Rnf165/Ark2C enhances BMP-smad signaling to mediate motor axon extension

Little is known about extrinsic signals required for the advancement of motor neuron (MN) axons, which extend over long distances in the periphery to form precise connections with target muscles. Here we present that Rnf165 (Arkadia-like; Arkadia2; Ark2C) is expressed specifically in the nervous system and that its loss in mice causes motor innervation defects that originate during development and lead to wasting and death before weaning. The defects range from severe reduction of motor axon extension as observed in the dorsal forelimb to shortening of presynaptic branches of the phrenic nerve, as observed in the diaphragm. Molecular functional analysis showed that in the context of the spinal cord Ark2C enhances transcriptional responses of the Smad1/5/8 effectors, which are activated (phosphorylated) downstream of Bone Morphogenetic Protein (BMP) signals. Consistent with Ark2C-modulated BMP signaling influencing motor axons, motor pools in the spinal cord were found to harbor phosphorylated Smad1/5/8 (pSmad) and treatment of primary MN with BMP inhibitor diminished axon length. In addition, genetic reduction of BMP-Smad signaling in Ark2C+/− mice caused the emergence of Ark2C−/−-like dorsal forelimb innervation deficits confirming that enhancement of BMP-Smad responses by Ark2C mediates efficient innervation. Together the above data reveal an involvement of BMP-Smad signaling in motor axon advancement

A Novel Function of Apolipoprotein E: Upregulation of ATP-Binding Cassette Transporter A1 Expression

Despite the well known importance of apolipoprotein (Apo) E in cholesterol efflux, the effect of ApoE on the expression of ATP-binding cassette transporter A1 (ABCA1) has never been investigated. The objective of this study was to determine the effect of ApoE on ApoB-carrying lipoprotein-induced expression of ABCA1, a protein that mediates cholesterol efflux. Our data demonstrate that ApoB-carrying lipoproteins obtained from both wild-type and ApoE knockout mice induced ApoAI-mediated cholesterol efflux in mouse macrophages, which was associated with an enhanced ABCA1 promoter activity, and an increased ABCA1 mRNA and protein expression. In addition, these lipoproteins increased the level of phosphorylated specificity protein 1 (Sp1) and the amount of Sp1 bound to the ABCA1 promoter. However, all these inductions were significantly diminished in cells treated with ApoE-free lipoproteins, when compared to those treated with wild-type lipoproteins. Enrichment with human ApoE3 reversed the reduced inducibility of ApoE-free lipoproteins. Moreover, we observed that inhibition of Sp1 DNA-binding by mithramycin A diminished ABCA1 expression and ApoAI-mediated cholesterol efflux induced by ApoB-carrying lipoproteins, and that mutation of the Sp1-binding motif in the ABCA1 promoter region diminished ApoB-carrying lipoprotein-induced ABCA1 promoter activity. Collectively, these data suggest that ApoE associated with ApoB-carrying lipoproteins has an upregulatory role on ABCA1 expression, and that induction of Sp1 phosphorylation is a mechanism by which ApoE upregulates ABCA1 expression

TRPA1- FGFR2 binding event is a regulatory oncogenic driver modulated by miRNA-142-3p

YesRecent evidence suggests that the ion channel TRPA1 is implicated in lung adenocarcinoma (LUAD) where its role and mechanism of action remain unknown. We have previously established that the membrane receptor FGFR2 drives LUAD progression through aberrant protein-protein interactions mediated via its C-terminal proline rich motif. Here, we report that the N-terminal ankyrin repeats of TRPA1 directly bind to the C-terminal proline rich motif of FGFR2 inducing the constitutive activation of the receptor, thereby prompting LUAD progression and metastasis. Furthermore, we show that upon metastasis to the brain, TRPA1 gets depleted, an effect triggered by the transfer of TRPA1-targeting exosomal microRNA (miRNA-142-3p) from brain astrocytes to cancer cells. This downregulation, in turn, inhibits TRPA1-mediated activation of FGFR2 hindering the metastatic process. Our study reveals a direct binding event and characterizes the role of TRPA1 ankyrin repeats in regulating FGFR2-driven oncogenic process; a mechanism that is hindered by miRNA-142-3p.Faculty of Biological Sciences at the University of Leeds, Wellcome Trust Seed Award, Royal Society Research Grant RG150100, MR/K021303/1, Swedish Research Council (2014-3801) and the Medical Faculty at Lund University

Μεταγραφική ρύθμιση του γονιδίου ABCA1 στην περιοχή του ιντρονίου 1

Διατμηματικό, συνεργαζόμενα Τμήματα Βιολογίας και Ιατρικής του Πανεπιστημίου Κρήτης. Low levels of high density lipoprotein (HDL) cholesterol constitute a risk factor for coronary heart disease, while there is evidence that raising HDL levels reduces the risk for cardiovascular disease independently of the levels of LDL. So, the effort to increase the levels of plasma HDL has become the focus of the HDL research. The ABCA1 transporter mediates cholesterol and phospholipid efflux to lipid-poor apolipoproteins and thus, it plays an important role in the regulation of plasma HDL. Mutations of the ABCA1 gene were identified in patients with Tangier disease, a condition characterized by very low levels of plasma HDL and an increased risk for premature coronary heart disease. The three different classes of ABCA1 transcripts are under the control of different promoter sequences. Class 3 transcripts originate in the sequence of intron 1 and they are the most abundant in liver. In the experiments described in this report, we used constructs containing deletions of an 8kb sequence upstream of exon 2 of the ABCA1 gene. The results suggest that the SREBP-1 transcription factor is capable of activating the transcription of these constructs in HepG2 cells. Two possible SREBP-1 binding sites in the sequence downstream of -167 are probably the cause of this activation. Moreover, there is evidence that intron 1 sequence is upregulated by the nuclear receptor RXR during stimulation by 9-cis retinoic acid. Even though these preliminary results require further investigation, they do provide significant evidence concerning the regulation of the promoter sequence in intron 1.Τα χαμηλά επίπεδα της HDL χοληστερόλης αποτελούν έναν παράγοντα κινδύνου για τη στεφανιαία νόσο, ενώ υπάρχουν αποδείξεις ότι η αύξηση των επιπέδων της HDL μειώνει τον καρδιαγγειακό κίνδυνο ανεξάρτητα από τα επίπεδα της LDL. Το επίκεντρο της ερευνητικής προσπάθειας επομένως, εστιάζεται στη διόρθωση των χαμηλών επιπέδων της HDL του πλάσματος. Σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση των επιπέδων της HDL διαδραματίζει ο μεταφορέας ABCA1, μεταφέροντας χοληστερόλη και φωσφολιπίδια στη φτωχή σε λιπίδια ApoA-I προκειμένου να συντεθεί η HDL. Μεταλλαγές του γονιδίου ABCA1 συνδέονται με την ασθένεια Tangier, η οποία χαρακτηρίζεται από πολύ χαμηλά επίπεδα HDL και αύξηση του κινδύνου πρόωρης αθηροσκλήρωσης. Διαφορετικές τάξεις μεταγράφων του ABCA1 βρίσκονται κάτω από τον έλεγχο διαφορετικών στοιχείων υποκινητή. Τα μετάγραφα τάξης 3 εντοπίζονται μέσα στο ιντρόνιο 1 και είναι τα πιο άφθονα στο ήπαρ. Στην παρούσα μελέτη εξετάστηκε μια περιοχή 8kb ανοδικά του δεύτερου εξονίου του γονιδίου ABCA1, χρησιμοποιώντας κατασκευές που περιείχαν απαλοιφές αυτής της περιοχής. Συγκεκριμένα, αποδείχθηκε η ενεργοποίηση της μεταγραφής από το μεταγραφικό παράγοντα SREBP-1 στην κυτταρική σειρά HepG2, η οποία είναι πιθανό να οφείλεται σε δύο θέσεις πρόσδεσης στην περιοχή μέχρι το -167. Επιπλέον, βρέθηκε ότι η περιοχή του ιντρονίου αποκρίνεται στην επαγωγή από τον πυρηνικό υποδοχέα RXR και την επίδραση του 9-cis-ρετινοϊκού οξέος. Αν και τα προκαταρκτικά αυτά αποτελέσματα απαιτούν περαιτέρω διερεύνηση, μας παρέχουν κάποιες σημαντικές ενδείξεις για τη ρύθμιση της περιοχής του ιντρονίου

Mechanisms of transcriptional regulation of the human ABCA1 gene in the liver

Low levels of plasma HDL cholesterol are an independent risk factor for cardiovascular disease. The membrane ABCA1 transporter plays a key role in the biogenesis of HDL by promoting the efflux of cellular cholesterol and phospholipids to lipid-poor apolipoprotein A-I. Mutations in the ABCA1 gene lead to Tangier disease which is characterized by near absent plasma HDL levels, accumulation of foam cells in various tissues and a moderate increase in the incidence of atherosclerosis. Hepatic ABCA1 protein is the major source of plasma HDL while macrophage ABCA1 protects against foam cell formation and atherosclerosis. Thus, the induction of ABCA1 gene expression has been associated with the increase in functional plasma HDL levels and the protection from atherosclerosis. The best characterized and most significant mechanism of ABCA1 gene regulation is via the activation of the nuclear receptors LXRα/RXRα in response to cholesterol loading. The purpose of the present thesis was the study of the molecular mechanisms that affect the induction of the ABCA1 gene via the above-mentioned pathway as well as the identification of new regulatory elements and factors. Initially, we investigated the role of the transcription factor Sp1 which binds to the proximal ABCA1 gene promoter and is necessary for its basal activity in hepatic cells. We showed that, physical and functional interactions between Sp1 and the nuclear receptors LXRα/RXRα were required for the optimal induction of ABCA1 gene transcription in response to their ligands, oxysterols and retinoids. Next, we identified, for the first time, binding sites for the hepatic transcription factor FOXA2/HNF-3β in the ABCA1 gene promoter. Binding of FOXA2 to these sites repressed the basal ABCA1 gene transcription. Furthermore, we showed that binding of FOXA2 to the TATA-box of the ABCA1 gene promoter inhibited the induction by oxysterols and retinoids possibly via competition with the transcription initiation machinery which is assembled to this site. Finally, we investigated the functional promoter that is present in the first intron of the ABCA1 gene. We showed the transcription factor SREBP-1, which is activated by LXRα/RXRα heterodimers in response to oxysterols and retinoids, binds to multiple sites in the proximal intron 1 promoter region. One of these sites overlaps with an AP1 binding site which binds to the transcription factor JunB during monocyte differentiation to macrophages. The ABCG1 transporter, similarly to ABCA1, plays a key role in cholesterol efflux to mature HDL particles and in the protection against atherosclerosis. We investigated the role of a natural mutation in the ABCG1 gene promoter which was identified in the general population in the City of Copenhagen and is associated with increased incidence of ischemic heart disease, myocardial infarction and dyspnea. We showed that this mutation abolishes a binding site for the transcription factor Sp1 and inhibits the induction of the ABCG1 gene promoter by this factor. Understanding in depth the molecular mechanisms that regulate ABCA1 gene expression in the liver and the role of specific transcription factors in these processes is anticipated to lead to the development of new substances that will increase ABCA1 gene expression and as a result, plasma HDL levels, providing protection against atherosclerosis and cardiovascular disease.Τα χαμηλά επίπεδα της HDL χοληστερόλης στο πλάσμα αποτελούν έναν ανεξάρτητο παράγοντα κιδύνου για την εμφάνιση καρδιαγγειακής νόσου. Ο μεμβρανικός μεταφορέας ABCA1 διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στη βιογένεση της HDL προάγοντας την εκροή χοληστερόλης και φωσφολιπιδίων από τα κύτταρα προς τη φτωχή σε λιπίδια απολιποπρωτεΐνη Α-Ι. Μεταλλαγές στο γονίδιο ABCA1 προκαλούν τη νόσο Tangier η οποία χαρακτηρίζεται από σχεδόν ανύπαρκτα επίπεδα HDL στο πλάσμα, συσσώρευση αφρωδών κυττάρων σε ποικίλους ιστούς και σχετικά μέτρια αύξηση στο ρυθμό εμφάνισης αθηροσκλήρωσης. Η πρωτεΐνη ABCA1 στο ήπαρ αποτελεί την κύρια πηγή της HDL στο πλάσμα ενώ η δράση της ABCA1 στα μακροφάγα προστατεύει από το σχηματισμό αφρωδών κυττάρων και την αθηροσκλήρωση. Κατά συνέπεια, η αύξηση της έκφρασης του γονιδίου ABCA1 έχει συνδεθεί με την αύξηση των επιπέδων λειτουργικής HDL χοληστερόλης στο πλάσμα και την προστασία από την αθηροσκλήρωση. Ο κύριος μηχανισμός επαγωγής της έκφρασης του γονιδίου ABCA1 είναι μέσω της ενεργοποίησης των πυρηνικών υποδοχέων LXRα/RXRα από οξυστερόλες και ρετινοειδή. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη των μοριακών μηχανισμών που επηρεάζουν την επαγωγή του γονιδίου ABCA1 μέσω του παραπάνω μονοπατιού καθώς και η ταυτοποίηση νέων ρυθμιστικών στοιχείων και παραγόντων. Αρχικά, εξετάσαμε το ρόλο του μεταγραφικού παράγοντα Sp1 ο όποιος βρέθηκε να προσδένεται στον υποκινητή του γονιδίου ABCA1 και να είναι απαραίτητος για τη βασική μεταγραφή του γονιδίου. Παρουσία οξυστερολών και ρετινοειδών η φυσική και λειτουργική αλληλεπίδραση μεταξύ του Sp1 και των υποδοχέων LXRα/RXRα ήταν απαραίτητη προκειμένου να επιτευχθεί η βέλτιστη επαγωγή του γονιδίου ABCA1. Στη συνέχεια, ταυτοποιήσαμε για πρώτη φορά θέσεις πρόσδεσης για το ηπατικό μεταγραφικό παράγοντα FOXA2/HNF-3β στον υποκινητή του γονιδίου ABCA1. Η πρόσδεση του FOXA2 στις θέσεις αυτές είχε κατασταλτικό ρόλο στη βασική μεταγραφή του γονιδίου ABCA1. Επιπλέον αποδείξαμε ότι η πρόσδεση του FOXA2 στο στοιχείο ΤΑΤΑ του υποκινητή του γονιδίου ABCA1 μείωσε την επαγωγή από οξυστερόλες και ρετινοειδή μέσω ανταγωνισμού με τη βασική μεταγραφική μηχανή που συναρμολογείται σε αυτό το στοιχείο. Τέλος, εξετάσαμε την περιοχή του 1ου ιντρονίου του γονιδίου ABCA1 η οποία περιλαμβάνει ένα λειτουργικό υποκινητή. Αποδείξαμε ότι η περιοχή του 1ου ιντρονίου περιέχει θέσεις πρόσδεσης για το μεταγραφικό παράγοντα SREBP-1 ο οποίος ενεργοποιείται από τους LXRα/RXRα ως απόκριση στις οξυστερόλες και τα ρετινοειδή. Επιπλεόν, παρατηρήσαμε ισχυρή ενεργοποίηση της περιοχής του 1ου ιντρονίου του γονιδίου ABCA1 από τον παράγοντα JunB κατά την διαφοροποίηση των μονοκύτταρων σε μακροφάγα. Ο μεταφορέας ABCG1, όμοια με τον ABCA1, παίζει ρόλο στην εκροή της χοληστερόλης προς ώριμα σωματίδια HDL και στην προστασία από την αθηροσκλήρωση. Εξετάσαμε το ρόλο μιας φυσικής μεταλλαγής στον υποκινητή του γονιδίου ABCG1 που εντοπίστηκε στον πληθυσμό της Κοπεγχάγης, η οποία σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο για έμφραγμα του μυοκαρδίου και ισχαιμικά επεισόδια και με δύσπνοια. Αποδείξαμε ότι η μεταλλαγή αυτή καταστρέφει μια θέση πρόσδεσης για τον παράγοντα Sp1 και εμποδίζει την επαγωγή του υποκινητή του γονιδίου ABCG1 από αυτόν τον παράγοντα. Η σε βάθος κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που ρυθμίζουν την έκφραση του γονιδίου της ABCA1 στο ήπαρ και ο ρόλος συγκεκριμένων παραγόντων σε αυτές τις διαδικασίες αναμένεται να οδηγήσει στην δημιουργία νέων ουσιών που θα αυξάνουν την έκφραση του ABCA1 και κατά συνέπεια τα επίπεδα της HDL στο πλάσμα, προσφέροντας έτσι προστασία από την αθηροσκλήρωση και την καρδιαγγειακή νόσο

Defects in High Density Lipoprotein metabolism and hepatic steatosis in mice with liver-specific ablation of Hepatocyte Nuclear Factor 4A

BACKGROUND Aberrant concentration, structure and functionality of High Density Lipoprotein (HDL) are associated with many prevalent diseases, including cardiovascular disease and non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Mice with liver-specific ablation of Hnf4α (H4LivKO) present steatosis and dyslipidemia by mechanisms that are not completely understood. The aim of this study was to explore the role of liver HNF4A in HDL metabolism and the development of steatosis. METHODS AND RESULTS Serum and tissue samples were obtained from 6-weeks old H4LivKO mice and their littermate controls. Liver and serum lipids were measured and HDL structure and functionality were assessed. Global gene expression changes in the liver were analyzed by expression arrays, validations were performed by RT-qPCR and DNA-protein interactions were studied by chromatin immunoprecipitation (ChIP). H4LivKO mice presented liver steatosis, increased liver triglyceride content and decreased concentration of serum total cholesterol, HDL cholesterol, triglycerides, phospholipids and cholesteryl esters. Most classes of phospholipids showed significant changes in species ratio and sphingosine-1-phosphate (S1P) levels were reduced. H4LivKO serum was enriched in the smaller, denser HDL particles, devoid of APOA2 and APOM apolipoproteins, exhibiting decreased activity of paraoxonase-1 but retaining macrophage cholesterol efflux capacity and phospho-AKT activation in endothelial cells. Global gene expression analysis revealed the association of liver HNF4A with known and novel regulators of HDL metabolism as well as NAFLD-susceptibility genes. CONCLUSIONS HNF4A ablation in mouse liver causes hepatic steatosis, perturbations in HDL structure and function and significant global changes in gene expression. This study reveals new targets of HNF4A involved in HDL metabolism and the development of steatosis and enriches our knowledge on HDL functionality in NAFLD

CD40 Induces Antigen Transporter and Immunoproteasome Gene Expression in Carcinomas via the Coordinated Action of NF-κB and of NF-κB-Mediated De Novo Synthesis of IRF-1▿

Cancer cells may evade immune surveillance as a result of defective antigen processing and presentation. In this study, we demonstrate that CD40 ligation overcomes this defect through the coordinated action of the transcription factors NF-κB and interferon regulatory factor 1 (IRF-1). We show that unlike interferon signaling, which triggers the STAT1-mediated transcriptional activation of IRF-1, the ligation of CD40 in carcinomas induces the rapid upregulation of IRF-1 in a STAT1-independent but NF-κB-dependent manner. The transcriptional activation of IRF-1 is controlled largely by the recruitment of p65 (RelA) NF-κB to the IRF-1 promoter following the engagement of a TAK1/IκB kinase β/IκBα signaling pathway downstream of CD40. NF-κB and de novo-synthesized IRF-1 converge to regulate the expression of genes involved in antigen processing and transport, as evident from the sequential recruitment of NF-κB and IRF-1 to the promoters of the genes encoding transporter for antigen processing 1 (TAP1), TAP2, tapasin, and low-molecular-mass polypeptides LMP2 and LMP10. Moreover, the RNA interference-mediated knockdown of IRF-1 reduced, whereas the inhibition of NF-κB abolished, the effects of CD40 on TAP1 and LMP2 upregulation in carcinoma cells. Collectively, these data reveal a novel “feed-forward” mechanism induced by NF-κB which ensures that acutely synthesized IRF-1 operates in concert with NF-κB to amplify the immunoproteasome and antigen-processing functions of CD40