Étude de nouvelles cibles pour le diagnostic de la trypanosomose animale africaine : Expression et purification d’antigènes recombinants de trypanosomes et évaluation de leur potentiel diagnostique Identification des antigènes immunoréactifs sécrétés par T. congolense

Trypanosoma congolense, T. vivax, and T. brucei brucei are the causative agents of a devastating disease of livestock, known as African animal trypanosomiasis (AAT) or nagana, occurring in 38 African countries in the sub-Saharan region. Without a vaccine, the control of the disease relies on vector control, chemotherapy, and diagnosis, which is essential for appropriate treatment and follow-up. Serological diagnosis, although applicable in the field according to the test format, has limitations. It lacks antigen standardization, sensitivity and specificity, with rapid diagnostic tests (RDTs) being often inaccessible. The aims of this thesis were to: (i) characterize the diagnostic potential of proteins identified and studied in the host laboratories, (ii) select, from "omics" data, new targets and evaluate their diagnostic potential individually and in combination, and, (iii) identify immunogenic proteins from proteomic and immunoinformatic analysis of the trypanosome secretome. Diagnostic potential of candidate proteins was explored, after their expression and purification, by indirect ELISA with bovine sera from experimental infections and sera from cattle naturally infected by trypanosomes. Individually, the proteins showed low sensitivity. However, combining proteins of equivalent immunoreactivity significantly increased the sensitivity of the tests with a specificity that remained satisfactory. These results constitute a proof of concept of the performance of protein combinations in the diagnosis of AAT. It provides an opportunity to explore new innovative approaches, including the combination of immunogenic peptides of different immunoreactive proteins in the form of chimeras for serological diagnosis. Furthermore, and in consideration of their performance, none of the newly tested proteins could be included individually in an RDT. To find appropriate candidates, we identified trypanosome secreted/excreted proteins by mass spectrometry. Using epitope prediction analysis, we identified approximately 100 putatively immunogenic proteins with multiple epitopes in their sequences. The reactivity analysis of sera from different bovine breeds with the trypanosome secretome showed that the proteins were strongly recognized by the antibodies of the sera used and corresponded mainly to four molecular sizes. At these sizes, a significant number of proteins characterized in silico as immunogenic were detected. These results provide a reliable data for selection of new proteins to be include in serological tests for AAT. They also provide a better understanding of the differences in humoral responses of cattle breeds with different susceptibility to trypanosomosis.Trypanosoma congolense, T. vivax et T. brucei brucei sont les agents responsables d’une maladie dévastatrice du bétail, appelée trypanosomose animale africaine (TAA) ou nagana, qui touche 38 pays africains de la région subsaharienne. En absence du vaccin, le contrôle de la maladie repose sur la lutte anti-vectorielle, la chimiothérapie et le diagnostic, une étape indispensable à la mise en place des traitements appropriés et au suivi. Le diagnostic sérologique, bien qu’applicable sur le terrain selon le format du test, rencontre toutefois des limitations. Il manque de standardisation des antigènes, de sensibilité et de spécificité avec des tests de diagnostic rapide (TDR) souvent peu accessibles. Les objectifs de cette thèse étaient de : (i) caractériser le potentiel diagnostique de protéines identifiées et étudiées dans les laboratoires d’accueils, (ii) sélectionner à partir des données « omiques », de nouvelles cibles et évaluer leur potentiel diagnostique individuel et en combinaison, et (iii) identifier les protéines immunogéniques à partir d’analyse protéomique et immuno-informatique du sécrétome de trypanosomes. L’exploration du potentiel diagnostique de protéines candidates a été réalisée, après leur expression et leur purification, par ELISA indirect avec des sérums de bovins issus d’infections expérimentales et des sérums issus de bovins infectés naturellement par les trypanosomes. Testées individuellement, les protéines ont montré une faible sensibilité. Cependant, la combinaison des protéines d’immuno-réactivité équivalente a permis d’augmenter significativement la sensibilité des tests avec une spécificité qui reste satisfaisante. Ces résultats constituent une preuve de concept, de la performance des combinaisons de protéines dans le diagnostic de la TAA. Il offre la possibilité d’explorer de nouvelles approches innovantes, notamment l’association de peptides immunogéniques de différentes protéines immunoréactives sous forme de chimères pour le diagnostic sérologique. D’autre part, et au regard de leur performance, aucune des protéines nouvellement testées ne pourra être incluse de manière individuelle dans un TDR. Pour trouver des candidats adaptés, nous avons identifié des protéines sécrétées/excrétées de trypanosomes par spectrométrie de masse. Grâce à une analyse de prédiction d’épitopes, nous avons identifié une centaine de protéines putativement immunogéniques présentant plusieurs épitopes dans leurs séquences. L’analyse de la réactivité des sérums provenant de différentes races bovines avec le sécrétome de trypanosomes a permis de détecter des protéines fortement reconnues par les anticorps des sérums utilisés et correspondant principalement à quatre tailles moléculaires. À ces tailles, un grand nombre de protéines caractérisées in silico comme immunogéniques avaient été détectées. Ces données fournissent une base de sélection fiable des nouvelles protéines à inclure dans les tests sérologiques de la TAA. Elles permettent également de mieux comprendre les différences de réponses humorales de races bovines présentant une susceptibilité différente aux trypanosomoses

Study of new diagnostic targets for African animal trypanosomosis

Trypanosoma congolense, T. vivax et T. brucei brucei sont les agents responsables d’une maladie dévastatrice du bétail, appelée trypanosomose animale africaine (TAA) ou nagana, qui touche 38 pays africains de la région subsaharienne. En absence du vaccin, le contrôle de la maladie repose sur la lutte anti-vectorielle, la chimiothérapie et le diagnostic, une étape indispensable à la mise en place des traitements appropriés et au suivi. Le diagnostic sérologique, bien qu’applicable sur le terrain selon le format du test, rencontre toutefois des limitations. Il manque de standardisation des antigènes, de sensibilité et de spécificité avec des tests de diagnostic rapide (TDR) souvent peu accessibles. Les objectifs de cette thèse étaient de : (i) caractériser le potentiel diagnostique de protéines identifiées et étudiées dans les laboratoires d’accueils, (ii) sélectionner à partir des données « omiques », de nouvelles cibles et évaluer leur potentiel diagnostique individuel et en combinaison, et (iii) identifier les protéines immunogéniques à partir d’analyse protéomique et immuno-informatique du sécrétome de trypanosomes. L’exploration du potentiel diagnostique de protéines candidates a été réalisée, après leur expression et leur purification, par ELISA indirect avec des sérums de bovins issus d’infections expérimentales et des sérums issus de bovins infectés naturellement par les trypanosomes. Testées individuellement, les protéines ont montré une faible sensibilité. Cependant, la combinaison des protéines d’immuno-réactivité équivalente a permis d’augmenter significativement la sensibilité des tests avec une spécificité qui reste satisfaisante. Ces résultats constituent une preuve de concept, de la performance des combinaisons de protéines dans le diagnostic de la TAA. Il offre la possibilité d’explorer de nouvelles approches innovantes, notamment l’association de peptides immunogéniques de différentes protéines immunoréactives sous forme de chimères pour le diagnostic sérologique. D’autre part, et au regard de leur performance, aucune des protéines nouvellement testées ne pourra être incluse de manière individuelle dans un TDR. Pour trouver des candidats adaptés, nous avons identifié des protéines sécrétées/excrétées de trypanosomes par spectrométrie de masse. Grâce à une analyse de prédiction d’épitopes, nous avons identifié une centaine de protéines putativement immunogéniques présentant plusieurs épitopes dans leurs séquences. L’analyse de la réactivité des sérums provenant de différentes races bovines avec le sécrétome de trypanosomes a permis de détecter des protéines fortement reconnues par les anticorps des sérums utilisés et correspondant principalement à quatre tailles moléculaires. À ces tailles, un grand nombre de protéines caractérisées in silico comme immunogéniques avaient été détectées. Ces données fournissent une base de sélection fiable des nouvelles protéines à inclure dans les tests sérologiques de la TAA. Elles permettent également de mieux comprendre les différences de réponses humorales de races bovines présentant une susceptibilité différente aux trypanosomoses.Trypanosoma congolense, T. vivax, and T. brucei brucei are the causative agents of a devastating disease of livestock, known as African animal trypanosomiasis (AAT) or nagana, occurring in 38 African countries in the sub-Saharan region. Without a vaccine, the control of the disease relies on vector control, chemotherapy, and diagnosis, which is essential for appropriate treatment and follow-up. Serological diagnosis, although applicable in the field according to the test format, has limitations. It lacks antigen standardization, sensitivity and specificity, with rapid diagnostic tests (RDTs) being often inaccessible. The aims of this thesis were to: (i) characterize the diagnostic potential of proteins identified and studied in the host laboratories, (ii) select, from "omics" data, new targets and evaluate their diagnostic potential individually and in combination, and, (iii) identify immunogenic proteins from proteomic and immunoinformatic analysis of the trypanosome secretome. Diagnostic potential of candidate proteins was explored, after their expression and purification, by indirect ELISA with bovine sera from experimental infections and sera from cattle naturally infected by trypanosomes. Individually, the proteins showed low sensitivity. However, combining proteins of equivalent immunoreactivity significantly increased the sensitivity of the tests with a specificity that remained satisfactory. These results constitute a proof of concept of the performance of protein combinations in the diagnosis of AAT. It provides an opportunity to explore new innovative approaches, including the combination of immunogenic peptides of different immunoreactive proteins in the form of chimeras for serological diagnosis. Furthermore, and in consideration of their performance, none of the newly tested proteins could be included individually in an RDT. To find appropriate candidates, we identified trypanosome secreted/excreted proteins by mass spectrometry. Using epitope prediction analysis, we identified approximately 100 putatively immunogenic proteins with multiple epitopes in their sequences. The reactivity analysis of sera from different bovine breeds with the trypanosome secretome showed that the proteins were strongly recognized by the antibodies of the sera used and corresponded mainly to four molecular sizes. At these sizes, a significant number of proteins characterized in silico as immunogenic were detected. These results provide a reliable data for selection of new proteins to be include in serological tests for AAT. They also provide a better understanding of the differences in humoral responses of cattle breeds with different susceptibility to trypanosomosis

Diagnosis of African animal trypanosomiases: advantages, limitations and new improvement ways

Les trypanosomiases animales d’origine africaine représentent typiquement une maladie tropicale négligée. Elles sont causées par des parasites sanguicoles du genre Trypanosoma transmis par des insectes hématophages, de manière cyclique par les mouches tsé-tsé pour Trypanosoma congolense, T. vivax et T. brucei brucei, qui causent la nagana, de manière mécanique pour T. evansi, agent de la surra, et enfin par transmission sexuelle pour T. equiperdum, qui cause la dourine. La nagana est présente dans 38 pays d’Afrique subsaharienne où elle peut affecter de nombreuses espèces animales, sauvages et domestiques. Près de 55 millions de bovins vivent sous risque trypanosomien, sans compter les petits ruminants. Ces maladies détériorent la condition physique de l’animal, induisant une forte baisse de productivité. Dans les cas les plus sévères, et en l’absence de traitement, la mort survient en quelques semaines. L’impact socio-économique est estimé à 4,75 milliards de dollars de pertes annuelles, ce qui fait de ces maladies l’un des obstacles majeurs au développement de l’élevage en Afrique. Le contrôle de ces maladies se heurte à l’absence de vaccin, à des traitements dont les molécules sont peu nombreuses et contre lesquelles se développent de plus en plus de résistances de la part des parasites, et enfin à un diagnostic, moléculaire ou sérologique, dont la robustesse demande à être grandement améliorée. Les signes cliniques ne sont pas spécifiques, le diagnostic parasitologique est souvent peu sensible, et les méthodes moléculaires ne sont pas applicables sur le terrain. Les méthodes d’immunodiagnostic sous forme de tests de diagnostic rapide sont les seules adaptées au terrain, mais les rares tests existants sont très peu accessibles (disponibilité, prix), et manquent de spécificité et/ou de sensibilité. Ici, nous traiterons des limites et des avantages comparatifs des méthodes actuelles de diagnostic et proposerons de nouvelles pistes d’amélioration de ces dernières pour un meilleur contrôle de la maladie.The animal trypanosomiases of African origin are a rather typical example of a neglected tropical disease. They are caused by blood parasites of the Trypanosoma genus transmitted by haematophagous insects, cyclically by tsetse flies for Trypanosoma congolense, T. vivax and T. brucei brucei, which cause nagana, mechanically by T. evansi, the agent of surra, and finally by T. equiperdum, adapted to sexual transmission, which causes dourine. Nagana affects 38 African countries in the sub-Saharan region with 55 million cattle at risk, not counting small ruminants. These diseases deteriorate the animal’s physical condition, leading to a sharp drop in productivity; in the most severe cases, and in the absence of treatment, the animal dies within a few weeks. The socio-economic impact is estimated at US$ 4.75 billion in annual losses, making these diseases one of the major obstacles to livestock development in Africa. The control of these diseases is hampered by the lack of vaccines, a handful of molecules for treatment against which parasites are increasingly developing resistance, and finally, molecular or serological diagnostics whose robustness needs to be greatly improved. Clinical signs are not specific, parasitological diagnosis is often not very sensitive, and molecular methods are not applicable in the field. Immunodiagnostic methods in the form of rapid diagnostic tests are the only ones suitable for the field, but the few existing tests are poorly available and lack specificity and/or sensitivity. Here we address the advantages and limitations of current diagnostic methods and propose new ways of improving them for better disease control

Les méthodes de diagnostic des trypanosomiases animales africaines : avantages, limites et nouvelles pistes d’amélioration

International audienceThe animal trypanosomiases of African origin are a rather typical example of a neglected tropical disease. They are caused by blood parasites of the Trypanosoma genus transmitted by haematophagous insects, cyclically by tsetse flies for Trypanosoma congolense, T. vivax and T. brucei brucei, which cause nagana, mechanically by T. evansi, the agent of surra, and finally by T. equiperdum, adapted to sexual transmission, which causes dourine. Nagana affects 38 African countries in the sub-Saharan region with 55 million cattle at risk, not counting small ruminants. These diseases deteriorate the animal’s physical condition, leading to a sharp drop in productivity; in the most severe cases, and in the absence of treatment, the animal dies within a few weeks. The socio-economic impact is estimated at US$ 4.75 billion in annual losses, making these diseases one of the major obstacles to livestock development in Africa. The control of these diseases is hampered by the lack of vaccines, a handful of molecules for treatment against which parasites are increasingly developing resistance, and finally, molecular or serological diagnostics whose robustness needs to be greatly improved. Clinical signs are not specific, parasitological diagnosis is often not very sensitive, and molecular methods are not applicable in the field. Immunodiagnostic methods in the form of rapid diagnostic tests are the only ones suitable for the field, but the few existing tests are poorly available and lack specificity and/or sensitivity. Here we address the advantages and limitations of current diagnostic methods and propose new ways of improving them for better disease control.Les trypanosomiases animales d’origine africaine représentent typiquement une maladie tropicale négligée. Elles sont causées par des parasites sanguicoles du genre Trypanosoma transmis par des insectes hématophages, de manière cyclique par les mouches tsé-tsé pour Trypanosoma congolense, T. vivax et T. brucei brucei, qui causent la nagana, de manière mécanique pour T. evansi, agent de la surra, et enfin par transmission sexuelle pour T. equiperdum, qui cause la dourine. La nagana est présente dans 38 pays d’Afrique subsaharienne où elle peut affecter de nombreuses espèces animales, sauvages et domestiques. Près de 55 millions de bovins vivent sous risque trypanosomien, sans compter les petits ruminants. Ces maladies détériorent la condition physique de l’animal, induisant une forte baisse de productivité. Dans les cas les plus sévères, et en l’absence de traitement, la mort survient en quelques semaines. L’impact socio-économique est estimé à 4,75 milliards de dollars de pertes annuelles, ce qui fait de ces maladies l’un des obstacles majeurs au développement de l’élevage en Afrique. Le contrôle de ces maladies se heurte à l’absence de vaccin, à des traitements dont les molécules sont peu nombreuses et contre lesquelles se développent de plus en plus de résistances de la part des parasites, et enfin à un diagnostic, moléculaire ou sérologique, dont la robustesse demande à être grandement améliorée. Les signes cliniques ne sont pas spécifiques, le diagnostic parasitologique est souvent peu sensible, et les méthodes moléculaires ne sont pas applicables sur le terrain. Les méthodes d’immunodiagnostic sous forme de tests de diagnostic rapide sont les seules adaptées au terrain, mais les rares tests existants sont très peu accessibles (disponibilité, prix), et manquent de spécificité et/ou de sensibilité. Ici, nous traiterons des limites et des avantages comparatifs des méthodes actuelles de diagnostic et proposerons de nouvelles pistes d’amélioration de ces dernières pour un meilleur contrôle de la maladie

Novel axonemal protein ZMYND12 interacts with TTC29 and DNAH1, and is required for male fertility and flagellum function

Male infertility is common and complex, presenting a wide range of heterogeneous phenotypes. Although about 50% of cases are estimated to have a genetic component, the underlying cause often remains undetermined. Here, from whole-exome sequencing on samples from 168 infertile men with asthenoteratozoospermia due to severe sperm flagellum, we identified homozygous ZMYND12 variants in four unrelated patients. In sperm cells from these individuals, immunofluorescence revealed altered localization of DNAH1, DNALI1, WDR66 and TTC29. Axonemal localization of ZMYND12 ortholog TbTAX-1 was confirmed using the Trypanosoma brucei model. RNAi knock-down of TbTAX-1 dramatically affected flagellar motility, with a phenotype similar to the sperm from men bearing homozygous ZMYND12 variants. Co-immunoprecipitation and ultrastructure expansion microscopy in T. brucei revealed TbTAX-1 to form a complex with TTC29. Comparative proteomics with samples from Trypanosoma and Ttc29 KO mice identified a third member of this complex: DNAH1. The data presented revealed that ZMYND12 is part of the same axonemal complex as TTC29 and DNAH1, which is critical for flagellum function and assembly in humans, and Trypanosoma. ZMYND12 is thus a new asthenoteratozoospermia-associated gene, bi-allelic variants of which cause severe flagellum malformations and primary male infertility