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Armierung von NK-Zellen mit den PSCA-spezifischen chimÀren Antigenrezeptoren NKp46-αPSCA und NKp46-KiBAP-αPSCA
Bei den konventionellen Krebstherapien kommt es hĂ€ufig zu einer Wiederkehr des Tumors, da meist einzelne Tumorzellen und abgesiedelte Metastasen im Körper verbleiben. Vor diesem Hintergrund hat die Entwicklung neuer Behandlungsmethoden, die spezifisch die Tumorzellen erkennen und eliminieren und zudem gesunde Körperzellen schonen, eine groĂe Bedeutung in der heutigen Krebsforschung. Eine erfolgsversprechende Strategie ist die Generierung von tumorspezifischen, zytotoxischen Immuneffektorzellen, zum Beispiel T-Lymphozyten und NatĂŒrlichen Killerzellen, durch die genetische Modifikation mit einem chimĂ€ren Antigenrezeptor (CAR). Dabei gibt es bereits weitreichende Studien mit T-Lymphozyten, so dass sich nun das Forschungsinteresse immer mehr auf die NK-Zellen richtet. Im Gegensatz zu CAR-armierten T-Lymphozyten sind sie in der Lage ihr antitumorales Potenzial nicht nur gegen Antigen-positive sondern auch MHC-Klasse I-negative Tumorzellen zu richten. Mögliche Zielstrukturen der CAR sind tumorassoziierte Antigene, wie das Prostata-spezifische Stammzellantigen (PSCA). Es wird auf ĂŒber 94 % der humanen primĂ€ren Prostatakarzinome und deren Knochenmetastasen verstĂ€rkt exprimiert, jedoch kaum auf Normalgewebe. PSCA ist somit ideal fĂŒr eine Immuntherapie geeignet. Die bisher in Studien verwendeten CAR-armierten NK-Zellen wiesen eine feststehende SpezifitĂ€t gegenĂŒber einem bestimmten Tumorantigen auf. Allerdings ist die Expression von Tumorantigenen innerhalb des Tumors sehr heterogen oder wird durch Tumorevasionsmechanismen herunterreguliert. Dies begrenzt die ReaktivitĂ€t CAR-armierter NK-Zellen. Durch die Generierung eines CAR, dessen SpezifitĂ€t gegenĂŒber einem Tumorantigen ausgetauscht werden kann, wĂ€re der universelle Einsatz CAR-armierter NK-Zellen in der adjuvanten Immuntherapie von Tumorerkrankungen möglich.
Im Hauptteil dieser Arbeit wurden die permanente NK-Zelllinie YTS und primĂ€re humane NK-Zellen mittels lentiviralen Gentransfers mit einem PSCA-spezifischen CAR, bestehend aus dem gegen PSCA gerichteten Einzelkettenantikörper αPSCA und dem aktivierenden NK-Zellrezeptor NKp46, armiert. Die generierten NK-Zellen wiesen eine ĂŒber lĂ€ngere ZeitrĂ€ume stabile OberflĂ€chenexpression des CAR αPSCA-NKp46 auf. Die Kreuzvernetzung des CAR mit seinem Antigen fĂŒhrte zunĂ€chst zu keiner selektiven Immunantwort der CAR-armierten YTS und primĂ€ren NK-Zellen gegenĂŒber histogenetisch verschiedenen, PSCA-exprimierenden Tumorzelllinien. Erst nach gleichzeitiger Ăberexpression des mit NKp46 assoziierten SignaladaptermolekĂŒls CD3-ζ wurde eine Aktivierung der Effektorfunktionen der YTS NK-Zellen induziert. Dies zeigte sich zum einen in der Expression von CD107a als Degranulationsmarker sowie der Freisetzung des inflammatorischen Zytokins IFN-Îł. Zum anderen wiesen die CAR-armierten und CD3-ζ-exprimierenden YTS NK-Zellen eine spezifische ZytotoxizitĂ€t gegenĂŒber MHC-Klasse I- und PSCA-exprimierenden Tumorzellen auf. Im anschlieĂenden Teil der Arbeit wurde ein modular aufgebauter CAR generiert, bei dem der Einzelkettenantikörper und folglich die SpezifitĂ€t gegenĂŒber Tumorantigenen austauschbar ist. Dazu wurden YTS NK-Zellen durch lentiviralen Gentransfer mit dem biotinylierbaren NKp46-NK-Zellrezeptor NKp46-KiBAP modifiziert, der ĂŒber mehrere Monate stabil auf der OberflĂ€che exprimiert wurde. Die exogene als auch endogene Biotinylierung des Rezeptors wurde mittels einer Biotinproteinligase demonstriert. Unter Ausnutzung der sehr starken Biotin-Avidin-Bindung wurde die Assoziation mit einem Einzelkettenantikörper nachgewiesen. DafĂŒr wurde exemplarisch der gegen PSCA gerichtete, biotinylierbare Einzelkettenantikörper αPSCA-BAP verwendet.
Diese Arbeit zeigt, dass eine spezifische Erkennung und effiziente Lyse von PSCA-exprimierenden Tumorzellen durch die generierten CAR-armierten NK-Zellen erfolgte, wobei zum ersten Mal NKp46 als Bestandteil eines CAR verwendet wurde. Zudem wurde ein modular aufgebauter CAR generiert, dessen SpezifitĂ€t gegenĂŒber Tumorantigenen austauschbar ist. Diese neuartige Strategie ermöglicht erstmalig eine flexible Armierung von NK-Zellen und stellt damit einen wesentlichen Vorteil bei der Behandlung verschiedener Krebserkrankungen dar
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Targeted delivery of TLR3 agonist to tumor cells with single chain antibody fragment-conjugated nanoparticles induces type I-interferon response and apoptosis
Application of Toll-like receptor (TLR) agonists is a promising approach to treat cancer. In particular, nucleic acid-based TLR agonists such as short ssRNA and dsRNA molecules, which activate endosomal TLRs, can be delivered to tumors by use of nanoparticle delivery systems. However, such delivery systems bear unspecific side effects and poor pharmacokinetics. To overcome these limitations we developed a system for targeted delivery of a 50 bp dsRNA TLR3 agonist (Riboxxol) to treat PSCA-positive tumor cells, which consists of neutravidin conjugated to mono-biotinylated dsRNA and to humanized mono-biotinylated anti-PSCA single chain antibody derivative scFv(h-AM1)-BAP. The assembly of the components resulted in the formation of nanoparticle-like immunoconjugates designated Rapid Inducer of Cellular Inflammation and Apoptosis (RICIA). Anti-PSCA-RICIA exclusively delivered Riboxxol to PSCA-positive tumor cells as well as subcutaneous tumors. Uptake of anti-PSCA-RICIA induced a type I-interferon response and apoptosis in HEK-Blue hTLR3/PSCA reporter cells and PSCA-positive HT1376 bladder cancer cells in vitro. No such effects were observed when using RICIA coupled to an unspecific control antibody or when using Riboxxol alone. Treatment of HT1376 xenografts in immune-deficient hosts with targeted delivery of TLR3 agonist did not induce adverse effects and only modestly inhibited tumor growth when compared to controls. These results suggest promising activation of innate immune response and apoptosis upon selective delivery of TLR3 agonists in tumor cells. Yet, further studies using syngeneic and orthotopic tumor models are needed to fully exploit the potential of RICIA immunoconjugates. © 2019, The Author(s)
Armierung von NK-Zellen mit den PSCA-spezifischen chimÀren Antigenrezeptoren NKp46-αPSCA und NKp46-KiBAP-αPSCA
Bei den konventionellen Krebstherapien kommt es hĂ€ufig zu einer Wiederkehr des Tumors, da meist einzelne Tumorzellen und abgesiedelte Metastasen im Körper verbleiben. Vor diesem Hintergrund hat die Entwicklung neuer Behandlungsmethoden, die spezifisch die Tumorzellen erkennen und eliminieren und zudem gesunde Körperzellen schonen, eine groĂe Bedeutung in der heutigen Krebsforschung. Eine erfolgsversprechende Strategie ist die Generierung von tumorspezifischen, zytotoxischen Immuneffektorzellen, zum Beispiel T-Lymphozyten und NatĂŒrlichen Killerzellen, durch die genetische Modifikation mit einem chimĂ€ren Antigenrezeptor (CAR). Dabei gibt es bereits weitreichende Studien mit T-Lymphozyten, so dass sich nun das Forschungsinteresse immer mehr auf die NK-Zellen richtet. Im Gegensatz zu CAR-armierten T-Lymphozyten sind sie in der Lage ihr antitumorales Potenzial nicht nur gegen Antigen-positive sondern auch MHC-Klasse I-negative Tumorzellen zu richten. Mögliche Zielstrukturen der CAR sind tumorassoziierte Antigene, wie das Prostata-spezifische Stammzellantigen (PSCA). Es wird auf ĂŒber 94 % der humanen primĂ€ren Prostatakarzinome und deren Knochenmetastasen verstĂ€rkt exprimiert, jedoch kaum auf Normalgewebe. PSCA ist somit ideal fĂŒr eine Immuntherapie geeignet. Die bisher in Studien verwendeten CAR-armierten NK-Zellen wiesen eine feststehende SpezifitĂ€t gegenĂŒber einem bestimmten Tumorantigen auf. Allerdings ist die Expression von Tumorantigenen innerhalb des Tumors sehr heterogen oder wird durch Tumorevasionsmechanismen herunterreguliert. Dies begrenzt die ReaktivitĂ€t CAR-armierter NK-Zellen. Durch die Generierung eines CAR, dessen SpezifitĂ€t gegenĂŒber einem Tumorantigen ausgetauscht werden kann, wĂ€re der universelle Einsatz CAR-armierter NK-Zellen in der adjuvanten Immuntherapie von Tumorerkrankungen möglich.
Im Hauptteil dieser Arbeit wurden die permanente NK-Zelllinie YTS und primĂ€re humane NK-Zellen mittels lentiviralen Gentransfers mit einem PSCA-spezifischen CAR, bestehend aus dem gegen PSCA gerichteten Einzelkettenantikörper αPSCA und dem aktivierenden NK-Zellrezeptor NKp46, armiert. Die generierten NK-Zellen wiesen eine ĂŒber lĂ€ngere ZeitrĂ€ume stabile OberflĂ€chenexpression des CAR αPSCA-NKp46 auf. Die Kreuzvernetzung des CAR mit seinem Antigen fĂŒhrte zunĂ€chst zu keiner selektiven Immunantwort der CAR-armierten YTS und primĂ€ren NK-Zellen gegenĂŒber histogenetisch verschiedenen, PSCA-exprimierenden Tumorzelllinien. Erst nach gleichzeitiger Ăberexpression des mit NKp46 assoziierten SignaladaptermolekĂŒls CD3-ζ wurde eine Aktivierung der Effektorfunktionen der YTS NK-Zellen induziert. Dies zeigte sich zum einen in der Expression von CD107a als Degranulationsmarker sowie der Freisetzung des inflammatorischen Zytokins IFN-Îł. Zum anderen wiesen die CAR-armierten und CD3-ζ-exprimierenden YTS NK-Zellen eine spezifische ZytotoxizitĂ€t gegenĂŒber MHC-Klasse I- und PSCA-exprimierenden Tumorzellen auf. Im anschlieĂenden Teil der Arbeit wurde ein modular aufgebauter CAR generiert, bei dem der Einzelkettenantikörper und folglich die SpezifitĂ€t gegenĂŒber Tumorantigenen austauschbar ist. Dazu wurden YTS NK-Zellen durch lentiviralen Gentransfer mit dem biotinylierbaren NKp46-NK-Zellrezeptor NKp46-KiBAP modifiziert, der ĂŒber mehrere Monate stabil auf der OberflĂ€che exprimiert wurde. Die exogene als auch endogene Biotinylierung des Rezeptors wurde mittels einer Biotinproteinligase demonstriert. Unter Ausnutzung der sehr starken Biotin-Avidin-Bindung wurde die Assoziation mit einem Einzelkettenantikörper nachgewiesen. DafĂŒr wurde exemplarisch der gegen PSCA gerichtete, biotinylierbare Einzelkettenantikörper αPSCA-BAP verwendet.
Diese Arbeit zeigt, dass eine spezifische Erkennung und effiziente Lyse von PSCA-exprimierenden Tumorzellen durch die generierten CAR-armierten NK-Zellen erfolgte, wobei zum ersten Mal NKp46 als Bestandteil eines CAR verwendet wurde. Zudem wurde ein modular aufgebauter CAR generiert, dessen SpezifitĂ€t gegenĂŒber Tumorantigenen austauschbar ist. Diese neuartige Strategie ermöglicht erstmalig eine flexible Armierung von NK-Zellen und stellt damit einen wesentlichen Vorteil bei der Behandlung verschiedener Krebserkrankungen dar
Armierung von NK-Zellen mit den PSCA-spezifischen chimÀren Antigenrezeptoren NKp46-αPSCA und NKp46-KiBAP-αPSCA
Bei den konventionellen Krebstherapien kommt es hĂ€ufig zu einer Wiederkehr des Tumors, da meist einzelne Tumorzellen und abgesiedelte Metastasen im Körper verbleiben. Vor diesem Hintergrund hat die Entwicklung neuer Behandlungsmethoden, die spezifisch die Tumorzellen erkennen und eliminieren und zudem gesunde Körperzellen schonen, eine groĂe Bedeutung in der heutigen Krebsforschung. Eine erfolgsversprechende Strategie ist die Generierung von tumorspezifischen, zytotoxischen Immuneffektorzellen, zum Beispiel T-Lymphozyten und NatĂŒrlichen Killerzellen, durch die genetische Modifikation mit einem chimĂ€ren Antigenrezeptor (CAR). Dabei gibt es bereits weitreichende Studien mit T-Lymphozyten, so dass sich nun das Forschungsinteresse immer mehr auf die NK-Zellen richtet. Im Gegensatz zu CAR-armierten T-Lymphozyten sind sie in der Lage ihr antitumorales Potenzial nicht nur gegen Antigen-positive sondern auch MHC-Klasse I-negative Tumorzellen zu richten. Mögliche Zielstrukturen der CAR sind tumorassoziierte Antigene, wie das Prostata-spezifische Stammzellantigen (PSCA). Es wird auf ĂŒber 94 % der humanen primĂ€ren Prostatakarzinome und deren Knochenmetastasen verstĂ€rkt exprimiert, jedoch kaum auf Normalgewebe. PSCA ist somit ideal fĂŒr eine Immuntherapie geeignet. Die bisher in Studien verwendeten CAR-armierten NK-Zellen wiesen eine feststehende SpezifitĂ€t gegenĂŒber einem bestimmten Tumorantigen auf. Allerdings ist die Expression von Tumorantigenen innerhalb des Tumors sehr heterogen oder wird durch Tumorevasionsmechanismen herunterreguliert. Dies begrenzt die ReaktivitĂ€t CAR-armierter NK-Zellen. Durch die Generierung eines CAR, dessen SpezifitĂ€t gegenĂŒber einem Tumorantigen ausgetauscht werden kann, wĂ€re der universelle Einsatz CAR-armierter NK-Zellen in der adjuvanten Immuntherapie von Tumorerkrankungen möglich.
Im Hauptteil dieser Arbeit wurden die permanente NK-Zelllinie YTS und primĂ€re humane NK-Zellen mittels lentiviralen Gentransfers mit einem PSCA-spezifischen CAR, bestehend aus dem gegen PSCA gerichteten Einzelkettenantikörper αPSCA und dem aktivierenden NK-Zellrezeptor NKp46, armiert. Die generierten NK-Zellen wiesen eine ĂŒber lĂ€ngere ZeitrĂ€ume stabile OberflĂ€chenexpression des CAR αPSCA-NKp46 auf. Die Kreuzvernetzung des CAR mit seinem Antigen fĂŒhrte zunĂ€chst zu keiner selektiven Immunantwort der CAR-armierten YTS und primĂ€ren NK-Zellen gegenĂŒber histogenetisch verschiedenen, PSCA-exprimierenden Tumorzelllinien. Erst nach gleichzeitiger Ăberexpression des mit NKp46 assoziierten SignaladaptermolekĂŒls CD3-ζ wurde eine Aktivierung der Effektorfunktionen der YTS NK-Zellen induziert. Dies zeigte sich zum einen in der Expression von CD107a als Degranulationsmarker sowie der Freisetzung des inflammatorischen Zytokins IFN-Îł. Zum anderen wiesen die CAR-armierten und CD3-ζ-exprimierenden YTS NK-Zellen eine spezifische ZytotoxizitĂ€t gegenĂŒber MHC-Klasse I- und PSCA-exprimierenden Tumorzellen auf. Im anschlieĂenden Teil der Arbeit wurde ein modular aufgebauter CAR generiert, bei dem der Einzelkettenantikörper und folglich die SpezifitĂ€t gegenĂŒber Tumorantigenen austauschbar ist. Dazu wurden YTS NK-Zellen durch lentiviralen Gentransfer mit dem biotinylierbaren NKp46-NK-Zellrezeptor NKp46-KiBAP modifiziert, der ĂŒber mehrere Monate stabil auf der OberflĂ€che exprimiert wurde. Die exogene als auch endogene Biotinylierung des Rezeptors wurde mittels einer Biotinproteinligase demonstriert. Unter Ausnutzung der sehr starken Biotin-Avidin-Bindung wurde die Assoziation mit einem Einzelkettenantikörper nachgewiesen. DafĂŒr wurde exemplarisch der gegen PSCA gerichtete, biotinylierbare Einzelkettenantikörper αPSCA-BAP verwendet.
Diese Arbeit zeigt, dass eine spezifische Erkennung und effiziente Lyse von PSCA-exprimierenden Tumorzellen durch die generierten CAR-armierten NK-Zellen erfolgte, wobei zum ersten Mal NKp46 als Bestandteil eines CAR verwendet wurde. Zudem wurde ein modular aufgebauter CAR generiert, dessen SpezifitĂ€t gegenĂŒber Tumorantigenen austauschbar ist. Diese neuartige Strategie ermöglicht erstmalig eine flexible Armierung von NK-Zellen und stellt damit einen wesentlichen Vorteil bei der Behandlung verschiedener Krebserkrankungen dar
Chromosomal instability induced by increased BIRC5/Survivin levels affects tumorigenicity of glioma cells
Abstract Background Survivin, belonging to the inhibitor of apoptosis (IAP) gene family, is abundantly expressed in tumors. It has been hypothesized that Survivin facilitates carcinogenesis by inhibition of apoptosis resulting in improved survival of tumorigenic progeny. Additionally, Survivin plays an essential role during mitosis. Together with its molecular partners Aurora B, Borealin and inner centromere protein it secures bipolar chromosome segregation. However, whether increased Survivin levels contribute to progression of tumors by inducing chromosomal instability remains unclear. Methods We overexpressed Survivin in U251-MG, SVGp12, U87-MG, HCT116 and p53-deficient U87-MGshp53 and HCT116p53â/â cells. The resulting phenotype was investigated by FACS-assisted cell cycle analysis, Western Blot analysis, confocal laser scan microscopy, proliferation assays, spectral karyotyping and in a U251-MG xenograft model using immune-deficient mice. Results Overexpression of Survivin affected cells with knockdown of p53, cells harboring mutant p53 and SV40 large T antigen, respectively, resulting in the increase of cell fractions harboring 4n and >4n DNA contents. Increased ÎłH2AX levels, indicative of DNA damage were monitored in all Survivin-transduced cell lines, but only in p53 wild type cells this was accompanied by an attenuated S-phase entry and activation of p21waf/cip. Overexpression of Survivin caused a DNA damage response characterized by increased appearance pDNA-PKcs foci in cell nuclei and elevated levels of pATM S1981 and pCHK2 T68. Additionally, evolving structural chromosomal aberrations in U251-MG cells transduced with Survivin indicated a DNA-repair by non-homologous end joining recombination. Subcutaneous transplantation of U251-MG cells overexpressing Survivin and mycN instead of mycN oncogene alone generated tumors with shortened latency and decreased apoptosis. Subsequent SKY-analysis of Survivin/mycN-tumors revealed an increase in structural chromosomal aberrations in cells when compared to mycN-tumors. Conclusions Our data suggest that increased Survivin levels promote adaptive evolution of tumors through combining induction of genetic heterogeneity with inhibition of apoptosis
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Multivalent Protein-Loaded pH-Stable Polymersomes: First Step toward Protein Targeted Therapeutics
Synthetic platforms for mimicking artificial organelles or for designing multivalent protein therapeutics for targeting cell surface, extracellular matrix, and tissues are in the focus of this study. Furthermore, the availability of a multi-functionalized and stimuli-responsive carrier system is required that can be used for sequential in situ and/or post loading of different proteins combined with post-functionalization steps. Until now, polymersomes exhibit excellent key characteristics to fulfill those requirements, which allow specific transport of proteins and the integration of proteins in different locations of polymeric vesicles. Herein, different approaches to fabricate multivalent protein-loaded, pH-responsive, and pH-stable polymersomes are shown, where a combination of therapeutic action and targeting can be achieved, by first choosing two model proteins such as human serum albumin and avidin. Validation of the molecular parameters of the multivalent biohybrids is performed by dynamic light scattering, cryo-TEM, fluorescence spectroscopy, and asymmetrical flow-field flow fractionation combined with light scattering techniques. To demonstrate targeting functions of protein-loaded polymersomes, avidin post-functionalized polymersomes are used for the molecular recognition of biotinylated cell surface receptors. These versatile protein-loaded polymersomes present new opportunities for designing sophisticated biomolecular nanoobjects in the field of (extracellular matrix) protein therapeutics
NKG2C+ NK Cells for Immunotherapy of Glioblastoma Multiforme
In glioblastoma, non-classical human leucocyte antigen E (HLA-E) and HLA-G are frequently overexpressed. HLA-E loaded with peptides derived from HLA class I and from HLA-G contributes to inhibition of natural killer (NK) cells with expression of the inhibitory receptor CD94/NKG2A. We investigated whether NK cells expressing the activating CD94/NKG2C receptor counterpart were able to exert anti-glioma effects. NKG2C+ subsets were preferentially expanded by a feeder cell line engineered to express an artificial disulfide-stabilized trimeric HLA-E ligand (HLA-E*spG). NK cells expanded by a feeder cell line, which facilitates outgrowth of conventional NKG2A+, and fresh NK cells, were included for comparison. Expansion via the HLA-E*spG feeder cells selectively increased the fraction of NKG2C+ NK cells, which displayed a higher frequency of KIR2DL2/L3/S2 and CD16 when compared to expanded NKG2A+ NK cells. NKG2C+ NK cells exhibited increased cytotoxicity against K562 and KIR:HLA-matched and -mismatched primary glioblastoma multiforme (GBM) cells when compared to NKG2A+ NK cells and corresponding fresh NK cells. Cytotoxic responses of NKG2C+ NK cells were even more pronounced when utilizing target cells engineered with HLA-E*spG. These findings support the notion that NKG2C+ NK cells have potential therapeutic value for treating gliomas
Targeted RNAi of BIRC5/Survivin Using Antibody-Conjugated Poly(Propylene Imine)-Based Polyplexes Inhibits Growth of PSCA-Positive Tumors
Delivery of siRNAs for the treatment of tumors critically depends on the development of efficient nucleic acid carrier systems. The complexation of dendritic polymers (dendrimers) results in nanoparticles, called dendriplexes, that protect siRNA from degradation and mediate non-specific cellular uptake of siRNA. However, large siRNA doses are required for in vivo use due to accumulation of the nanoparticles in sinks such as the lung, liver, and spleen. This suggests the exploration of targeted nanoparticles for enhancing tumor cell specificity and achieving higher siRNA levels in tumors. In this work, we report on the targeted delivery of a therapeutic siRNA specific for BIRC5/Survivin in vitro and in vivo to tumor cells expressing the surface marker prostate stem cell antigen (PSCA). For this, polyplexes consisting of single-chain antibody fragments specific for PSCA conjugated to siRNA/maltose-modified poly(propylene imine) dendriplexes were used. These polyplexes were endocytosed by PSCA-positive 293TPSCA/ffLuc and PC3PSCA cells and caused knockdown of reporter gene firefly luciferase and Survivin expression, respectively. In a therapeutic study in PC3PSCA xenograft-bearing mice, significant anti-tumor effects were observed upon systemic administration of the targeted polyplexes. This indicates superior anti-tumor efficacy when employing targeted delivery of Survivin-specific siRNA, based on the additive effects of siRNA-mediated Survivin knockdown in combination with scFv-mediated PSCA inhibition