Human Embryonic Stem Cell-Derived Mesenchymal Stroma Cells (hES-MSCs) Engraft In Vivo and Support Hematopoiesis without Suppressing Immune Function: Implications for Off-The Shelf ES-MSC Therapies.

Mesenchymal stroma cells (MSCs) have a high potential for novel cell therapy approaches in clinical transplantation. Commonly used bone marrow-derived MSCs (BM-MSCs), however, have a restricted proliferative capacity and cultures are difficult to standardize. Recently developed human embryonic stem cell-derived mesenchymal stroma cells (hES-MSCs) might represent an alternative and unlimited source of hMSCs. We therefore compared human ES-cell-derived MSCs (hES-MP002.5 cells) to normal human bone marrow-derived MSCs (BM-MSCs). hES-MP002.5 cells had lower yet reasonable CFU-F capacity compared with BM-MSC (8±3 versus 29±13 CFU-F per 100 cells). Both cell types showed similar immunophenotypic properties, i.e. cells were positive for CD105, CD73, CD166, HLA-ABC, CD44, CD146, CD90, and negative for CD45, CD34, CD14, CD31, CD117, CD19, CD 271, SSEA-4 and HLA-DR. hES-MP002.5 cells, like BM-MSCs, could be differentiated into adipocytes, osteoblasts and chondrocytes in vitro. Neither hES-MP002.5 cells nor BM-MSCs homed to the bone marrow of immune-deficient NSG mice following intravenous transplantation, whereas intra-femoral transplantation into NSG mice resulted in engraftment for both cell types. In vitro long-term culture-initiating cell assays and in vivo co-transplantation experiments with cord blood CD34+ hematopoietic cells demonstrated furthermore that hES-MP002.5 cells, like BM-MSCs, possess potent stroma support function. In contrast to BM-MSCs, however, hES-MP002.5 cells showed no or only little activity in mixed lymphocyte cultures and phytohemagglutinin (PHA) lymphocyte stimulation assays. In summary, ES-cell derived MSCs might be an attractive unlimited source for stroma transplantation approaches without suppressing immune function

Charakterisierung und Isolierung von humanen Mesenchymalen Stroma Stamm-/Vorläuferzell-Populationen

Humane MSC besitzen attraktive Eigenschaften (hohe Proliferations- und Differenzierungskapazität, Stroma Funktion, Immunmodulation), welche sie zu vielversprechende Kandidaten für die Zelltherapie machen. Kultivierte MSC sind jedoch heterogen und es ist wichtig ein Verständnis von den unterschiedlichen Zelltypen in den Kulturen zu erlangen. Der erste Teil dieser Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung von kultivierten MSC, mit dem Ziel Oberflächenmarker zu identifizieren, welche die direkte Isolierung von funktionell unterschiedlichen Sub-Populationen ermöglichen. Zu diesem Zweck wurden MSC mit Carboxyfluoresceine-succinimidylesther (CFSE) gefärbt, wodurch ihre Zellteilungsrate analysiert werden konnte. Der Vergleich von Genexpressionsprofilen von MSC, welche zuvor entsprechend ihrer funktionellen Parameter (Proliferationsrate) sortiert wurden, diente der Charakterisierung von potentiellen Sub-Populationen (Anteil von Vorläuferzellen, Differenzierungskapazität) und der Identifizierung von potentiellen Markern für diese Sub-Populationen. CFSE-gefärbte MSC wurden in schnell proliferierende Zellen (RDC), RDC mit geringem und mit hohem Vorwärts- und Seitwärtsstreulicht (lo/lo) und langsam/nicht proliferierende Zellen (SDC/NDC) sortiert. NDC und RDC, sowie RDC lo/lo und RDC hi/hi Populationen wurden mit Hilfe von Microarray Analysen verglichen, wodurch unterschiedlich exprimierte Gene identifiziert werden konnten. Zwei der Gene (FMOD, VCAM-1), die in NDC über-exprimiert wurden, korrespondierten zu Oberflächemolekülen, welche wiederum die prospektive Isolierung einer VCAM-1+/FMOD+ Sub-Population ermöglichte, deren Anteil in höheren Passagen anstieg. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass VCAM-1+/FMOD+ Populationen eine sehr geringere Anzahl an Vorläuferzellen beinhalteten und ein eingeschränktes Differenzierungspotential besessen. Diese Daten zeigen deutlich, dass MSC Kulturen funktionell unterschiedliche Zellen beinhalten. Des Weiteren wird gezeigt, dass die Sortierung von Zellen basierend auf ihren Proliferationsraten und Genexpressionsanalysen, zur Identifizierung von Oberflächenmarker und für die Charakterisierung von MSC Sub-Populationen genutzt werden können. Im zweiten Teil dieser Doktorarbeit wird der Phänotyp und die in situ Lokalisation von primären MSC im Knochenmark untersucht. Primäre Knochenmarks MSC sind von zentraler Bedeutung für die hämatopoetische Stammzellnische. Dennoch ist die exakte Mitwirkung von spezifizierten MSC Populationen in der Nischen Zusammensetzung und Funktion zur Zeit noch unbekannt. In dieser Studie wurden deshalb primäre Knochenmarks MSC basierend auf der differentiellen Expression von CD146 (MCAM) charakterisiert und es wurde dabei festgestellt, dass alle detektierbaren CFU-F in der lin-/CD271+/CD146+/CD45- aber auch in der lin-/CD271+/CD146-/low/CD45- Zellfraktionen angereichert waren. Beide Zellfraktionen, ungeachtet ihrer CD146 Expression, hatten einen ähnlichen Phäno- und Genotyp, konnten als typische MSC kultiviert werden und waren in der Lage, in vivo Stroma zu bilden. Interessanterweise wurde CD146 während der in vitro Kultivierung hoch reguliert und unter hypoxischen Bedingungen runter reguliert. Die differenzielle Expression von CD146 korrelierte zu Unterschieden in der in vivo Lokalisation, dabei waren CD146 co-exprimierende retikuläre Zellen hauptsächlich im Knochenmark und im perivaskulären Raum zu finden, wohingegen langgestreckte und abgeflachte endostale “bone-lining” MSC hauptsächlich nur CD271 exprimierten. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass hämatopoetische CD34 Zellen häufig in direkter Umgebung von perivaskulären und endostalen MSC zu finden sind. Daher schlussfolgern wir, dass die unterschiedliche Expression von CD146 eine Unterscheidung zwischen perivaskulären und endostalen Nischen-assoziierten MSC erlaubt.Primary human MSC are a population of adult stem cells residing in the bone marrow. The cells can in vitro easily be expanded in stromal cultures of adherent fibroblastic MSC. Cultured MSC are promising candidates for cell therapy because of their intriguing properties (high proliferation and differentiation capacity, microenvironmental function, immune-modulation). However, MSC cultures are heterogeneous and a better understanding of the heterogeneity of the cells that form the MSC cultures is critical. In the first part of this thesis, cultured MSC are investigated in order to find surface markers, which would allow the identification of functionally distinct sub-populations within MSC cultures. MSC were stained with carboxyfluoresceine-succinimidylesther (CFSE) for cell division tracking. Gene expression profiling of MSC that were sorted based on functional parameters (i.e. proliferation characteristics) was utilized to characterize potential MSC sub-populations (progenitor content, differentiation capacity) and to identify potential MSC sub-population markers. CFSE-stained MSC were sorted into rapidly-dividing cells (RDC), RDC with low (lo/lo) and with high (hi/hi) forward-/side-scatter properties, and slowly/non-dividing cells (SDC/NDC). CFU-F frequencies were lowest in NDC and highest in RDC lo/lo. Comparative microarray analysis of NDC versus RDC and RDC lo/lo versus RDC hi/hi populations identified differentially expressed genes. Two genes (FMOD, VCAM-1) up-regulated in NDC corresponded to cell surface molecules that enabled the prospective identification of a VCAM-1+/FMOD+ MSC sub-population, which increased with passage and showed very low progenitor activity and limited differentiation potential. These data clearly demonstrate functional differences within MSC cultures. Furthermore, this study shows that cell sorting based on proliferation characteristics and gene expression profiling can be utilized to identify surface markers for the characterization of MSC sub-populations. In the second part of the thesis the phenotype and the in situ localization of primary BM-MSC was investigated. Primary MSC in the bone marrow are of central importance for the hematopoietic stem cell (HSC) niche. However, the exact contribution of specified MSC populations to niche anatomy and function is currently unknown. Based on the differential expression of CD146 (MCAM) we therefore characterized primary human bone marrow MSC and found that all assayable CFU-F were highly and exclusively enriched not only in the lin-/CD271+/CD146+/CD45- cell fraction, but also in lin-/CD271+/CD146-/low/CD45- cells. Both cell fractions, regardless of their CD146 expression, shared a similar phenotype and genotype, gave rise to typical cultured MSC and reconstituted a stromal microenvironment in vivo. Interestingly, CD146 was up-regulated during in vitro culture, and down-regulated under hypoxic conditions. The differential expression of CD146 on primary MSC correlated to differences in in vivo localization as CD146 co-expressing reticular cells were primarily found in the marrow space and in perivascular regions, whereas bone-lining MSC primarily expressed CD271 alone. CD34 hematopoietic cells were found in close association with perivascular as well as bone-lining MSC. We therefore conclude that the differential expression of CD146 allows to distinguish between vascular versus endosteal niche-related MS

Mesenchymal Stem Cell Content of Human Vertebral Bone Marrow

Mesenchymal stem cells (MSCs) are capable of down-regulating alloimmune responses and promoting the engraftment of hematopoietic stem cells. MSCs may therefore be suitable for improving donor-specific tolerance induction in solid-organ transplantation. Cells from cadaveric vertebral bone marrow (V-BM), aspirated iliac crest-BM, and peripheral blood progenitor cells were compared. Cells were characterized by flow cytometry and colony assays. MSCs generated from V-BM were assayed for differentiation capacity and immunomodulatory function. A median 5.7×108 nucleated cells (NCs) were recovered per vertebral body. The mesenchymal progenitor, colony-forming unit-fibroblast, frequency in V-BM (11.6/105 NC, range: 6.0–20.0) was considerably higher than in iliac crest-BM (1.4/105 NC, range: 0.4–2.6) and peripheral blood progenitor cells (not detectable). MSC generated from V-BM had the typical MSC phenotype (CD105posCD73posCD45negCD34neg), displayed multilineage differentiation potential, and suppressed alloreactivity in mixed lymphocyte reactions. V-BM may be an excellent source for MSC cotransplantation approaches