Kommunikationsempfehlungen zur Verbesserung des Verhaltens bei der Verwendung von PoC Antigen-Schnelltests und Selbsttests

Die breitere Anwendung von Antigentests zum Auffinden einer akuten Infektion mit SARS-CoV-2 beinhaltet Chancen, aber auch Risiken und Limitationen. Die Tests können als einer von mehreren Bausteinen zur Pandemiekontrolle beitragen, indem sie die Erkennung von Infektionen und somit die Unterbrechung von Infektionsketten ermöglichen - insbesondere durch wiederholte, engmaschige Testungen derselben Personen. Der Beitrag fasst die wichtigsten Aspekte zusammen und gibt evidenzbasierte Tipps zur Kommunikation rund um die PoC Antigen-Schnelltests und Selbsttests

Identification of the intracellular transport system of a viral A/B-toxin in yeast

Die Hefe Saccharomyces cerevisiae sezerniert das von dsRNA Viren kodierte, heterodimere K28-Toxin in das sie umgebende Medium und ist somit in der Lage, Hefen derselben oder einer anderen Gattung abzutöten. Der als Präprotoxin (pptox) vorliegende Toxinvorläufer wird posttranslational in das ER-Lumen transportiert und nach Abspaltung der Signalsequenz werden die beiden Untereinheiten des reifen Toxins, &#945; und &#946;, durch eine Disulfidbrücke miteinander verbunden. Die Toxinaufnahme durch sensitive Zielzellen erfolgt über rezeptorvermittelte Endozytose, an deren Anschluss K28 retrograd über Golgi und ER bis auf die Stufe des Zytosols transportiert wird. Die Retrotranslokation aus dem ER erfolgt über den Sec61-Komplex der ER-Membran. Im Zytosol dissoziiert das &#945;/&#946;-Heterodimer in seine Toxinuntereinheiten, &#946; wird ubiquitiniert und proteasomal abgebaut, während die zytotoxische &#945;-Komponente mittels passiver Diffusion in den Zellkern gelangt und einen Zellzyklusarrest am G1/S-Übergang induziert. In der vorliegenden Arbeit wurden vier Themenschwerpunkte bearbeitet, die sich mit der intrazellulären Expression toxischer K28&#945;-Derivate und deren intrazellulären Transportroute beschäftigten. (1) Im Rahmen einer Transposon(mTn3)-Mutagenese konnten überwiegend nicht-essentielle Hefeproteine als potentielle Interaktionspartner der beiden toxischen &#945;-Varianten &#945;(SS/R) und &#945;(NLS/R) identifiziert werden: APL3, CWP2, IRA2, PFK26, PRP6, RNH203 und ZWF1. Die toxischen &#945;-Varianten wurden in den jeweiligen knock-out-Mutanten der betreffenden Gene intrazellulär exprimiert und zusätzlich gegen exogen appliziertes K28-Toxin getestet. Es stellte sich heraus, dass die beiden Proteine Prp6p und Apl3p potentielle Interaktionspartner von &#945; darstellen könnten. Das Gen PRP6 wurde anhand des Konstruktes &#945;(NLS/R)identifiziert. PRP6 kodiert den RNP(U4/U6)-assoziierten Spleißfaktor Prp6p, der am prä-mRNA-Spleißen beteiligt ist und sich in der Kernmatrix befindet. Prp6p könnte somit mit K28&#945; im Kern in direkte Wechselwirkung treten, was die Theorie des Kernimportes unterstützt. Die Mutation des Genes ist letal, weshalb das Protein nicht weiter untersucht wurde, da keine Expressionsstudien damit durchgeführt werden konnten. Des Weiteren wurde mit &#945;(NLS/R) das Gen APL3 identifiziert, was einen Hinweis auf einen gerichteten Kernimport von K28&#945; lieferte. Bei Apl3p handelt es sich um einen Teil des an der Clathrin-vermittelten Endozytose beteiligten AP2-Komplexes. Apl3p durchläuft ein nukleoplasmatisches "Shuttling". Auf dem Weg in den Zellkern könnte es mit der &#945;-Untereinheit interagieren und eventuell dessen Import in den Nukleus erleichtern; alternativ wäre eine Interaktion nach passiver Diffusion von &#945;(NLS/R) im Nukleus möglich. Interessanterweise verhielt sich die &#916;apl3-Mutante auch resistent gegen exogen appliziertes Toxin. Diese Resistenz beruht jedoch nicht auf einem Defekt der endozytotischen Toxin-Aufnahme (das Toxin war im Zytosol nachweisbar), sondern manifestiert sich vermutlich weiter "downstream", da sich die Mutante auch resistent gegen die Expression von &#945;(SS/R) im ER verhielt. (2) Mit Hilfe eines Mutanten-Screenings konnte untermauert werden, dass &#945;(SS/R) in den Sekretionsweg der Zelle eingeschleust wird und die Signalpeptidaseaktivität im ER eine entscheidende Rolle für die Retrotranslokation und Toxizität spielt. Darüber hinaus wurden deutliche Hinweise dafür erbracht, dass &#945;(SS/R) bis auf die Stufe des Golgi gelangt und anschließend wieder retrograd zum ER transportiert wird, was aus der Resistenz der Mutanten &#916;kex1, &#916;erv29, &#916;erv46, &#916;erv41, &#916;emp24, &#916;emp46 und &#916;bst1 nach intrazellulärer Expression von &#945;(SS/R)gezeigt werden konnte. Zwei Möglichkeiten sind somit beim intrazellulären Transport der &#945;-Untereinheit denkbar: &#945; wird nach Erreichen des Golgi wieder retrotransportiert und aus dem ER in das Zytosol transloziert; im Zytosol angekommen, erfolgt eine passive Diffusion in den Kern, der eventuell eine Interaktion von &#945; mit zytosolischen Proteine vorausgeht. Hinweise darauf lieferten die Nukleoporinmutanten &#916;nup60, &#916;nup84 und &#916;gfd1, die nach intrazellulärer Expression von &#945;(SS/R) und &#945;(NLS/R) resistent waren oder lediglich ein leicht verzögertes Wachstum zeigten. Eine weitere Alternative wäre, dass &#945; im Fall von &#945;(SS/R) direkt vom Golgi das Zytosol erreicht. (3) Der intrazelluläre Nachweis der K28&#945;-Untereinheit konnte erstmals anhand einer cmyc-markierten Toxinvariante (&#945;(R)cmyc) erbracht werden. Die in vivo toxischen Varianten &#945;(SS/R)cmyc und &#945;(NLS/R)cmyc wurden weder im Zellaufschluss noch im Kulturüberstand nachgewiesen. Die durchgeführten Versuche ließen in Übereinstimmung mit den Mutantenanalysen den Schluss zu, dass &#945;(SS/R) in den Sekretionsweg geschleust werden muss, um seine toxische Wirkung entfalten zu können; &#945;(NLS/R) hingegen gelangt aufgrund der NLS direkt in den Kern; übereinstimmend hiermit war &#945;(R) nicht mehr toxisch. (4) Der Austausch aller Lysinreste innerhalb von K28pptox gegen Arginine lieferte K28—Derivate mit einer verminderten Sekretionsrate und einer dadurch bedingten verminderten Toxizität. Die Lysin-freien Varianten waren jedoch in der Lage, den Zellen eine protektive Immunität zu verleihen. Eine Erhöhung der Toxizität war in den K-0 Varianten von K28 nicht zu beobachten, so dass eine Ubiquitinierung bei der Vermittlung der Toxizität keine Rolle spielt.K28 killer strains of the yeast Saccharomyces cerevisiae secrete a heterodimeric killer toxin (K28) which is genetically encoded by dsRNA viruses persisting within the cytosol. The toxin kills sensitive strains of the same or related genera by cell-cycle inhibition. The toxin precursor (preprotoxin, pptox) is postranslationally imported into the ER. On its intracellular transport route through ER and Golgi, the pptoxsignal sequence is proteolytically cleaved within the ER, and the &#945;- and &#946;-subunits of the mature toxin are covalently linked by a single disulfide bridge. Toxin uptake by a sensitive target cell resembles receptor-mediated endocytosis followed by retrograde transport via Golgi and ER and translocation into the cytosol through the major ER-import and -export channel Sec61p. Within the cytosol, the two subunits dissociate, &#946; is ubiquitinated and proteasomally degraded, while &#945; diffuses into the nucleus and induces a cell cycle arrest at the G1/S-boundary. The located HDEL-sequence is responsible for the endocytotic uptake and represents a classical ER retention signal which is recognized and bound by the HDEL-receptor Erd2p of the target cell. The subjects being worked on within this thesis cope with the intracellular expression and transport of certain toxic K28&#945;-variants. The method of mTn3-mutagenesis was supposed to shed light onto intracellular interaction partners of the K28&#945;-subunit. These partners should be investigated with respect to their cellular function. Moreover, an intensive mutant screening should show which compartments and modifications are necessary to confer &#945; into its cytotoxic conformation. We also tried to detect the &#945;-subunit intracellularly and in the supernatant. We asked whether there is any difference between the intracellular way the toxic subunit takes and the way "normal\u27; toxin follows when exogenously applied. Finally we focused on different toxin variants that were modified by the exchange of their lysine residues against arginine to analyze the effect of ubiquitination on toxin retrotranslocation and in vivo toxicity. (1) By transposon(mTn3)mutagenesis several yeast genes could be identified whose gene products might be potential interaction partners of the suicidal &#945;-variants &#945;(SS/R) and &#945;(NLS/R): APL3, CWP2, IRA2, PFK26, PRP6, RNH203 and ZWF1. The lethal &#945;-derivatives were expressed in each knock-out mutant and, additionally, each mutant was tested for sensitivity/resistance against extracellularly applied K28-toxin. After intracellular expression of the two &#945;-variants, Apl3p and Prp6p were identified as potential interaction partners of &#945;. Prp6p is an essential gene product that plays a role within the snRNP(U4/U6)-associated splicing factor located in the nuclear matrix and involved in pre-mRNA-splicing. It is< known that Prp6p interacts with a wide range of proteins, including the ubiquitin ligase Ubc9p, and it might be possible that Prp6p interacts with K28&#945; in the nucleus, supporting the necessity of nuclear import for in vivo toxicity of K28. Besides Prp6p, another yeast protein (Apl3p) could be identified as possible interaction partner of &#945;(NLS/R) and &#945;(SS/R). As of the AP2-complex, Apl3p is associated with the clathrin dependent endocytosis machinery. Apl3p undergoes a nucleoplasmatic shuttling and therefore could interact with &#945; on its way to the nucleus and facilitate its nuclear import; alternatively, an interaction could take place within the nucleus. Interestingly, a &#916;apl3-knock-out was not only resistant against the intracellular expression of either &#945;(NLS/R) or &#945;(SS/R) but also against exogenously applied toxin. Toxin resistance in a &#916;apl3-mutant was not caused by a defect in endocytic toxin uptake, since toxin was detectable in the cytosol of toxin-treated mutant cells. Thus, its resistance is likely to be manifested downstream from endocytosis, presumably within the nucleus. (2) Phenotypic analysis of various yeast mutants strongly indicated that &#945;(SS/R) is transported into the ER lumen where signal peptidase processing is crucial for the in vivo toxicity of &#945;. Furthermore, strong evidence was obtained that the variant &#945;(SS/R) even reaches the Golgi compartment from where it is transported retrograde back to the ER. The following yeast knock-out mutants showed complete resistance against the intracellular expression of lethal K28&#945;-variants: &#916;kex1, &#916;erv29, &#916;erv46, &#916;erv41, &#916;emp24, &#916;emp46 and &#916;bst1. Thus, two possible intracellular transport routes for K28&#945; can be postulated: either &#945; is transported from the Golgi back to the ER and thereafter into the cytosol from where it diffuses into the nucleus to kill a cell. Such a pathway is supported by the observed toxin resistance in the yeast nucleoporine mutants &#916;nup60, &#916;nup84 and &#916;gfd1 after intracellular expression of either &#945;(SS/R) or &#945;(NLS/R). Alternatively, &#945;(SS/R) directly translocates from the Golgi to the cytosol to reach the nucleus. (3) For the first time, after expression of a cmyc-tagged, non-toxic &#945;-variant (&#945;(R)cmyc) the subunit could be detected by western analysis. Neither the toxic variant &#945;(SS/R)cmyc nor &#945;(NLS/R)cmyc could be detected within the cell cytosol or in the cell-free culture supernatant. These tests, in addition to the mutant screen, also showed that &#945;(SS/R) has to gain access to the secretory pathway in order to be converted into its cytotoxic conformation; in contrast, &#945;(NLS/R) directly enters the nucleus via its NLS. (4) Substitution of all internal lysine residues within K28pptox by arginines resulted in a toxin variant that was still in vivo toxic and capable to translocate from the ER into the cytosol, while immunity of lysine-free pptox was negatively affected. Therefore it can be concluded that ubiquitination is neither involved in ER exit nor in in vivo toxicity of K28

Retrotranslocation of a viral A/B toxin from the yeast endoplasmic reticulum is independent of ubiquitination and ERAD

K28 is a viral A/B toxin that traverses eukaryotic cells by endocytosis and retrograde transport through the secretory pathway. Here we show that toxin retrotranslocation from the endoplasmic reticulum (ER) requires Kar2p/BiP, Pdi1p, Scj1p, Jem1p, and proper maintenance of Ca(2+) homeostasis. Neither cytosolic chaperones nor Cdc48p/Ufd1p/Npl4p complex components or proteasome activity are required for ER exit, indicating that K28 retrotranslocation is mechanistically different from classical ER-associated protein degradation (ERAD). We demonstrate that K28 exits the ER in a heterodimeric but unfolded conformation and dissociates into its subunits as it emerges into the cytosol where β is ubiquitinated and degraded. ER export and in vivo toxicity were not affected in a lysine-free K28 variant nor under conditions when ubiquitination and proteasome activity was blocked. In contrast, toxin uptake from the plasma membrane required Ubc4p (E2) and Rsp5p (E3) and intoxicated ubc4 and rsp5 mutants accumulate K28 at the cell surface incapable of toxin internalization. We propose a model in which ubiquitination is involved in the endocytic pathway of the toxin, while ER-to-cytosol retrotranslocation is independent of ubiquitination, ERAD and proteasome activity

Antigentests als ergänzendes Instrument in der Pandemiebekämpfung

Da mit Beginn der dritten Infektionswelle der überwiegende Teil der Bevölkerung noch nicht gegen SARS-CoV-2 geimpft und gleichzeitig ein Anstieg der Fallzahlen zu beobachten ist, bleiben nicht-pharmazeutische Maßnahmen wichtige Bausteine, um das Infektionsgeschehen zu kontrollieren. Zusätzlich zu den bestehenden Verhaltensregeln Abstand – Hygiene – Maske und Lüften, kann ein erweitertes Testkonzept, das auch die breite Testung von symptomfreien Personen mit einbezieht, zur Pandemiebekämpfung beitragen, indem es die Erkennung von Infektionen und so die Unterbrechung von Infektionsketten ermöglicht. Im Epidemiologischen Bulletin 17/2021 wird erläutert, wie Antigen-Schnelltests zur Pandemiekontrolle beitragen können. Außerdem werden die Chancen und Herausforderungen einer wiederholten Testung zur Reduktion des allgemeinen Transmissionsgeschehens und der zu erwartende Einfluss eines freiwilligen Testangebots auf das allgemeine Infektionsgeschehen diskutiert

Was ist bei Antigentests zur Eigenanwendung (Selbsttests) zum Nachweis von SARS-CoV-2 zu beachten?

Für den Nachweis einer akuten SARS-CoV-2-Infektion stehen in Deutschland aktuell zwei unterschiedliche Testverfahren zur Verfügung: PCR-Methoden und Antigentests. Beide verwenden Untersuchungsmaterial aus den oberen Atemwegen und sind zur Anwendung durch Fachpersonal vorgesehen. Der Nachweis von SARS-CoV-2 mittels RT-PCR ist der Goldstandard und zeichnet sich durch eine sehr hohe Sensitivität und Spezifität aus. Allerdings sind bei hohem Probeaufkommen PCR-basierte Tests eine begrenzte Ressource. Laborbasierte Antigentests oder sogenannte „Antigen-Schnelltests“ lassen sich mit deutlich weniger Aufwand durchführen und liefern ein Ergebnis in kurzer Zeit. Sie können allerdings zu einer höheren Anzahl falsch negativer bzw. falsch positiver Testergebnisse führen. Falsch positive Ergebnisse können durch einen nachfolgenden PCR-Test erkannt werden. Derzeit werden Antigentests, bei denen Probennahme, Testung und Bewertung des Ergebnisses durch medizinische Laien vorgesehen sind, im Rahmen der CE-Kennzeichnung geprüft. Das Epidemiologische Bulletin 8/2021 beschreibt die Chancen, aber auch Risiken und Limitationen bei der Eigenanwendung von Antigen-Selbsttests zum Nachweis einer akuten Infektion mit SARS-CoV-2.Peer Reviewe