Механізми участі фізіологічної системи сполучної тканини у формуванні патологічних процесів

Дисертація присвячена вирішенню актуальної проблеми встановлення ролі стереотипних реакцій сполучної тканини як фізіологічної системи в розвитку патологічного процесу. Сформульовані загальні принципи оцінки стану фізіологічної системи сполучної тканини та визначена її роль у розвитку патологічного процесу в паренхіматозних органах (нирки, печінка, підшлункова залоза) і кістковій тканині. Вперше вивчена роль регуляторного шляху RANK-RANKL-OPG при експериментальному моделюванні патології нирок, встановлена його активація та наявність взаємозв'язку з про- та протизапальними цитокінами, у тому числі позитивна кореляція між RANKL і профібротичним TGF-β1 (r = 0,61). Виявлені нові патогенетичні механізми порушення стану кісткової тканини, розвитку фіброзу печінки та підшлункової залози, пов'язані зі зниженням функціональної активності тромбоцитів. Встановлено, що механізми гемостазу впливають на активацію проліферативних процесів у сполучній тканині. Можливість перенесення отриманих даних на організм людини уточнювалася на клінічному матеріалі. Виявлена роль стану фізіологічної системи сполучної тканини у розвитку ускладнень і рецидивів у хворих з гідронефротичною трансформацією нирок, встановлена активація регуляторного шляху RANK-RANKL-OPG у хворих на гідронефроз. Показана взаємодія різних механізмів регуляції фізіологічної системи сполучної тканини при розвитку патології органів панкреатодуоденальної зони. На основі оцінки стану фізіологічної системи сполучної тканини запропоновані методи прогнозування хірургічних ускладнень та рецидивів захворювання. Проведений метааналіз отриманих даних, на основі якого за допомогою факторного аналізу встановлені основні групи показників (факторів), які відображають основні напрямки патологічного процесу, опосередковані реакцією фізіологічної системи сполучної тканини. Доповнені наукові дані про механізми хронізації патологічного процесу при захворюваннях нирок, показано, що зміни функціонального стану сполучної тканини можуть бути кількісно зафіксовані навіть у разі уповільненого патологічного процесу в невеликому за масою органі. Доповнені наукові дані про роль та ступінь залученості порушень регуляторної функції фізіологічної системи сполучної тканини у розвиток захворювань шлунково-кишкового тракту, в тому числі дуоденальної виразки. Показана роль і значення зниження фізіологічних резервів фізіологічної системи сполучної тканини для збільшення ризиків захворюваності в популяції. Запропоновано метод оцінки ризиків для популяційного здоров'я населення на основі аналізу фізіологічних резервів фізіологічної системи сполучної тканини.Диссертация посвящена решению актуальной проблемы – установления роли стереотипных реакций соединительной ткани как физиологической системы в развитии патологического процесса. Изучались механизмы регуляции на уровне межклеточных медиаторов и других молекулярных факторов на моделях патологии паренхиматозных органов (почки, печень, поджелудочная железа) и костной ткани в эксперименте. Возможность переноса полученных данных на организм человека уточнялась на клиническом материале. Установлено, что при моделировании патологии почек нарушаются механизмы регуляции соединительной ткани, которые осуществляются цитокинами, увеличиваются уровни адипокинов, активируется регуляторное звено костной ткани – путь RANKRANKL-OPG, имеет место положительная корреляция между RANKL и висфатином (r = 0,48), профибротическим TGF-β1 и адипонектином (r = 0,47). Моделирование патологии органов панкреатодуоденальной зоны и фиброза печени приводит к развитию деструктивно-дистрофических изменений, наиболее выраженных в печени, которые сопровождаются повышением экскреции оксипролина с мочой за счет связанной фракции. Нарушение репаративной регенерации и выход патологического процесса на системный уровень определяется расстройством взаимодействия клеток соединительной ткани с тромбоцитами. Механизм влияния реализуется через систему цитокинов, которые имеют тесные корреляционные связи с функциональной активностью тромбоцитарного звена гемостаза. При моделировании нарушений состояния костной ткани, хронической патологии органов панкреатодуоденальной зоны и фиброза печени механизмы гемостаза влияют на активацию пролиферативных процессов в соединительной ткани, что проявляется снижением функциональной активности тромбоцитов. В группе больных с гидронефрозом установлена активация регуляторного пути RANK-RANKL-OPG, что свидетельствует о вовлечении механизмов регулирования на уровне физиологической системы соединительной ткани. Основой этого процесса является дисбаланс в системе цитокинов – IL-1RA, IL-17 и висфатина, а также дисбаланс (отрицательная корреляция) между уровнями TGF-β1 и адипонектина (r = - 0,29). У больных с обструктивной патологией панкреатодуоденальной зоны развитие и тяжесть послеоперационных осложнений зависят от степени выраженности исходного дисбаланса цитокинового профиля, в том числе снижения уровня противовоспалительной защиты. Развитие обструкции на фоне хронических заболеваний этой области сопровождалось появлением в крови антител к атипичным формам коллагена, что может вести к нарушению репаративной регенерации и развитию аутоиммунных повреждений. На основе анализа корреляционных связей и метаанализа данных определены три группы показателей, отражающих стереотипные механизмы регуляции физиологической системы соединительной ткани. Группа 1 – соответствует механизмам, которые действуют на уровне физиологической системы соединительной ткани в целом. Срыв этих адаптационных механизмов ведет к хронизации патологического процесса и повышению риска развития осложнений и рецидивов. К ней относятся уровни висфатина, IL-4, IL-6, TGF-β1, масса и плотность кости, параметры агрегации тромбоцитов при концентрации индуктора 10 мкмоль/л, которые являются основными молекулярными посредниками срыва естественного течения репаративной регенерации. Группа 2 – соответствует компенсаторным механизмам, действующим на уровне физиологической системы соединительной ткани при достаточном уровне физиологических резервов, при котором повреждение локализовано, а на системном уровне – компенсировано. В нее входят: уровни IL-1, IL-1RA, RANKL, кальцитонина и параметры агрегации тромбоцитов при концентрациях индуктора 2,5 и 10 мкмоль/л. Показатели группы 2 являются наиболее значимыми критериями для оценки снижения риска развития осложнений в ходе мониторинга заболеваний. Группа 3 – соответствует резкой активации обменных процессов на уровне физиологической системы соединительной ткани, при которых задействовано большинство путей регулирования, со смешением в сторону преобладания синтеза над распадом. Группа 3 объединяет уровни IL-17, OPG, RANKL, адипонектина, паратиреоидного гормона, всех фракций оксипролина и параметров агрегации тромбоцитов при концентрациях индуктора 2,5 и 5 мкмоль/л. Показатели этой группы наиболее информативны для оценки вовлеченности физиологической системы соединительной ткани в патологический процесс на ранних стадиях его развития, включая донозологические состояния. При значительных объемах повреждения и длительности заболевания выявляется вовлечение в развитие патологического процесса физиологической системы соединительной ткани в целом, то есть ее реакция наряду с реакциями других органов и систем при воспалении является одним из важных компонентов синдрома системного воспалительного ответа (SIRS). В зависимости от реактивности организма и особенностей повреждения изменяется ход процесса и степень вовлечения системы соединительной ткани, что является важным фактором хронизации и риска рецидивирования. Доказано значение степени вовлечения соединительной ткани и диагностическая ценность показателей её обмена (оксипролина и гликозаминогликанов) для ранней диагностики нефросклероза у больных хроническим пиелонефритом, ренальной остеодистрофии у больных с хронической почечной недостаточностью, патологических процессов разной интенсивности в желудке; роль межклеточных медиаторов в механизме репаративной регенерации у подростков с дуоденальной язвой, у детей с кардиопатией и остеопенией на фоне недифференцированной дисплазии соединительной ткани. Доказана возможность использования оксипролина, гликозаминогликанов и антител к атипичным формам коллагена в качестве молекулярных маркеров для диагностики донозологических состояний и оценки популяционного здоровья.Dissertation is devoted to solving the urgent problem of establishing the role of the stereotypical reactions of connective tissue as a physiological system in the development of the pathological processes. General principles for the assessment of the physiological system of connective tissue are formulated, and its role in the development of the pathological processes in the parenchymatous organs (kidney, liver, pancreas) and bone is determined. We first studied the role of regulatory path RANK-RANKL-OPG in experimental modeling of renal diseases, its activation and the relationship with pro- and anti-inflammatory cytokines, including a positive correlation between RANKL and profibrogenic TGF-β1 (r = 0,61). New pathogenetic mechanisms of disturbances of condition of bone tissue are identified and development of fibrosis of the liver and pancreas, associated with a decrease in the functional activity of platelets is made. It is established that the hemostasis mechanisms influence the activation of proliferative processes in the connective tissue. Possibility of transferring the data on the person was specified on the clinical material. Role of the state of the physiological system of connective tissue in the development of complications and recurrences in patients with hydronephrotic transformation of the kidneys is detected; activation regulatory path RANKRANKL-OPG in patients with hydronephrosis is established. Interrelation of the various mechanisms of regulation of the physiological system of connective tissue in the development of pathology of the pancreatoduodenal zones’ organs is shown. Based on the assessment of the physiological system of connective tissue the methods for predicting surgical complications and recurrence of the disease are proposed. Conducted meta-analysis of the obtained data, on the basis of which with the help of factor analysis, the main groups of indicators (factors) are established, which reflect the main directions of the pathological process, mediated reactions in physiological system of the connective tissue. Augmented scientific data on the mechanisms of chronization of the pathological process in diseases of the kidneys is supplemented; it is shown that changes of the functional state of the connective tissue can be quantitatively recorded even in the case of a sluggish pathological process in the small mass organ. Augmented scientific data on the role and degree of involvement of the regulatory function damages of the physiological system of connective tissue in the development of diseases of the gastrointestinal tract, including duodenal ulcer is supplemented. Role and significance of the decline in physiological reserves of the physiological system of connective tissue to increase the risk of morbidity in the population is shown. Method of risk assessment for population health based on the analysis of physiological reserves of the physiological system of the connective tissue is proposed

Visualization and Quantitative Analysis of G Protein-Coupled Receptor−β-Arrestin Interaction in Single Cells and Specific Organs of Living Mice Using Split Luciferase Complementation

Methods used to assess the efficacy of potentially therapeutic reagents for G protein-coupled receptors (GPCRs) have been developed. Previously, we demonstrated sensitive detection of the interaction of GPCRs and β-arrestin2 (ARRB2) using 96-well microtiter plates and a bioluminescence microscope based on split click beetle luciferase complementation. Herein, using firefly luciferase emitting longer wavelength light, we demonstrate quantitative analysis of the interaction of β2-adrenergic receptor (ADRB2), a kind of GPCR, and ARRB2 in a 96-well plate assay with single-cell imaging. Additionally, we showed bioluminescence <i>in vivo</i> imaging of the ADRB2–ARRB2 interaction in two systems: cell implantation and hydrodynamic tail vein (HTV) methods. Specifically, in the HTV method, the luminescence signal from the liver upon stimulation of an agonist for ADRB2 was obtained in the intact systems of mice. The results demonstrate that this method enables noninvasive screening of the efficacy of chemicals at the specific organ in <i>in vivo</i> testing. This <i>in vivo</i> system can contribute to effective evaluation in pharmacokinetics and pharmacodynamics and expedite the development of new drugs for GPCRs

Fluorescent Probes for Imaging Endogenous β-Actin mRNA in Living Cells Using Fluorescent Protein-Tagged Pumilio

Subcellular localization and dynamics of mRNAs control various physiological functions in living cells. A novel technique for visualizing endogenous mRNAs in living cells is necessary for investigation of the spatiotemporal movement of mRNAs. A pumilio homology domain of human pumilio 1 (PUM-HD) is a useful RNA binding protein as a tool for mRNA recognition because the domain can be modified to bind a specific 8-base sequence of target mRNA. In this study, we designed PUM-HD to match the sequence of β-actin mRNA and developed an mRNA probe consisting of two PUM-HD mutants flanking full-length enhanced green fluorescent protein (EGFP). Fluorescence microscopy with the probe in living cells revealed that the probe was labeled precisely with the β-actin mRNA in cytosol. Fluorescent spots from the probe were colocalized with microtubules and moved directionally in living cells. The PUM-HD mutants conjugated with full-length EGFP can enable visualization of β-actin mRNA localization and dynamics in living cells

Measuring CREB Activation Using Bioluminescent Probes That Detect KID–KIX Interaction in Living Cells

The cyclic adenosine monophosphate response element-binding protein (CREB) is a transcription factor that contributes to memory formation. The transcriptional activity of CREB is induced by its phosphorylation at Ser-133 and subsequent interaction with the CREB-binding protein (CBP)/p300. We designed and optimized firefly split luciferase probe proteins that detect the interaction of the kinase-inducible domain (KID) of CREB and the KIX domain of CBP/p300. The increase in the light intensity of the probe proteins results from the phosphorylation of the responsible serine corresponding to Ser-133 of CREB. Because these proteins have a high signal-to-noise ratio and are nontoxic, it has become possible for the first time to carry out long-term measurement of KID–KIX interaction in living cells. Furthermore, we examined the usefulness of the probe proteins for future high-throughput cell-based drug screening and found several herbal extracts that activated CREB

Simultaneous Time-Lamination Imaging of Protein Association Using a Split Fluorescent Timer Protein

Studies of temporal behaviors of protein association in living cells are crucially important for elucidating the fundamental roles and the mechanism of interactive coordination for cell activities. We developed a method for investigating the temporal alternation of a particular protein assembly using monomeric fluorescent proteins, fluorescent timers (FTs), of which the fluorescent color changes from blue to red over time. We identified a dissection site of the FTs, which allows complementation of the split FT fragments. The split fragments of each FT variant recovered their fluorescence and maintained inherent rates of the color changes upon the reassembly of the fragments in vitro. We applied this method to visualize the aggregation process of α-synuclein in living cells. The size of the aggregates with the temporal information was analyzed from ratio values of the blue and red fluorescence of the reconstituted FTs, from which the aggregation rates were evaluated. This method using the split FT fragments enables tracing and visualizing temporal alternations of various protein associations by single fluorescence measurements at a given time point

Bioluminescent Indicator for Highly Sensitive Analysis of Estrogenic Activity in a Cell-Based Format

Estrogens regulate different physiological systems with wide ranges of concentrations. The rapid analysis of estrogens is crucially important for drug discovery and medical diagnosis, but quantitation of nanomolar estrogens in live cells persists as an important challenge. We herein describe a bioluminescent indicator used to detect low concentrations of estrogens quantitatively with a high signal-to-background ratio. The indicator comprises a ligand-binding domain of an estrogen receptor connected with its binding peptide, which is sandwiched between split fragments of a luciferase mutant. Results show that the indicator recovered its bioluminescence upon binding to 17β-estradiol at concentrations higher than 1.0 × 10^–10 M. The indicator was reactive to agonists but did not respond to antagonists. The indicator is expected to be applicable for rapid screening estrogenic compounds and inhibitors, facilitating the discovery of drug candidates in a high-throughput manner

Spectral Mining for Discriminating Blood Origins in the Presence of Substrate Interference via Attenuated Total Reflection Fourier Transform Infrared Spectroscopy: Postmortem or Antemortem Blood?

Often in criminal investigations, discrimination of types of body fluid evidence is crucially important to ascertain how a crime was committed. Compared to current methods using biochemical techniques, vibrational spectroscopic approaches can provide versatile applicability to identify various body fluid types without sample invasion. However, their applicability is limited to pure body fluid samples because important signals from body fluids incorporated in a substrate are affected strongly by interference from substrate signals. Herein, we describe a novel approach to recover body fluid signals that are embedded in strong substrate interferences using attenuated total reflection Fourier transform infrared (ATR FT-IR) spectroscopy and an innovative multivariate spectral processing. This technique supported detection of covert features of body fluid signals, and then identified origins of body fluid stains on substrates. We discriminated between ATR FT-IR spectra of postmortem blood (PB) and those of antemortem blood (AB) by creating a multivariate statistics model. From ATR FT-IR spectra of PB and AB stains on interfering substrates (polyester, cotton, and denim), blood-originated signals were extracted by a weighted linear regression approach we developed originally using principal components of both blood and substrate spectra. The blood-originated signals were finally classified by the discriminant model, demonstrating high discriminant accuracy. The present method can identify body fluid evidence independently of the substrate type, which is expected to promote the application of vibrational spectroscopic techniques in forensic body fluid analysis

Bioluminescent Probes to Analyze Ligand-Induced Phosphatidylinositol 3,4,5-Trisphosphate Production with Split Luciferase Complementation

A lipid second messenger, phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate (PIP₃), is a signaling molecule that mediates central cellular events, such as growth, motility, and development by activating downstream proteins. Although functions of various PIP₃ binding partners have been unveiled, the various roles of PIP₃ have not been resolved thoroughly because of limitations of PIP₃ analysis. Herein, we describe a novel method for the analysis of relative PIP₃ amount based on spontaneous complementation of split luciferase fragments. An N-terminal fragment of a luciferase was located on the plasma membrane (LucN-pm). A C-terminal fragment of a luciferase fused with PIP₃ binding units, pleckstrin homology domains (PHDs) of the general receptor for phosphoinositides 1 (GRP1), was expressed in cytosol (PP-LucC). In response to PIP₃ production, PP-LucC was brought to the plasma membrane and colocalized with LucN-pm. The LucN-pm and PP-LucC reconstituted spontaneously to form an active luciferase, producing bioluminescence recovery. We obtained bioluminescence signals corresponding to relative PIP₃ amounts successfully upon stimulation with an agonist. We also demonstrated that the probes were applied for a high-throughput screening format and for monitoring of PIP₃ production on the plasma membrane by bioluminescence. This method enables further study of PIP₃ and supports versatile applications related to the PIP₃ amount

MOESM1 of Rapid in vivo lipid/carbohydrate quantification of single microalgal cell by Raman spectral imaging to reveal salinity-induced starch-to-lipid shift

Additional file 1: Figure S1. The stability test of our Raman setup over 6 hour’s measurement. Figure S2. The raw data without fluorescence background subtraction calculations for the data shown in Fig. 2. Figure S3. The TEM images of microalgal cells under different stress conditions

Heat shock factor 1 (HSF1) interacts with BMAL1:CLOCK after the heat shock (HS) pulse.

<p>Wild-type (WT) mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were treated with or without an HS pulse. At 24 h after the HS pulse, the lysates were subjected to immunoblotting for PER2, HSP70, BMAL1, HSF1, and actin. Representative images from triplicate independent experiments are shown (<b>A</b>). WT and <i>Hsf1</i>^−/− MEFs were treated with the HS pulse. At the indicated times after the HS pulse, the lysates (<b>B</b>) and BMAL1/HSF1 immunoprecipitates (<b>D; CoIP</b>) were subjected to immunoblotting for PER2, HSP70, BMAL1, HSF1, CLOCK, and actin. Representative images from triplicate independent experiments are shown. Normalized PER2 and HSP70 protein levels (<b>B</b>; at 26 h after the HS pulse), and BMAL1 coimmunoprecipitated with HSF1 and CLOCK (<b>D</b>) are shown as average values from triplicate independent experiments. Error bars indicate standard deviation (SD) (*** P<0.001). (<b>C</b>) WT and <i>Hsf1</i>^−/− MEFs were treated with the HS pulse. At the indicated times after the HS pulse, the lysates were subjected to immunoblotting for PER2, HSP70, BMAL1, HSF1, and actin. Representative images from triplicate independent experiments are shown. Normalized circadian PER2 and HSP70 protein profiles plotted with average values from triplicate independent experiments are shown and error bars indicate SD.</p