb. 2, 3). Mit Hilfe zellulärer Gleichgewichtsbindungsstudien mit mono- und trimeren scFv:lαhCD70-GpL-Fusionsproteinen (Abb. 4) auf Mino- und OVCAR-3-Zellen konnte gezeigt werden, dass die Trimerisierung in beiden Zelllinien zu einer Steigerung der apparenten Affinität der scFv:lαhCD70-CD70 Interaktion führt und damit einen Effekt auf die CD70-Belegung hat (Abb. 5). Für die Konstruktion der Fusionsproteine wurde sowohl Wildtyp-TRAIL als auch TRAIL-Mutanten mit Präferenz für den TRAILR1 oder TRAILR2 verwendet. Die TRAILR-Präferenz der verwendeten TRAIL-Mutanten (wt, mutR1, mutR2) wurde nicht nur in zellulären GpL-Bindungsstudien (Abb. 7) sondern zusätzlich auch in TRAILR Immobilisierungsexperimenten (Abb. 8) bewiesen. Hier zeigte sich, dass bei TRAILR1 keine Interaktion mit TRAILmutR2, so wie bei TRAILR2 keine signifikante Bindung mit TRAILmutR1 erfolgte. Nur der TRAIL-Wildtyp band signifikant an beide TRAIL-Todesrezeptoren. Vitalitätsexperimente (Abb. 10) und Western-Blot Analysen der Caspase-Prozessierung (Abb. 11) bestätigten die starke TRAILR1- bzw. TRAILR2-Spezifität der TRAILmutR1- und TRAILmutR2-Varianten. Im Gegensatz zu den unvernetzten löslichen TRAIL-Trimeren waren nur die quervernetzten TRAIL-TNC-Varianten in der Lage, eine signifikante Apoptose-Signalkaskade bei relativ geringen Konzentrationen zu induzieren. Die toxischen ED50-Konzentrationen der unoligomerisierten TRAIL-Formen lagen um einen Faktor 100 höher als die der oligomerisierten Varianten. Zusammenfassend zeigten die ED50-Werte der Zytotoxizitätsexperimente von M2-oligomerisierten zu -unoligomerisierten trimeren TRAIL-Varianten bei allen Fusionskonstrukten und Zelllinien eine eindeutige Verstärkung der Apoptoseinduktion durch die M2-Quervernetzung. Bei Jurkat- und Mino-Zellen konnte größtenteils erst nach Oligomerisierung überhaupt eine Bioaktivität bzw. eine Zelltodinduktion beobachtet werden. In OVCAR-3-Zellen zeigte sich eine 100-1000 fache apoptotische Verstärkung durch die Oligomerisierung (Abb. 10). Weiterhin zeigten Zytotoxizitätsexperimente, dass sich durch Bindung an hCD70 das Ausmaß der Toxizität der Fusionsproteine auf allen CD70-exprimierenden Zelllinien 10-100x verstärkte (Abb. 15, 17). In Übereinstimmung mit der verstärkten TRAIL-Todesrezeptor-Aktivierung durch die CD70-Bindung der scFv-TRAIL-Fusionsproteine, konnte durch eine CD70-Blockade die Caspase-8 Aktivierung und die Prozessierung von Caspase-3 signifikant unterbunden werden (Abb. 18). Die Trimerisierung des scFv:lαhCD70-Antikörpers führte zu keiner Apoptose und beeinflußte auch nicht die Aktivität von TRAIL (Abb. 19) was belegt, dass die beobachteten Effekte auf einer stärkeren TRAIL-induzierten Apoptose nach CD70-Bindung der Konstrukte beruhen muss. Die Fusionsproteine beseitigen somit nachweislich einerseits das Problem der limitierenden Aktivität von löslichem TRAIL über ihre Verankerung an CD70 (Abb. 15-20) und anderseits die potentielle unerwünschte CD70-vermittelte protumorale CD27-Stimulation (Abb. 3). Darüber hinaus könnten die TRAILR-spezifischen TRAIL-Mutanten helfen, Nebeneffekte zu reduzieren, die primär durch den jeweils anderen TRAIL-Todesrezeptor vermittelt werden. Jedoch sind weiter Forschungen insbesondere in vivo Experimente notwendig, um Aussagen über Funktionalität, Halbwertszeiten, sowie Effektivität und Verträglichkeit treffen zu können.The aim of this work was to generate constructs that combine the CD27 stimulation inhibitory effect of blocking CD70 antibodies with an antibody-dependent cellular cytotoxicity(ADCC)-independent, cell death inducing molecule. To reach this goal we generated fusion proteins consisting of the apoptosis-inducing TNF family member TRAIL and a single-chain variable fragment (scFv) derived from a high affinity lama anti-human CD70 antibody (lαhCD70). A fusion protein of scFv:lαhCD70 and TNC-TRAIL, a stabilized form of soluble TRAIL, showed strongly enhanced apoptosis induction upon CD70 binding. In addition, this construct efficiently interfered with the CD70-CD27 interaction. The introduction of recently identified TRAIL-mutations that discriminate between TRAILR1 and TRAILR2 binding into the TRAIL-part of scFv:lαhCD70-TNC-TRAIL resulted in the TRAIL death receptor-specific fusion proteins with CD70-dependent activity. The fusion proteins eliminate on the one hand the problem of the limited activity of soluble TRAIL by anchoring to CD70 what confers membrane TRAIL-like activity to the constructs (Fig. 15-20). On the other hand, the constructs have the potential to block the unwanted CD70-mediated protumorale CD27 stimulation (Fig. 3). In addition, the TRAILR1-specific TRAIL mutant (Fig. 7, 8) could reduce unrecognized side effects mediated by TRAILR2 and vice versa. However, further research, particularly in vivo experiments are necessary to state about functionality, half-lives, as well as efficacy and tolerability of the constructs

Upscaling, Manufacturing and Test of a Centrifugal Particle Receiver

Previous successful tests and promising results of a Centrifugal Particle Receiver (CentRec) for high temperature solar applications has been achieved in a lab scale prototype with 7.5 kWth [1, 2, 3]. In a next step this receiver technology is scaled up to higher thermal power for a future pilot plant. This paper presents the optimization methodology of the design and technical solutions. It describes the manufacturing and assembly of the prototype and first tests and results of the commissioning including cold particle tests and prototype costs. Finally the paper gives an outlook on the planned further steps regarding hot lab tests and solar tests

First tests of a centrifugal particle receiver with a 1m² aperture

Particle receivers achieve significantly higher temperatures than state of the art molten salt solar towers. The centrifugal particle receiver is a direct absorption receiver with a simple control of the residence time of the particles in the receiver. The paper describes the cold testing including mechanics of the particle film and first hot testing using a 100 kWel infrared heater