Oscillatory nucleocytoplasmic shuttling of the general stress response transcriptional activators Msn2 and Msn4 in Saccharomyces cerevisiae

Msn2 and Msn4 are two related transcriptional activators that mediate a general response to stress in yeast Saccharomyces cerevisiae by eliciting the expression of specific sets of genes. In response to stress or nutritional limitation, Msn2 and Msn4 migrate from the cytoplasm to the nucleus. Using GFP-tagged constructs and high-resolution time-lapse video microscopy on single cells, we show that light emitted by the microscope also triggers this migration. Unexpectedly, the population of Msn2 or Msn4 molecules shuttles repetitively into and out of the nucleus with a periodicity of a few minutes. A large heterogeneity in the oscillatory response to stress is observed between individual cells. This periodic behavior, which can be induced by various types of stress, at intermediate stress levels, is not dependent upon protein synthesis and persists when the DNA-binding domain of Msn2 is removed. The cAMP–PKA pathway controls the sensitivity of the oscillatory nucleocytoplasmic shuttling. In the absence of PKA, Msn4 continues to oscillate while Msn2 is maintained in the nucleus. We show that a computational model based on the possibility that Msn2 and Msn4 participate in autoregulatory loops controlling their subcellular localization can account for the oscillatory behavior of the two transcription factors

Modes de régulation des facteurs de transcription Msn2p et Msn4p en réponse aux stress chez la levure Saccharomyces cerevisiae

J'ai étudié au cours de ma thèse les mécanismes de traitement des signaux extracellulaires en utilisant un système modèle, la réponse générale aux stress chez Saccharomyces cerevisiae. J'ai plus particulièrement cherché à approfondir différents aspects de la dynamique de régulation de deux activateurs transcriptionnels, Msn2p et Msn4p, qui sont le point d'intégration de différents signaux de stress. Ces protéines sont la cible de régulations complexes alliant des changements de localisation subcellulaire et des événements de phosphorylation-déphosphorylation. J'ai recherché par deux approches systématiques in vitro et in vivo les protéines kinases impliquées, et leur rôle biologique dans la régulation de l'activité de Msn2p. J'ai découvert que Sch9p, une protéine kinase homologue des protéines Akt/PKB de mammifères, et Srb10p, une protéine kinase à cycline appartenant à la machinerie transcriptionnelle, sont impliquées. J'ai parallèlement mis en évidence que Msn2p est dégradé quand il est actif dans le noyau, et que cette dégradation fait intervenir Srb10p. Nous avons aussi observé des oscillations nucléocytoplasmiques des populations de Msn2p et Msn4p, dont les paramètres cinétiques varient en fonction des stress. Enfin, j'ai découvert que Msn2p est polyubiquitylé, et que cette ubiquitylation pourrait intervenir dans le contrôle de sa localisation subcellulaire et/ou de son ciblage vers la dégradation en réponse aux stress.In Saccharomyces cerevisiae, the Msn2p transcriptional activator constitutes a useful model to analyze multiple and complex regulations of signal-induced transcription factor activity. Together with its partially redundant homologue Msn4p, it is a central component of the general stress response system. These two zinc finger proteins control a large set of genes containing the cis-acting Stress Responsive Element in their promoter. Msn2p is activated in response to sharp transitions in the environment such as physico chemical stresses or changes in nutritional availability. It is negatively controlled by the cAMP-APK and the TOR pathways. These effects induce cytoplasmic to nucleus shuttling and covalent modifications such as dephosphorylation-phosphorylation. By an in vitro and in vivo systematic screening, I tried during my PhD to identify the protein kinase(s) involved in these phosphorylations, as well as their role in the control of Msn2p activity. I found that at least two protein kinases are involved : Sch9p, related to the Akt/PKB family, and Srb10p, a cyclin-dependent protein kinase component of the RNA polymerase II transcription machinery. Moreover, two new modes of regulation were discovered : a heat shock-induced nuclear degradation of Msn2p, which is enhanced when Msn2p is transcriptionally active and was shown to be a Srp10p-dependent process, and a fast and synchronous nucleocytoplamic oscillations of Msn2p and Msn4p, the kinetics of which are modified by stress response. We also identified another type of covalent modification, Msn2p polyubiquitination, which could control its subcellular localisation and/or degradation.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Ganoderma lucidum : le champignon d’immortalité, nouvel allié dans la lutte contre la douleur induite lors de traitements anticancéreux

International audienceSi la phytothérapie a depuis longtemps acquis ses lettres de noblesse, le champignon demeure le parent pauvre dans le domaine dessoins naturels. Cependant, certaines espèces de champignons dont le ganoderme luisant (Ganoderma lucidum) sont utilisées depuis desmillénaires en Chine et au Japon comme aliments de longue vie et de jeunesse prolongée. Aujourd'hui, la mycothérapie est en pleinemutation, passant d'une médecine empirique à une science basée sur des preuves d’efficacité.Dans ce contexte, un nombre croissant d'études sont publiées chaque année afin de légitimer et de comprendre leurs utilisationstraditionnelles mais également de leur trouver de nouvelles propriétés pharmacologiques

Direct Activation of Genes Involved in Intracellular Iron Use by the Yeast Iron-Responsive Transcription Factor Aft2 without Its Paralog Aft1

The yeast Saccharomyces cerevisiae contains a pair of paralogous iron-responsive transcription activators, Aft1 and Aft2. Aft1 activates the cell surface iron uptake systems in iron depletion, while the role of Aft2 remains poorly understood. This study compares the functions of Aft1 and Aft2 in regulating the transcription of genes involved in iron homeostasis, with reference to the presence/absence of the paralog. Cluster analysis of DNA microarray data identified the classes of genes regulated by Aft1 or Aft2, or both. Aft2 activates the transcription of genes involved in intracellular iron use in the absence of Aft1. Northern blot analyses, combined with chromatin immunoprecipitation experiments on selected genes from each class, demonstrated that Aft2 directly activates the genes SMF3 and MRS4 involved in mitochondrial and vacuolar iron homeostasis, while Aft1 does not. Computer analysis found different cis-regulatory elements for Aft1 and Aft2, and transcription analysis using variants of the FET3 promoter indicated that Aft1 is more specific for the canonical iron-responsive element TGCACCC than is Aft2. Finally, the absence of either Aft1 or Aft2 showed an iron-dependent increase in the amount of the remaining paralog. This may provide additional control of cellular iron homeostasis

AP-1 controls the trafficking of Notch and Sanpodo toward E-cadherin junctions in sensory organ precursors.

International audienceIn Drosophila melanogaster, external sensory organs develop from a single sensory organ precursor (SOP). The SOP divides asymmetrically to generate daughter cells, whose fates are governed by differential Notch activation. Here we show that the clathrin adaptor AP-1 complex, localized at the trans Golgi network and in recycling endosomes, acts as a negative regulator of Notch signaling. Inactivation of AP-1 causes ligand-dependent activation of Notch, leading to a fate transformation within sensory organs. Loss of AP-1 affects neither cell polarity nor the unequal segregation of the cell fate determinants Numb and Neuralized. Instead, it causes apical accumulation of the Notch activator Sanpodo and stabilization of both Sanpodo and Notch at the interface between SOP daughter cells, where DE-cadherin is localized. Endocytosis-recycling assays reveal that AP-1 acts in recycling endosomes to prevent internalized Spdo from recycling toward adherens junctions. Because AP-1 does not prevent endocytosis and recycling of the Notch ligand Delta, our data indicate that the DE-cadherin junctional domain may act as a launching pad through which endocytosed Notch ligand is trafficked for signaling

Spatiotemporal control of microtubule nucleation and assembly using magnetic nanoparticles.

International audienceDecisions on the fate of cells and their functions are dictated by the spatiotemporal dynamics of molecular signalling networks. However, techniques to examine the dynamics of these intracellular processes remain limited. Here, we show that magnetic nanoparticles conjugated with key regulatory proteins can artificially control, in time and space, the Ran/RCC1 signalling pathway that regulates the cell cytoskeleton. In the presence of a magnetic field, RanGTP proteins conjugated to superparamagnetic nanoparticles can induce microtubule fibres to assemble into asymmetric arrays of polarized fibres in Xenopus laevis egg extracts. The orientation of the fibres is dictated by the direction of the magnetic force. When we locally concentrated nanoparticles conjugated with the upstream guanine nucleotide exchange factor RCC1, the assembly of microtubule fibres could be induced over a greater range of distances than RanGTP particles. The method shows how bioactive nanoparticles can be used to engineer signalling networks and spatial self-organization inside a cell environment

Fortifier la ville à la fin du Moyen-Age : l'accrue St Aignan : Loiret, Orléans, La Motte Sanguin, lot 3 nord : rapport de fouille.

La fouille de la Motte Sanguin à Orléans s'est déroulée préalablement à la construction d'un hôtel-résidence de tourisme et d'un parking souterrain sous-jacent. L'opération est située à l'angle sud-est du cœur de ville d'Orléans, à cent mètres environ du lit actuel de la Loire et à flanc de coteaux. Elle fait suite au diagnostic de S. Jesset (avril 2005) qui a notamment mis au jour les vestiges du système défensif construit à la fin du XVe s. et modernisé au début du XVIe s. Les vestiges de l'Antiquité sont très peu présents dans l'emprise ouverte à la fouille. Ceci est la conséquence directe des bouleversements importants qu'à subi le secteur avec la construction des fortifications médiévales et modernes. On notera tout d'abord des travaux de nivellements assez conséquents. Le substrat a été mis à nu avant d'être remblayé sur plus d'un mètre d'épaisseur par des apports de grave calcaire dans l'objectif d'une mise en terrasses du flanc du coteau, dans la première moitié du Ier s. Quelques indices tendraient à voir dans les niveaux d'occupations préservé-avec toutes les réserves qui s'imposent - un espace extérieur. La présence d'un habitat est cependant fortement soupçonnée. Quelques vestiges antérieurs à l'établissement du système défensif sont présents au nord-est de la zone. II s'agit d'une série de fosses ou creusements à la taille imposante, que la rareté de mobilier céramique ne permet pas de dater avec précision. La plus importante est assimilée à une carrière de marne calcaire. Les vestiges du système défensif construit au XVe s. ont été mis au jour. II s'agit d'une part d'un tronçon de courtine, entre les tours de l'Etoile au nord et de la Brebis au sud, ainsi que du fossé attenant. Dans la première moitié du XVIe s, un ensemble de modifications et d'améliorations sont apportées au système défensif. En premier lieu, une terrasse d'artillerie ou fausse braie est construite au pied de la courtine. En parallèle, le fossé est recreusé. C'est probablement à ce programme architectural qu'il faut rattacher la construction du fort de la Brebis, localisé plus au sud à l'extérieur de l'emprise de fouille. Enfin, c'est au même moment qu'est édifiée intra-muros et à l'emplacement d'anciennes habitations, la fameuse « motte », cavalier constitué des terres issues de l'élargissement du fossé. C'est donc l'ensemble du système défensif qui est revu à cette occasion. Ces travaux sont rendu nécessaires par l'archaïsme de l'enceinte à une époque ou l'adaptation des fortifications à l'artillerie s'est largement répandue. Après les deux sièges qu'a subi la ville lors des guerres de religion en 1562 et 1567, les fortifications perdent rapidement leur utilité et sont en partie détruites à la fin du XVIIIe s. C'est donc sur un vaste terrain démilitarisé qu'est transférée dans les années 1790-1793 une manufacture de coton située jusque-là en ville et dont certains vestiges ont été mis au jour. Enfin, c'est à une minoterie attestée par les sources au milieu du XIXe s. que doit être rattachée une construction dégagée à l'est de la fouille, présentant une mise en œuvre singulière. Après 1860, les terrains sont un temps la propriété des hospices d'Orléans avant qu'une école d'artillerie n'y soit installée en 1874

AP-1 and clathrin are essential for secretory granule biogenesis in Drosophila.

International audienceRegulated secretion of hormones, digestive enzymes, and other biologically active molecules requires the formation of secretory granules. Clathrin and the clathrin adaptor protein complex 1 (AP-1) are necessary for maturation of exocrine, endocrine, and neuroendocrine secretory granules. However, the initial steps of secretory granule biogenesis are only minimally understood. Powerful genetic approaches available in the fruit fly Drosophila melanogaster were used to investigate the molecular pathway for biogenesis of the mucin-containing "glue granules" that form within epithelial cells of the third-instar larval salivary gland. Clathrin and AP-1 colocalize at the trans-Golgi network (TGN) and clathrin recruitment requires AP-1. Furthermore, clathrin and AP-1 colocalize with secretory cargo at the TGN and on immature granules. Finally, loss of clathrin or AP-1 leads to a profound block in secretory granule formation. These findings establish a novel role for AP-1- and clathrin-dependent trafficking in the biogenesis of mucin-containing secretory granules