Recent insights into the structure and function of Mitofusins in mitochondrial fusion [version 1; referees: 2 approved]

Mitochondria undergo frequent fusion and fission events to adapt their morphology to cellular needs. Homotypic docking and fusion of outer mitochondrial membranes are controlled by Mitofusins, a set of large membrane-anchored GTPase proteins belonging to the dynamin superfamily. Mitofusins include, in addition to their GTPase and transmembrane domains, two heptad repeat domains, HR1 and HR2. All four regions are crucial for Mitofusin function, but their precise contribution to mitochondrial docking and fusion events has remained elusive until very recently. In this commentary, we first give an overview of the established strategies employed by various protein machineries distinct from Mitofusins to mediate membrane fusion. We then present recent structure–function data on Mitofusins that provide important novel insights into their mode of action in mitochondrial fusion

FRAP to Characterize Molecular Diffusion and Interaction in Various Membrane Environments

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) is a standard method used to study the dynamics of lipids and proteins in artificial and cellular membrane systems. The advent of confocal microscopy two decades ago has made quantitative FRAP easily available to most laboratories. Usually, a single bleaching pattern/area is used and the corresponding recovery time is assumed to directly provide a diffusion coefficient, although this is only true in the case of unrestricted Brownian motion. Here, we propose some general guidelines to perform FRAP experiments under a confocal microscope with different bleaching patterns and area, allowing the experimentalist to establish whether the molecules undergo Brownian motion (free diffusion) or whether they have restricted or directed movements. Using in silico simulations of FRAP measurements, we further indicate the data acquisition criteria that have to be verified in order to obtain accurate values for the diffusion coefficient and to be able to distinguish between different diffusive species. Using this approach, we compare the behavior of lipids in three different membrane platforms (supported lipid bilayers, giant liposomes and sponge phases), and we demonstrate that FRAP measurements are consistent with results obtained using other techniques such as Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) or Single Particle Tracking (SPT). Finally, we apply this method to show that the presence of the synaptic protein Munc18-1 inhibits the interaction between the synaptic vesicle SNARE protein, VAMP2, and its partner from the plasma membrane, Syn1A

Énergie libérée par la machinerie de fusion SNARE pin

International audience> La fusion membranaire est un méca-nisme ubiquitaire, qui est à la base de nombreux phénomènes physiologiques fondamentaux tels que la fécondation d'un ovule par un spermatozoïde, le développement musculaire, l'infection virale, ou encore l'ensemble du trafic vésiculaire au sein des cellules eucaryo-tes [1, 2]. Tous ces processus impliquent que deux compartiments cellulaires, ini-tialement séparés et chacun délimité par une membrane biologique, entrent en contact puis mettent en commun leurs composants lipidiques et cytosoliques. Les membranes biologiques étant des structures naturellement très stables, les événements de fusion ne peuvent se produire spontanément et nécessitent l'intervention de protéines spécialisées, qui vont aider à surmonter les barrières énergétiques de chaque étape, condui-sant à la fusion membranaire [3]. Ces étapes comprennent : (1) le rapproche-ment des membranes ; (2) la rupture de leur structure en bicouche (avec passage éventuel par un intermédiaire d'hémifusion où les feuillets externes des bicouches ont fusionné tandis que les feuillets internes demeurent sépa-rés), et (3) la création d'un pore de fusion permettant le passage des com-posés solubles. Les SNARE orchestrent la fusion membranaire lors du trafic vésiculaire Dans le cas du trafic vésiculaire intra-cellulaire, la fusion membranaire est orchestrée par les protéines SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor), dont les plus étudiées et les mieux caractérisées sont les SNARE neuronales plexe t-SNARE, situé dans la membrane cible, permet de rapprocher, déformer et ainsi mélanger les deux membranes. Ces complexes v-SNARE/t-SNARE, qui créent un pont transitoire entre les deux membranes destinées à fusionner et au sein desquels chaque SNARE est ancrée dans une bicouche distincte, sont appelés SNAREpins (ou complexes trans-SNARE). Lorsque la fusion est achevée, les complexes SNARE se retrouvent ancrés dans une seule et même bicouche, résultat de la fusion des deux, et forment une tresse d'hélices α complètement structurée (complexes cis-SNARE). impliquées dans la fusion des vésicules de neurotransmetteurs avec la membrane plasmique présynaptique [4]. Un modèle mécanistique pour la fusion des vésicules synaptiques a émergé, et est désormais utilisé afin d'expliquer la fusion induite par les SNARE dans d'autres routes du transport intracellu-laire [5]. Les vésicules sont tout d'abord arrimées à la membrane cible (target) par les protéines Rab et les facteurs d'attachement. Ensuite, un assemblage de type « fermeture éclair » entre la protéine v-SNARE, qui réside dans la membrane de la vésicule, et le com-NOUVELLE Figure 1. Schéma de principe de l'appareil de forces entre surfaces (SFA). Le SFA mesure la force entre deux surfaces de mica recouvertes des bicouches à étudier en fonction de la distance qui les sépare. La distance est obtenue par un système d'interférométrie de type Fabry-Pérot, avec une résolution de 0,1 nm. La force est déduite de la déformation d'un ressort à flexion connecté à l'une des deux surfaces, avec une précision de 1 μN. Distance Force Lumière blanche Déflexion du ressort Franges d'interférence Bicouches déposées sur du mica argenté Article disponible sur le sit

Liaisons par Chélation et Liaisons Hydrogène: une Mesure Directe

Membres du jury: Mme Françoise Brochard (Présidente) Mme Élisabeth Charlaix (Rapporteur) M. François Gallet (Examinateur) M. Patrick Guenoun (Rapporteur) M. Charles Mioskowski (Examinateur) M. Éric Perez (Directeur de thèse)Living systems use weak bonds (hydrogen bonds, chelation bonds, etc.) to ensure the cohesion of some macromolecular structures (tertiary structure of proteins, double helix of the DNA molecule, etc.) and to allow the formation of some transient structures that need to be formed and broken rapidly (receptor-ligand complexes, ion-amino acid complexes, etc.). The energies of those bonds are not well known because a large number of interactions combine their effects during such processes. One way of probing those energies is the measurement of adhesion energies between surfaces bearing functional groups that are able to form the bonds of interest. A lipid whose headgroup is made of a NTA compound has been used. The three carboxyl groups of the NTA molecule can make hydrogen bonds. Under certain physico-chemical conditions, the NTA group can catch a nickel ion thus forming a chelation bond. Several force measurements have been made using the SFA technique between two lipid bilayers containing either NTA or NTA-Ni lipids. Some of these measurements have been complemented by adhesion energy measurements between functionalized vesicles. Some experiments in water lead to the estimation of the energy of a single hydrogen bond: 1 kBT. Force measurements and vesicle experiments in a Tris buffer lead to a reliable value for the binding energy between two NTA groups sharing a nickel ion: 2 kBT. The NTA-Ni lipid was also used as a tool for anchoring histidine-tagged retinoid receptors to SFA surfaces in order to probe the interaction energy between a retinoid and its receptor. A lipid whose headgroup contains a synthetic retinoid has been used. Force measurements have been made between a monolayer of this retinoid lipid and a monolayer of NTA-Ni lipids carrying the receptors. Force measurements have also been made between two monolayers of retinoid lipids; those measurements revealed very strong adhesion energies due to the combined effect of hydrophobic forces and hydrogen bonds.La nature utilise des liaisons faibles (liaisons hydrogène, liaisons par chélation, etc.) pour assurer la cohésion d'édifices macromoléculaires (structure tertiaire des protéines, double hélice de la molécule d'ADN, etc.) et permettre la formation de structures transitoires qui nécessitent d'être créées et détruites rapidement (complexes récepteur-ligand, complexes ion-acide aminé, etc.). Les énergies de ces liaisons sont relativement peu connues notamment en raison du nombre important d'interactions agissant en parallèle. Une méthode permettant de les évaluer consiste à réaliser une mesure d'adhésion entre deux surfaces portant les groupes fonctionnels appropriés isolés de leur environnement naturel. Nous avons utilisé un lipide dont la tête polaire est constituée du groupement NTA, qui est capable de former des liaisons hydrogène et qui, dans certaines conditions physico-chimiques, peut fixer un ion nickel et former ainsi une liaison par chélation. Diverses mesures de forces ont été réalisées à l'aide de la technique SFA entre des bicouches de lipide NTA ou NTA-Ni. Des expériences réalisées dans l'eau pure ont permis de mesurer l'énergie d'une liaison hydrogène: environ 1 kBT. Des mesures de forces réalisées dans le Tris et confirmées par des mesures d'adhésion entre vésicules fonctionnalisées ont conduit à une estimation de l'énergie d'une liaison par chélation: environ 2 kBT. Le lipide NTA-Ni a également été utilisé comme un outil permettant de fixer des récepteurs his-tagués des rétinoïdes sur les surfaces d'étude du SFA. Nous avons utilisé un lipide dont la tête polaire contenait un rétinoïde synthétique et réalisé une mesure de forces entre une monocouche de ce lipide rétinoïde et une monocouche de lipide NTA-Ni portant les récepteurs. Des mesures de forces ont également été effectuées entre deux monocouches de lipide rétinoïde; elles ont mis en évidence de très grandes énergies d'adhésion dues à l'effet combiné des forces hydrophobes et des liaisons hydrogène

Liaisons par chélation et liaisons hydrogène (une mesure directe)

PARIS-BIUSJ-Thèses (751052125) / SudocPARIS-BIUSJ-Physique recherche (751052113) / SudocSudocFranceF

Une récompense pour la découverte des acteurs et des mécanismes moléculaires fondamentaux du trafic vésiculaire intracellulaire

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Lipidic Antagonists to SNARE-mediated Fusion

International audienceSNARE proteins mediate the fusion of lipid bilayers by the directed assembly of coiled-coil domains arising from apposing membranes. We have utilized inverted cone-shaped lipids, antagonists of the necessary membrane deformation during fusion to characterize the extent and range of SNARE assembly up to the moment of stalk formation between bilayers. The inverted cone-shaped lipid family of acyl-CoAs specifically inhibits the completion of fusion in an acyl-chain length-dependent manner. Removal of acyl-CoA from the membrane relieves the inhibition and initiates a burst of membrane fusion with rates exceeding any point in the control curves lacking acyl-CoA. This burst indicates the accumulation of semi-assembled fusion complexes. These preformed complexes are resistant to cleavage by botulinum toxin B and thus appear to have progressed beyond the "loosely zippered" state of docked synaptic vesicles. Surprisingly, application of the soluble domain of VAMP2, which blocks SNARE assembly by competing for binding on the available t-SNAREs, blocks recovery from the acyl-CoA inhibition. Thus, complexes formed in the presence of a lipidic antagonist to fusion are incompletely assembled, suggesting that the formation of tightly assembled SNARE pairs requires progression all the way through to membrane fusion. In this regard, physiologically docked exocytic vesicles may be anchored by a highly dynamic and potentially even reversible SNAREpin

Hydrophobic Forces and Hydrogen Bonds in the Adhesion between Retinoid-Coated Surfaces

International audienc

Modification of Extracellular Vesicles by Fusion with Liposomes for the Design of Personalized Biogenic Drug Delivery Systems

International audienceExtracellular vesicles (EVs) are recognized as nature's own carriers to transport macromolecules throughout the body. Hijacking this endogenous communication system represents an attractive strategy for advanced drug delivery. However, efficient and reproducible loading of EVs with therapeutic or imaging agents still represents a bottleneck for their use as a drug delivery system. Here, we developed a method for modifying cell-derived EVs through their fusion with liposomes containing both membrane and soluble cargoes. The fusion of EVs with functionalized liposomes was triggered by polyethylene glycol (PEG) to create smart biosynthetic hybrid vectors. This versatile method proved to be efficient to enrich EVs with exogenous lipophilic or hydrophilic compounds , while preserving their intrinsic content and biological properties. Hybrid EVs improved cellular delivery efficiency of a chemotherapeutic compound by a factor of 3−4, as compared to the free drug or the drug-loaded liposome precursor. On one side, this method allows the biocamouflage of liposomes by enriching their lipid bilayer and inner compartment with biogenic molecules. On the other side, the proposed fusion strategy enables efficient EV loading, and the pharmaceutical development of EVs with adaptable activity and drug delivery property

Selective Activation of Cognate SNAREpins by Sec1/Munc18 Proteins

SummarySec1/Munc18 (SM) proteins are required for every step of intracellular membrane fusion, but their molecular mechanism of action has been unclear. In this work, we demonstrate a fundamental role of the SM protein: to act as a stimulatory subunit of its cognate SNARE fusion machinery. In a reconstituted system, mammalian SNARE pairs assemble between bilayers to drive a basal fusion reaction. Munc18-1/nSec1, a synaptic SM protein required for neurotransmitter release, strongly accelerates this reaction through direct contact with both t- and v-SNAREs. Munc18-1 accelerates fusion only for the cognate SNAREs for exocytosis, therefore enhancing fusion specificity