Generazione di fotorecettori a partire da cellule pluripotenti della calotta animale di Xenopus laevis tramite sovraespressione di noggin e Xotx5.

La retina dei Vertebrati è l'organo di senso deputato alla trasduzione del segnale luminoso. Istologicamente, la retina presenta una tipica organizzazione trilaminare: lo strato nucleare esterno, contenente i fotorecettori, lo strato nucleare interno, contenente cellule bipolari, orizzontali, amacrine e cellule della glia di Müller, e lo strato di cellule gangliari, che con i loro assoni costituiscono il nervo ottico. Le malattie degenerative della retina, come la Retinite pigmentosa, portano alla graduale perdita della vista mediante l'attuazione di un programma multifasico di morte cellulare e di perdita dell'organizzazione trilaminare retinica. Tale neurodegenerazione potrebbe essere efficacemente contrastata con una terapia basata sulla “sostituzione cellulare”, cioè sul trapianto in organo di cellule staminali o progenitori capaci di sostituire le cellule in degenerazione dell'ospite. Tale approccio richiede anzitutto una fase di differenziamento in vitro di cellule staminali multipotenti, al fine di ottenere cellule indirizzate verso un destino retinico, capaci di integrarsi nel tessuto ospite e differenziarsi in tutti i sottotipi cellulari affetti dalla degenerazione. Xenopus laevis rappresenta un buon modello per lo studio della funzione genica e dello sviluppo dell'occhio. I suoi embrioni possono essere microiniettati durante le prime fasi di sviluppo con RNA messaggeri trascritti in vitro. Successivamente, allo stadio di blastula, gli emisferi animali (animal cap), ai quali compete un destino epidermico se non diversamente trattati, possono essere asportati e coltivati in soluzione salina. Ciò consente di utilizzare queste cellule come materiale biologico di partenza per saggi di differenziamento, dove la sovraespressione di geni coinvolti nella specificazione di tipi cellulari retinici può istruire le cellule dell’animal cap e indirizzarle verso un particolare destino. Nel laboratorio dove ho svolto il mio internato di tesi da molti anni si studiano i meccanismi molecolari del differenziamento retinico nell'anfibio Xenopus laevis. Diversi fattori di trascrizione di tipo homeobox, come Xotx5, Xotx2 e Xvsx1, sono importanti per il differenziamento di specifici neuroni retinici. La trascrizione e la traduzione dei geni sopraelencati vengono finemente regolate nel tempo e nello spazio all’interno della retina di Xenopus. Esperimenti di trasfezione in vivo hanno dimostrato che Xotx5 promuove il destino di fotorecettori, mentre Xotx2 e Xvsx1 promuovono entrambi il destino bipolare. Più recentemente è stato evidenziato il ruolo di noggin nell'indurre un destino retinico in cellule embrionali multipotenti, quali le cellule staminali embrionali della calotta animale (ACES). L’iniezione di mRNA di noggin determina l’espressione di marcatori terminali di differenziamento retinico in cellule animali (animal cap cells) della blastula di Xenopus, coltivate in vitro. In seguito a trapianto in vivo, cellule della calotta animale esprimenti alte dosi di noggin formano occhi ben sviluppati, sia quando trapiantate nella regione presuntiva dell’occhio sia quando inserite in posizione ectopica posteriore, anche se negli occhi derivanti dai trapianti posteriori non si ha mai la formazione del cristallino. Lo scopo del mio lavoro di tesi è stato duplice: · Innanzitutto mi sono occupato di verificare la funzionalità degli occhi derivati da trapianto di animal cap iniettati con noggin mRNA. Questo è stato realizzato con tecniche di elettrofisiologia, quali patch-clamp e registrazione di risposta alla luce. In particolare, ho effettuato trapianti di animal cap in vivo, rimuovendo metà del campo morfogenetico dell’occhio di embrioni di Xenopus a stadio di neurula (st. 15) e sostituendolo con animal cap iniettati con noggin mRNA. Ho quindi allevato i girini, sia wild type (WT) di controllo che animali sottoposti a trapianto, fino a stadi tardivi e recuperato gli occhi a stadio di sviluppo 46/47 tramite dissezione sotto luce infrarossa o rossa; ho poi ripulito gli occhi da epitelio pigmentato e cristallino, e ho infine ridotto il materiale in frammenti adatti all’applicazione di tecniche di elettrofisiologia, dissociando o meno le cellule con opportuni enzimi a seconda delle esigenze. Questo lavoro è stato svolto in collaborazione con il Prof. Gian Carlo Demontis (Dipartimento di Psichiatria, Neurobiologia, Farmacologia e Biotecnologie, Università di Pisa), che ha effettuato le registrazioni elettrofisiologiche. La tecnica del patch-clamp perforato è servita a verificare la presenza di canali voltaggio-dipendenti caratterizzanti i fotorecettori, mentre la suzione del segmento esterno è stata il punto di partenza per la registrazione di risposte a lampi di luce con lunghezza d’onda di 520 nm (adatta alla stimolazione dei bastoncelli). · Inoltre, nel mio lavoro di tesi ho anche indagato sulla potenzialità di Xotx5 nell’indurre un differenziamento fotorecettoriale. Senza la compresenza di altri fattori implicati nel differenziamento retinico, l’azione della sola proteina Noggin induce un differenziamento retinico generale, dove la calotta animale risulta arricchita di popolazioni cellulari corrispondenti ai vari tipi retinici dell’occhio WT. Mi sono occupato quindi di analizzare se la microiniezione di noggin + Xotx5 fosse in grado di indirizzare le cellule della calotta animale non più verso destini retinici generali bensì verso lo specifico destino di fotorecettore. Tecniche quali ibridazione in situ, immunoistochimica e PCR quantitativa Real Time hanno consentito di analizzare il differenziamento cellulare avvenuto all’interno degli animal cap. Per quanto riguarda la prima parte del mio lavoro, l’analisi dei risultati ha mostrato notevole somiglianza di funzionamento e differenziamento tra fotorecettori WT e fotorecettori derivanti da occhi trapiantati: in entrambi i casi viene espresso in membrana lo stesso set di canali ionici e si riscontrano risposte alla luce equivalenti. Inoltre la circuiteria retinica è perfettamente funzionante nel recepire e trasdurre, attraverso neuroni di secondo ordine, lo stimolo luminoso captato in primis dai fotorecettori. I risultati ottenuti durante la seconda parte del mio internato di tesi, invece, hanno mostrato come la coiniezione di Xotx5 con alte dosi di noggin determini un aumento di espressione del gene opsina, marcatore di fotorecettori terminalmente differenziati, oltre a un aumento percentuale di cellule opsina-positive e alla facilitazione dell’organizzazione di tali cellule in strati ordinati. Ciò candida Xotx5 come possibile fattore di differenziamento da impiegare in associazione a noggin per l’ottenimento di fotorecettori in vitro, da utilizzarsi in protocolli di terapia cellulare sostitutiva

Human leucocyte antigen diversity: a biological gift to escape infections, no longer a barrier for haploidentical hemopoietic stem cell transplantation

Since the beginning of life, every multicellular organism appeared to have a complex innate immune system although the adaptive immune system, centred on lymphocytes bearing antigen receptors generated by somatic recombination, arose in jawed fish approximately 500 million years ago. The major histocompatibility complex MHC, named the Human leucocyte antigen (HLA) system in humans, represents a vital function structure in the organism by presenting pathogen-derived peptides to T cells as the main initial step of the adaptive immune response. The huge level of polymorphism observed in HLA genes definitely reflects selection, favouring heterozygosity at the individual or population level, in a pathogen-rich environment, although many are located in introns or in exons that do not code for the antigen-biding site of the HLA. Over the past three decades, the extent of allelic diversity at HLA loci has been well characterized using high-resolution HLA-DNA typing and the number of new HLA alleles, produced through next-generation sequencing methods, is even more rapidly increasing. The level of the HLA system polymorphism represents an obstacle to the search of potential compatible donors for patients affected by haematological disease proposed for a hematopoietic stem cell transplant (HSCT). Data reported in literature clearly show that antigenic and/or allelic mismatches between related or unrelated donors and patients influences the successful HSCT outcome. However, the recent development of the new transplant strategy based on the choice of haploidentical donors for HSCT is questioning the role of HLA compatibility, since the great HLA disparities present do not worsen the overall clinical outcome. Nowadays, NGS has contributed to define at allelic levels the HLA polymorphism and solve potential ambiguities. However, HLA functions and tissue typing probably need to be further investigated in the next future, to understand the reasons why in haploidentical transplants the presence of a whole mismatch haplotype between donors and recipients, both the survival rate and the incidence of acute GvHD or graft rejection are similar to those reported for unrelated HSCTs

Endorphinergic systems and modulation of signaling and transcriptional networks involved in healing processes of damaged myocardium

Con il termine IPC (precondizionamento ischemico) si indica un fenomeno per il quale, esponendo il cuore a brevi cicli di ischemie subletali prima di un danno ischemico prolungato, si conferisce una profonda resistenza all’infarto, una delle principali cause di invalidità e mortalità a livello mondiale. Studi recenti hanno suggerito che l’IPC sia in grado di migliorare la sopravvivenza, la mobilizzazione e l’integrazione di cellule staminali in aree ischemiche e che possa fornire una nuova strategia per potenziare l’efficacia della terapia cellulare cardiaca, un’area della ricerca in continuo sviluppo. L’IPC è difficilmente trasferibile nella pratica clinica ma, da anni, è ben documentato che gli oppioidi e i loro recettori hanno un ruolo cardioprotettivo e che attivano le vie di segnale coinvolte nell’IPC: sono quindi candidati ideali per una possibile terapia farmacologica alternativa all’IPC. Il trattamento di cardiomiociti con gli agonisti dei recettori oppioidi Dinorfina B, DADLE e Met-Encefalina potrebbe proteggere, quindi, le cellule dall’apoptosi causata da un ambiente ischemico ma potrebbe anche indurle a produrre fattori che richiamino elementi staminali. Per testare quest’ipotesi è stato messo a punto un modello di “microambiente ischemico” in vitro sui cardiomioblasti di ratto H9c2 ed è stato dimostrato che precondizionando le cellule in modo “continuativo” (ventiquattro ore di precondizionamento con oppioidi e successivamente ventiquattro ore di induzione del danno, continuando a somministrare i peptidi oppioidi) con Dinorfina B e DADLE si verifica una protezione diretta dall’apoptosi. Successivamente, saggi di migrazione e adesione hanno mostrato che DADLE agisce sulle H9c2 “ischemiche” spronandole a creare un microambiente capace di attirare cellule staminali mesenchimali umane (FMhMSC) e di potenziare le capacità adesive delle FMhMSC. I dati ottenuti suggeriscono, inoltre, che la capacità del microambiente ischemico trattato con DADLE di attirare le cellule staminali possa essere imputabile alla maggiore espressione di chemochine da parte delle H9c2.Ischemic preconditioning (IPC), the exposure of the heart to short cycles of sublethal ischemia before a prolonged ischemic damage, is a phenomenon able to provide a considerable resistance to myocardial infarct, one of the most prominent cause of disability and death in the world. Recent studies suggest that IPC can improve survival, homing, and engrafment of stem cells in ischemic areas and that it can constitute a new therapeutic strategy to enhance stem cell cardioprotective therapy, a developing research area. IPC is difficult to apply in clinical practice, but is well known that opioids and their receptors are cardioprotective and that they activate signaling pathways involved in IPC; for this reasons opioids are suitable candidate for a possible pharmacological therapy alternative to IPC. Given these assumptions, the purpose of the present study was to investigate whether conditioning cardiomyocytes with opioid receptor agonists Dynorphin B, DADLE e Met-Enkephalin could protect cells from apoptosis caused by an ischemic environment and whether it could induce the damaged cells to produce factors capable to attract stem cells. To tests this hypothesis we developed an in vitro model of “ischemic microenvironment” applied to H9c2 rat cardiomyoblasts. Preconditiong the cells in a “sustained” way (24 hours of opioids preconditioning followed by 24 hours of induction of damage, keeping on administering the opioid peptides) with Dynorphin B and DADLE leads to a direct protection from apoptosis. Thereafter, migration and adhesion assays showed that DADLE drives “ischemic” H9c2 to create a microenvironment capable to attract human Mesenchymal stem cells (FMhMSCs) and to improve FMhMSC grafting abilities. Moreover, the results obtained until now suggest that the ability of the ischaemic microenvironment conditioned with DADLE to attract FMhMSC could be ascribed to chemokines upregulation in H9c2

Veno-occlusive disease nurse management: Development of a dynamic monitoring tool by the GITMO nursing group

Veno-occlusive disease (VOD) is a complication arising from the toxicity of conditioning regimens that have a significant impact on the survival of patients who undergo stem cell transplantation. There are several known risk factors for developing VOD and their assessment before the start of conditioning regimens could improve the quality of care. Equally important are early identification of signs and symptoms ascribable to VOD, rapid diagnosis, and timely adjustment of support therapy and treatment. Nurses have a fundamental role at the stages of assessment and monitoring for signs and symptoms; therefore, they should have documented skills and training. The literature defines nurses' areas of competence in managing VOD, but in the actual clinical practice, this is not so clear. Moreover, there is an intrinsic difficulty in managing VOD due to its rapid and often dramatic evolution, together with a lack of care tools to guide nurses. Through a complex evidence-based process, the Gruppo Italiano per il Trapianto di Midollo Osseo (GITMO), cellule staminali emopoietiche e terapia cellulare nursing board has developed an operational flowchart and a dynamic monitoring tool applicable to haematopoietic stem cell transplantation patients, whether they develop this complication or not

PRODUZIONE DI CELLULE STAMINALI MESENCHIMALI PER APPLICAZIONI DI TERAPIA AVANZATA

SOMMARIO I prodotti di ingegneria tissutale sono medicinali che contengono o consistono in cellule o tessuti sottoposti ad una rilevante manipolazione cos\uec da ottenere caratteristiche biologiche, funzioni fisiologiche e propriet\ue0 strutturali pertinenti alla finalit\ue0 di rigenerazione, riparazione o sostituzione. Nel caso di cellule e tessuti manipolati in vitro, l'obiettivo da raggiungere nel controllo dei processi di produzione e della qualit\ue0 del prodotto finale \ue8 garantire la sicurezza e l'efficacia dei prodotti da immettere nell'uso clinico. Ne consegue la necessit\ue0 di operare nel rispetto di norme proprie dei processi produttivi dei farmaci sia dal punto di vista della qualit\ue0 che della sicurezza del prodotto. Lo scopo del lavoro svolto durante il dottorato \ue8 stato lo studio e messa a punto di sistemi di produzione per la generazione di un prodotto innovativo per terapie avanzate. Si tratta di un prodotto costituito da cellule staminali mesenchimali, ottime candidate per applicazioni cliniche in medicina rigenerativa. Per la produzione di un prodotto di terapia avanzata, l\u2019intero processo, a partire dal campione iniziale fino al prodotto finito, deve essere svolto in un\u2019officina farmaceutica autorizzata che operi nel rispetto delle Good Manufacturing Practices (GMP). Si tratta di linee guida il cui scopo \ue8 assicurare che un farmaco sia prodotto, analizzato e rilasciato in un regime di Qualit\ue0 controllata e certificata in modo da minimizzare il pericolo che vi siano rischi non previsti per il paziente. Nella fase preliminare del processo \ue8 stata valutata la fattibilit\ue0 del metodo e sono stati definiti i protocolli da impiegare. La fase di fattibilit\ue0 ha permesso di mettere a punto la procedura di isolamento, espansione, differenziamento delle cellule staminali. E\u2019 stato possibile valutare la stabilit\ue0 genomica e le caratteristiche immunofenotipiche delle cellule a vari passaggi cellulari. Tutti i dati ottenuti durante lo studio di fattibilit\ue0 sono stati fondamentali per definire i test di controllo di qualit\ue0, le specifiche di prodotto e i criteri di accettabilit\ue0 richiesti per la successiva convalida del processo. I risultati presentati durante lo studio di fattibilit\ue0 evidenziano come sia possibile trasferire protocolli di ricerca in processi potenzialmente applicabili in sperimentazione clinica. Alla fine del processo di convalida che prevede la produzione di tre lotti di cellule, le specifiche previste per i controlli in ingresso, durante il processo di produzione e sul prodotto finito devono risultare conformi a tutte le richieste. I passi futuri sono la validazione del processo asettico, mediante l\u2019esecuzione di tre mediafill e la valutazione del rischio relativa alla produzione di lotti destinati alla clinica, in modo da completare la serie di studi necessari per la presentazione di una domanda di autorizzazione allo studio clinico.ABSTRACT Tissue Engineered products may carry cells or tissues either of human or animal origin. The cells and tissues shall be subjected to substantial manipulation in order to obtain biological characteristics, physiological functions or structural properties relevant for the intended regeneration, repair or replacement. For cells and tissues manipulated in vitro, the objective to be achieved in terms of control of production processes and quality of the final product is to ensure the safety and effectiveness of the products that would be placed in clinical use. Hence the need to act in accordance with the rules which define production processes used for drugs, in order to guarantee the quality and safery of the product.. The purpose of the work done during the PhD was the study and the development of production protocol for the generation of an innovative product for advanced therapies. It is a cellular product made of mesenchymal stem cells, good candidates for clinical applications in regenerative medicine. For this production, all stages, starting from the initial sample and up to the final product, must be carried out in an authorized pharmaceutical facility which operates in compliance with Good Manufacturing Practices (GMP). The purpose of these guidelines is to ensure that drugs are produced, analysed and released in a regime of controlled and certified quality minimizing the danger of unexpected risks for the patient. In the preliminary phase of the process the feasibility of the method was evaluated and the protocols to be used were defined. The feasibility phase allowed the development of procedures for the isolation, expansion and differentiation of stem cells. It was possible to evaluate the genomic stability and immunophenotypic features of the cells at different steps. All data obtained during the feasibility study have been fundamental to define the tests of quality control, product specifications and criteria of acceptability required for the subsequent validation of the process. The results presented in the feasibility study show that it is possible to transfer research protocols to a GMP framework which is potentially applicable in clinical trials. At the end of the validation process, which involves the production of three batches of cells, the specifications required for the incoming controls, during the production\u2019s process and on the final product must comply with all the requirements. The future steps will be the validation of the aseptic process, through the execution of three mediafill and the risk assessment related to the production of batches intended for clinical use, in order to complete the series of documents required for the submission of an application for a clinical study

Uso di cellule staminali embrionali di topo per lo studio del differenziamento della corteccia cerebrale: il ruolo di BMP, Wnt e Shh nell'acquisizione dell'identita neuronale.

Con il mio lavoro di tesi ho messo a punto un protocollo di neuralizzazione in vitro di cellule staminali embrionali (Embryonic Stem Cells, ESCs) di topo che consente di dirigere il loro differenziamento terminale in cellule della corteccia cerebrale. Il protocollo che ho utilizzato consiste di una fase di produzione di strutture sferiche composte da numerose cellule chiamate corpi embrioidi (Embryoid Bodies, EBs), seguite da due fasi successive di coltura in adesione su un substrato di poliornitina e laminina. Grazie all’utilizzo di un mezzo di coltura minimo chimicamente controllato (Chemically Defined Minimal Medium, CDMM) è stato possibile ottenere e caratterizzare una coltura di cellule neuronali di identità omogenea. Questo protocollo di neuralizzazione permette inoltre l’applicazione di sostanze esogene alla coltura, che possono indurre le cellule a modificare il loro destino di differenziamento. Durante la neuralizzazione, le ESCs producono fattori di crescita autocrini e paracrini che ne possono influenzare il destino di differenziamento, come BMP (Bertacchi, et al., 2013). In particolare, nel mio lavoro ho studiato gli effetti dell’inibizione della segnalazione di Wnt, di cui vari tipi vengono prodotti dalle ESCs prima, durante e dopo la loro neuralizzazione in vitro, e la sua interazione con la segnalazione di BMP. Il mio obiettivo è stato quello di studiare la capacità delle ESCs di differenziare in cellule neuronali della corteccia cerebrale, in presenza di inibitori chimici delle vie di segnalazione molecolare di WNT, di BMP, o di entrambe. I risultati degli esperimenti che ho condotto sono stati valutati analizzando l’espressione di combinazioni di geni marcatori del patterning antero-posteriore e dorso-ventrale di telencefalo, diencefalo e mesencefalo con tecniche di RT-PCR ed immunocitochimica. I risultati finora ottenuti hanno evidenziato che WNT prodotto endogenamente dalle ESCs inibisce un programma di differenziamento corticale. Questo risultato è simile a quanto ottenuto inibendo BMP endogeno, in accordo a dati già pubblicati (Bertacchi, et al., 2013), e la loro combinazione sembra essere additiva. Esperimenti di caratterizzazione dell'espressione di geni chiave dell'istogenesi corticale, come Satb2, sono tuttora in corso. Ho inoltre condotto esperimenti per studiare quale fosse il ruolo del ciclo cellulare durante il differenziamento dei neuroni corticali. È riportato in letteratura, infatti, che durante la corticogenesi si osserva un progressivo aumento del ciclo cellulare e che esso correla con un cambiamento del destino di differenziamento dei precursori, ma quale sia la relazione tra i due eventi non è tutt’ora chiara. Per studiare questo aspetto del differenziamento dei neuroni della corteccia, ho trattato le colture con molecole in grado di allungare o accorciare il ciclo cellulare, così da poter saggiare se questo parametro influisce sulla tipologia di neuroni corticali prodotti nelle piastre di coltura. Le molecole utilizzate durante questo studio sono state la Ciclopamina e lo Smoothened Agonist (SAG), in grado rispettivamente di inibire o attivare la via di segnalazione di Sonic Hedgehog (Shh), un potente mitogeno, e successivamente la Mimosina, un composto capace di inibire i complessi molecolari necessari per la transizione G1-S, allungando il ciclo cellulare. Dagli esperimenti condotti risulta che Ctip2, marcatore di strati profondi della corteccia, e Satb2, marcatore di strati superficiali, sono sotto un controllo dipendente dal ciclo cellulare. Le colture in cui viene rallentato il ciclo cellulare producono una maggior proporzione di neuroni corticali Satb2 positivi, mentre nelle colture in cui il ciclo è accelerato sono presenti un maggior numero di neuroni positivi per Ctip2. Tuttavia resta ancora da chiarire quali siano i meccanismi molecolari responsabili di questo controllo

Sistema normativo 'aperto', rigore del metodo scientifico e diritto alla salute: il difficile ruolo di mediazione delle Istituzioni pubbliche. (A proposito del 'caso Stamina')

ll 'caso Stamina' ha sollevato questioni molto delicate concernenti l'estensione del diritto alla salute, i limiti della libertà terapeutica, il rapporto fra scelte politiche e scelte tecniche, fra scelte pubbliche e scelte individuali. Prendendo spunto dalla vicenda, il contributo intende riflettere sul ruolo che svolgono le istituzioni pubbliche nel 'controllo' sulla ricerca scientifica nel confine che separa la terapia innovativa dalla sperimentazione clinica. Più in particolare, il contributo riflette sul modo in cui il potere di regolare questi profili sia ripartito tra autorità politiche e autorità giudiziaria e soprattutto sulla funzione essenziale che deve svolgere l'amministrazione sanitaria. The “Stamina case” raised very sensitive issues concerning the right to health, the limits of therapeutic freedom and the scope of public health policies. Inspired by such case, the contribution aims to reflect on the role played by public institutions in regulating research in that specific area represented by the innovative therapy. In such context, the main topics are the relationship between law and science and the possible conflict between public and individual choices. In particular, the essay examines the way the power to regulate these profiles is shared among public authorities and courts and emphasizes the essential role to be played by the public health administration.The “Stamina case” raised very sensitive issues concerning the right to health, the limits of therapeutic freedom and the scope of public health policies. Inspired by such case, the contribution aims to reflect on the role played by public institutions in regulating research in that specific area represented by the innovative therapy. In such context, the main topics are the relationship between law and science and the possible conflict between public and individual choices. In particular, the essay examines the way the power to regulate these profiles is shared among public authorities and courts and emphasizes the essential role to be played by the public health administration

Ruolo dei progenitori renali nella rigenerazione tubulo-glomerulare

Abstract non disponibil

Treatment of Graft versus Host Disease with Mesenchymal Stromal Cells: A Phase I Study on 40 Adult and Pediatric Patients

Abstract This phase I multicenter study was aimed at assessing the feasibility and safety of intravenous administration of third party bone marrow–derived mesenchymal stromal cells (MSC) expanded in platelet lysate in 40 patients (15 children and 25 adults), experiencing steroid-resistant grade II to IV graft-versus-host disease (GVHD). Patients received a median of 3 MSC infusions after having failed conventional immunosuppressive therapy. A median cell dose of 1.5 × 10 6 /kg per infusion was administered. No acute toxicity was reported. Overall, 86 adverse events and serious adverse events were reported in the study, most of which (72.1%) were of infectious nature. Overall response rate, measured at 28 days after the last MSC injection, was 67.5%, with 27.5% complete response. The latter was significantly more frequent in patients exhibiting grade II GVHD as compared with higher grades (61.5% versus 11.1%, P = .002) and was borderline significant in children as compared with adults (46.7 versus 16.0%, P = .065). Overall survival at 1 and 2 years from the first MSC administration was 50.0% and 38.6%, with a median survival time of 1.1 years. In conclusion, MSC can be safely administered on top of conventional immunosuppression for steroid resistant GVHD treatment. Eudract Number 2008-007869-23, NCT01764100