Toxicidade de nanomateriais em peixes utilizando métodos in vivo e in vitro

Orientadora: Profª Drª Marta Margarete CestariCoorientadora: Profª Drª Daniela Morais LemeTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 2017Inclui referências: f.67-76Resumo: A nanotecnologia tem importante interesse social, devido sua ampla aplicação em diferentes produtos industriais. A atual preocupação com nanomateriais (NMs) é o perigo para a saúde humana e para o ambiente. Considerando que os NMs podem chegar a corpos d'água, há necessidade de estudar os efeitos tóxicos dos NMs em organismos aquáticos. Neste contexto, métodos in vivo utilizando peixes podem fornecer informações sistêmicas sobre efeitos de NMs no organismo e por meio de métodos in vitro, utilizando linhagens de células de peixes, é possível corroborar os efeitos observados nos métodos in vivo, sendo relevante em estudos ecotoxicológicos, uma vez que é possível ter tanto uma abordagem dos efeitos em um animal inteiro quanto aos modos de ação de NMs em moléculas específicas, como o DNA. Assim sendo, os objetivos do presente trabalho foram: 1) avaliar os efeitos de nanoesferas de prata (AgNS) na espécie de peixe Hoplias intermedius, contaminada a curto e a longo prazo por exposição via trófica e comparar estes com os efeitos causados por íons de prata (Ag+) - material não particulado e de mesma composição química -, por meio de biomarcadores morfológicos (retina), genéticos (sangue, cérebro, fígado e rim) e bioquímicos (fígado); 2) avaliar o modo de ação da nano-titânio (TiO2NP), da nano-prata sem estabilizante (AgNP) e da nanoesfera de prata com estabilizante polivinilpirrolidona (AgNS) no DNA, por meio de método in vitro com a linhagem de células de peixe RTG-2. Na retina, na esclera e no nervo óptico de H. intermedius foram observadas deposições de AgNS após 40 dias de exposição, além de danos como: alterações morfológicas em bastonetes, melanossomos aderidos a cones, hemorragia e ruptura do epitélio pigmentado. A citotoxicidade foi observada pela alteração da atividade das enzimas antioxidantes (superóxido-dismutase, catalase e glutationa S-transferase) no fígado após exposição aguda, assim como alteração na concentração de hidroperóxidos lipídicos e de metalotioneínas, indicando estresse oxidativo. As AgNS foram genotóxicas em todos os tecidos de H. intermedius, tanto na exposição aguda quanto na subcrônica, em que foi observada diminuição do escore do ensaio Cometa alcalino padrão dos tratamentos em relação ao controle negativo, sugerindo o dano no DNA do tipo crosslink DNA-DNA ou DNA-proteína. O fígado foi o principal tecido alvo na exposição aguda, apresentando maiores efeitos genotóxicos nos tratamentos com AgNS e Ag+, em comparação com os outros tecidos; e na exposição subcrônica, os efeitos genotóxicos por AgNS foram maiores no rim e no cérebro, enquanto que o Ag+ causou danos principalmente no fígado e no rim. Com o método in vitro e modificações em etapas do ensaio Cometa alcalino foi possível dois modos de ação de TiO2NP, AgNP a AgNS no DNA: o dano oxidativo e o crosslink DNA-DNA ou DNA-proteína. Assim, confirmando o dano crosslink DNA-DNA ou DNA-proteína encontrado no DNA dos tecidos da H. intermedius. Portanto, o presente trabalho confirmou o potencial tóxico dos NMs estudados, além de demonstrar que o uso de peixes em métodos in vivo e in vitro, conjuntamente, pode avaliar de forma mais precisa os efeitos causados por NMs, predizendo o perigo para o ambiente aquático. Palavras-chave: contaminantes emergentes; nanoecotoxicologia; titânio; prata; retina; estresse oxidativo; genotoxicidade.Abstract: Nanotechnologies are at the center of societal interest, due to their broad spectrum of application in different industrial products. The current concern about nanomaterials (NMs) is the hazard to the human health and the environment. Considering that NMs can reach bodies of water, there is a need for studying the toxic effects of NMs on aquatic organisms. Within this context, the use of in vivo method with fish as model can provide systemic information of the NMs effects, and the in vitro method based on fish cell lines can be able to corroborate the effects in the in vivo methods found. In addition, the in vivo and in vitro methods together are important to the ecotoxicology, due to the possibility of a higher spectrum of results with the use of both whole animal and individual cells in the assessment toxic of NMs. For this reason, the goals were: 1) evaluate the effects of silver nanospheres (AgNS) in Hoplias intermedius fish after acute and subchronic trophic exposition and compare with the silver ion (Ag+) - not particle material with same chemical composition -, through of morphology (retina), genetic (blood, brain, liver and kidney) and biochemical (liver) biomarkers; 2) confirm the mode of action of nanoparticle of titanium dioxide (NPTiO2), silver nanoparticle no functionalized (AgNP) and silver nanosphere polyvinylpirrolidone functionalized (AgNS) in the DNA through in vitro method with RTG-2 fish cells line. AgNS deposits in retina, sclera and optic nerve region were found after exposition for 40 days. In addition, damage were observed, such as: morphologic changes in rods, melanosomes aderhered on cones, hemorrhage and deterioration of the pigment epithelium. Cytotoxic effects, such as oxidative stress, were observed through activity alteration in antioxidant enzymes (superoxide dismutase, catalase and glutathione S-tranferase) in the liver after acute exposition, besides the lipid hydroperoxide and metalothioneins concentration were changed. AgNS were genotoxic in all H. intermedius' tissues, both acute and subchronic exposition. The alkaline Comet assay scores of the treatments were smaller than negative control, suggesting crosslink DNA-DNA or DNA-protein damage type. In addition, the liver was the main target tissue in the acute exposition with higher genotoxic effects in both AgNS and Ag+ treatments, in relation to the other tissues. In the subchronic exposition, AgNS caused higher genotoxic effects in kidney and brain, whereas the Ag+ caused effect specific tissue in liver and kidney. In order to investigate de mode of action of NMs, in vitro method with modifications in the alkaline Comet assay was performed, and two modes of actions were found, such as: oxidative DNA damage and crosslink DNA-DNA or DNA-protein. Thus, the crosslink DNA damage type found in H. intermedius could be confirmed. In conclusion, the present work confirmed the toxicity of NMs studied with in vivo and in vitro methods together that herein demonstrated an accurately evaluation of the NMs effects, with the possibility to predict the hazard of them to the aquatic environment. Keywords: emerging contaminants; nanoecotoxicology; titanium; silver; retina; oxidative stress; DNA damage

Danos no DNA em tecido renal de Rhamdia quelen (Siluriforme) submetida a contaminação subcrônica via trófica por sulfato

Orientador: Marta Margarete CestariMonografia (Bacharelado) - Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Curso de Graduação em Ciências Biológica

Efeitos tóxicos de nanopartículas de dióxido de titânio (TiO2) e chumbo inorgânico (Pbll) em Rhamdia quelen (Siluformes, Heptapteridae)

Resumo: Nanopartículas são potencialmente atrativas em tecnologias industriais e medicinais, pois apresentam singularidades físico-químicas. Além disso, há necessidade de estudos de associação entre nanopartículas e compostos já existentes com mecanismos de toxicidade conhecidos. Avaliou-se o potencial tóxico de nanopartículas de dióxido de titânio e chumbo inorgânico em tecido hepático e eritrócitos da espécie de peixe Rhamdia quelen, após uma única injeção intraperitoneal, em ensaio agudo de 96 horas. As nanopartículas de dióxido de titânio (NPTiO2) foram aplicadas nas doses de 5ng/g, 50ng/g e 500ng/g, o chumbo inorgânico (PbII) na dose 21?g/g e foram aplicadas essas doses em associação. Demonstramos que NPTiO2 em baixas doses apresentam a capacidade de alterar a atividade enzimática, causar danos ao DNA, promover o mecanismo de apoptose e alterar a acumulação de chumbo em tecido hepático de Rhamdia quelen, além de causar alterações morfológicas nucleares, danos ao DNA e apoptose em eritrócitos. A dose de 5ng/g de NPTiO2 causou efeitos citotóxicos e genotóxicos no sangue. A dose de 50ng/g de NPTiO2 aumento na concentração de metalotioneína, indicando absorção no fígado, além de aumento na atividade de SOD e inibição de CAT, demonstrando possível estresse oxidativo excessivo, causando danos ao DNA e induzindo ao mecanismo de apoptose. No tratamento que recebeu injeção intraperitoneal somente com PbII, foi detectado danos ao DNA em eritrócitos e no tecido hepático, além de elevada absorção no fígado, porém não induziu o mecanismo de apoptose. Foi observado que a mistura PbII+5ng/g de NPTiO2 induziu à apoptose de eritrócitos, e menor absorção de chumbo no fígado quando comparada com o grupo tratado somente com PbII. A mistura PbII+50ng/g de NPTiO2, apresentou maiores danos ao DNA de eritrócitos quando comparada à NPTiO2 sozinha na mesma dose, além de grande absorção de chumbo no fígado. Apresentou maior concentração de metalotioneína, indução da atividade da SOD, mas sem alteração na atividade da CAT e da GST, demonstrando um possível estresse oxidativo, induzindo o mecanismo de apoptose. A mistura de PbII+500ng/g de NPTiO2 não causou efeitos citotóxicos e genotóxicos no sangue, houve menor absorção de chumbo no fígado, porém aumentou a concentração de metalotioneína, demonstrando uma possível interação PbII e NPTiO2, que consequentemente pode ter facilitado a eliminação dos contaminantes. A sensibilidade da espécie Rhamdia quelen frente às baixas doses de contaminantes, demonstrou que é um bom bioindicador. Este trabalho é o primeiro relato da utilização de contaminação via injeção intraperitoneal em Rhamdia quelen

Co-exposure effects of Titanium Dioxide Nanoparticles and Metals on antioxidant systems and DNA in the fish Hoplias intermedius

Metallic nanoparticles are one of the most produced and used engineered nanomaterial and their wide applications lead to environmental contamination. The aquatic environment is the major recipient of wastes containing nanoparticles and other co-occuring contaminants. We aimed to evaluate genotoxic and biochemical effects of acute exposure to nano-TiO2 in the fish Hoplias intermedius and the interaction to metals. Besides assessing the nanoparticles’ physical-chemical properties we performed an acute exposure with 0.1; 1; 10 μg g-1 nano-TiO2, alone and with lead (21 μgg-1) and aluminium (50 μgg-1). A set of biomarkers were evaluated in the liver such as genotoxicity by comet assay and biochemical biomarkers (SOD, CAT, GPx, GSH, EROD, GST). Most of the biomarkers were altered by the metals, and the nanoparticles caused decrease in SOD (0.1 and 1μg g-1), GSH (1μg g-1), and GST (0.1 μg g-1). In co-exposure, some metal effects were attenuated. There was an increase in EROD activity for most co-exposure groups. Nano-TiO2 was not genotoxic in the experimental conditions. We did not observe any increase in DNA breaks in co-exposure, although, nanoparticles changed the response of some biochemical biomarkers

Liver damage in two neotropical fish species from a polluted estuarine area

A multi-biomarker approach was used to evaluate the liver health of two Neotropical fish species (Cathorops spixii and Atherinella brasiliensis) that inhabit two different sites of the Paranaguá bay (Paraná – Brazil) and a reference site in the Garatuba bay. Fish were sampled during summer and winter, so the variation of the responses can reflect the actual conditions of sampling sites. Data showed that fish from both sites of the Paranaguá bay are affected by the presence of pollutants from different sources. Both fish species presented adverse biomarker responses mainly in the summer, probably due to the increased human population during the period. Chronic effects in the liver related with the contamination. Thus, the results demonstrated that pollution in Paranaguá bay induce liver damage in fish that inhabit this area

DNA damage in the kidney tissue cells of the fish Rhamdia quelen after trophic contamination with aluminum sulfate

Abstract Even though aluminum is the third most common element present in the earth's crust, information regarding its toxicity remains scarce. It is known that in certain cases, aluminum is neurotoxic, but its effect in other tissues is unknown. The aim of this work was to analyze the genotoxic potential of aluminum sulfate in kidney tissue of the fish Rhamdia quelen after trophic contamination for 60 days. Sixty four fish were subdivided into the following groups: negative control, 5 mg, 50 mg and 500 mg of aluminum sulfate per kg of fish. Samples of the posterior kidney were taken and prepared to obtain mitotic metaphase, as well as the comet assay. The three types of chromosomal abnormalities (CA) found were categorized as chromatid breaks, decondensation of telomeric region, and early separation of sister chromatids. The tests for CA showed that the 5 mg/kg and 50 mg/kg doses of aluminum sulfate had genotoxic potential. Under these treatments, early separation of the sister chromatids was observed more frequently and decondensation of the telomeric region tended to increase in frequency. We suggest that structural changes in the proteins involved in DNA compaction may have led to the decondensation of the telomeric region, making the DNA susceptible to breaks. Moreover, early separation of the sister chromatids may have occurred due to changes in the mobility of chromosomes or proteins that keep the sister chromatids together. The comet assay confirmed the genotoxicity of aluminum sulfate in the kidney tissue of Rhamdia quelen at the three doses of exposure

Co-exposure to titanium dioxide nanoparticles (NpTiO2) and lead at environmentally relevant concentrations in the Neotropical fish species Hoplias intermedius

Growing production and utilization of titanium dioxide nanoparticles (NpTiO2) invariably lead to their accumulation in oceans, rivers and other water bodies, thus increasing the risk to the welfare of this ecosystem. The progressive launch of these nanoparticles in the environment has been accompanied by concern in understanding the dynamics and the toxic effect of these xenobiotic in different ecosystems, either on their own or in tandem with different contaminants (such as organic compounds and heavy metals), possibly altering their toxicity. Nevertheless, it remains unknown if these combined effects may induce damage in freshwater organisms. Therefore, this study aimed to analyze the consequences caused by NpTiO2, after a waterborne exposure of 96 h to a Neotropical fish species Hoplias intermedius, as well as after a co-exposure with lead, whose effects for fish have already been well described in the literature. The characterization of NpTiO2 stock suspension was carried out in order to provide additional information and revealed a stable colloidal suspension. As a result, NpTiO2 showed some genotoxic effects which were observed by comet assay in gill, kidney and brain cells. Also, the activity of brain acetylcholinesterase (AChE) has not changed, but the activity of muscle AChE decreased in the group exposed only to PbII. Regarding the hepatic antioxidant system, catalase (CAT) did not show any change in its activity, whereas that of superoxide dismutase (SOD) intensified in the groups submitted only to PbII and NpTiO2 alone. As for lipid peroxidation, there was a decrease in the group exposed to the NpTiO2 alone and to the co-exposed group (NpTiO2+PbII). As far as metallothionein is concerned, its concentration rose for the co-exposed group (NpTiO2+PbII) and for the group exposed to PbII alone. Overall, we may conclude that NpTiO2 alone caused DNA damage to vital tissues. Also, some impairment related to the antioxidant mechanism was described but it is probably not related to the DNA damage observed, suggesting that the genotoxic effect observed may be due to a different mechanism instead of ROS production. Keywords: Nanomaterials, Aquatic toxicology, Fish native species, Organ-specific genotoxicity, Biochemical imbalanc