Origin and impact of post-meiotic DNA double-strand breaks : from the fission yeast model to mammals

La spermiogenèse, phase post-méiotique de la spermatogenèse, se caractérise par des changements structuraux importants accompagnés d’une phase de fragmentation transitoire de l’ADN. Ces évènements, survenant dans un contexte haploïde, pourraient mener à une instabilité génétique et constituer une nouvelle composante de la variation intergénérationnelle. L’origine et les conséquences de ce mécanisme, décrit chez plusieurs espèces, restent à élucider. La levure à fission, Schizosaccharomyces pombe, est un modèle biologique bien établi et disposant de nombreux outils qui en font un atout puissant pour des études transgénérationnelles. Au cours de cette thèse, ce modèle de levure a ainsi été sélectionné, pour permettre un gain d’informations complémentaires au modèle murin, en vue d’établir les conséquences génétiques transgénérationnelles des cassures transitoires post-méiotiques et leur potentielle implication dans l’évolution et l’adaptation. La présence d’une phase de fragmentation post-méiotique de l’ADN a été confirmée chez la levure à fission, surlignant ainsi son caractère conservé chez les eucaryotes. L’utilisation de ce modèle a permis d’identifier et de caractériser l’action de l’endonucléase (Pnu1) associée à ce mécanisme. Une réduction significative de la fragmentation post-méiotique de l’ADN a été mesurée en absence de Pnu1 par électrophorèse en champ pulsé et par qTUNEL, une technique qui permet le marquage spécifique des cassures bicaténaires d’origine enzymatique. Une immunocapture des cassures bicaténaires de l’ADN suivie de séquençage à haut débit a été effectuée pour identifier les sites de cassures au cours de la gamétogenèse dans les souches pnu1+ et pnu1Δ. Il a été mis en évidence des sites préférentiels spécifiques aux étapes post-méiotiques en présence de fragmentation dépendante de Pnu1. Grâce à ces résultats, il sera possible d’établir les variations aux sites de ces cassures. Pnu1 est une nucléase conservée dans le domaine eucaryote et qui possède un homologue chez les mammifères nommé Endonucléase G (EndoG). Des immunohistochimies sur coupes testiculaires murines ont révélé une forte concentration de foci d’EndoG à des étapes qui coïncident avec la phase de fragmentation post-méiotique. Le modèle de levure utilisé nous a ainsi permis d’identifier la nucléase EndoG comme source potentielle de la fragmentation post-méiotique chez les mammifères.Abstract : Spermiogenesis, the post-meiotic phase of spermatogenesis, is characterized by significant structural changes accompanied by transient DNA fragmentation. These events, occurring in a haploid context, could lead to genetic instability and represent a new component of intergenerational variation. The origin and consequences of this mechanism, described in several species, remain to be elucidated. Fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a well-established biological model with many tools available that makes it a powerful asset for transgenerational studies. In this thesis, the fission yeast was thus selected to gain information that complements the knowledge obtained with the murine model. S. pombe will be a valuable model to establish the transgenerational genetic consequences of post-meiotic transient DNA double-strand breaks and their potential implication in evolution and adaptation. The presence of a post-meiotic DNA fragmentation phase has been confirmed in S. pombe, highlighting its conserved character in eukaryotes. The use of this yeast model has made it possible to identify and characterize the action of the endonuclease (Pnu1) associated with this mechanism. A significant reduction in post-meiotic DNA fragmentation was measured in the absence of Pnu1 by pulsed-field gel electrophoresis and by qTUNEL, a technique that allows the specific labeling of DNA double-strand breaks of enzymatic origin. Immunocapture of DNA double-strand breaks followed by NGS was performed to identify break hotspots during gametogenesis in pnu1+ and pnu1Δ strains. Preferential sites of breakage at post-meiotic steps have been highlighted in the presence of Pnu1-dependent fragmentation. These results will now allow us to establish potential variations at break sites. Pnu1 is a conserved nuclease in eukaryotes with a mammalian homolog termed Endonuclease G (EndoG). Immunohistochemistry on murine testicular sections revealed a high concentration of EndoG foci at steps that coincide with the post-meiotic fragmentation phase. The fission yeast model thus enabled us to identify EndoG as a potential source of post-meiotic fragmentation in mammals

Genetic Instability and Chromatin Remodeling in Spermatids

The near complete replacement of somatic chromatin in spermatids is, perhaps, the most striking nuclear event known to the eukaryotic domain. The process is far from being fully understood, but research has nevertheless unraveled its complexity as an expression of histone variants and post-translational modifications that must be finely orchestrated to promote the DNA topological change and compaction provided by the deposition of protamines. That this major transition may not be genetically inert came from early observations that transient DNA strand breaks were detected in situ at chromatin remodeling steps. The potential for genetic instability was later emphasized by our demonstration that a significant number of DNA double-strand breaks (DSBs) are formed and then repaired in the haploid context of spermatids. The detection of DNA breaks by 3’OH end labeling in the whole population of spermatids suggests that a reversible enzymatic process is involved, which differs from canonical apoptosis. We have set the stage for a better characterization of the genetic impact of this transition by showing that post-meiotic DNA fragmentation is conserved from human to yeast, and by providing tools for the initial mapping of the genome-wide DSB distribution in the mouse model. Hence, the molecular mechanism of post-meiotic DSB formation and repair in spermatids may prove to be a significant component of the well-known male mutation bias. Based on our recent observations and a survey of the literature, we propose that the chromatin remodeling in spermatids offers a proper context for the induction of de novo polymorphism and structural variations that can be transmitted to the next generation