Molecular surveillance of Listeria monocytogenes in Germany to control transmission along food supply chains and to prevent human listeriosis cases

Human listeriosis is a comparatively rare but serious infectious disease. The high hospitalisation and mortality rate make it a major public health concern worldwide. Elderly and immunocompromised people as well as pregnant women are at increased risk of infection. Listeriosis is caused by consumption of food contaminated with the bacterium Listeria (L.) monocytogenes. Listeria monocytogenes is widespread in the environment and in animals. It enters the food chain either via contaminated raw animal or plant products or via cross-contamination during food processing. The overall aim of the present dissertation was to prevent cases of listeriosis in humans using state-of-the-art molecular epidemiological methods and genetic profiling of bacterial isolates. As a support to classical epidemiology, molecular typing methods are used to monitor the entry and spread of L. monocytogenes along the food chain up to the consumer. In recent years, the possibility of whole genome sequencing (WGS) has revolutionised the molecular typing of bacterial isolates. Based on the knowledge gained in the present doctoral project, the previous gold standard for fine typing, pulsed-field electrophoresis, was completely replaced by WGS in the National Reference Laboratory (NRL) for L. monocytogenes in 2018. As part of the present project, the value of WGS as a high-resolution molecular surveillance tool for L. monocytogenes has been widely communicated to stakeholders along the food chain. Based on the protocols established in the NRL during the doctoral project, the tool is now available to the national monitoring authorities. Within the dissertation project, the bioinformatic analysis of WGS data of L. monocytogenes was optimised for data exchange, a listeriosis outbreak and the spread of Listeria spp. in a food processing plant were investigated, and the significance of the European Rapid Alert System for Food and Feed (RASFF) for foodborne outbreaks was evaluated. Using WGS, contamination and infection chains can be traced with unprecedented precision and thus be stopped. However, the methods for analysing WGS data are diverse and not yet fully harmonised, which hinders data sharing. In the present work, it was shown that different WGS analysis methods for L. monocytogenes generate largely comparable results. A translation code developed within this doctoral project allows information on clusters to be exchanged between sectors (e.g. food safety, public health) and countries even without harmonised methods. This approach offers a major advantage as it allows rapid communication between stakeholders, especially in time-critical situations such as listeriosis outbreaks. An important prerequisite for the prevention of listeriosis infections is a stronger focus on industrial hygiene in food processing. This became clear in the example of a study of a poultry processing chain carried out as part of this doctoral project. By means of WGS typing, it could be shown that Listeria spp. are transferred from the animal and from the environment to the finished food product. In addition, bacteria were shown to spread to surfaces in the production environment, favouring dangerous cross-contamination. Since the introduction of WGS for typing L. monocytogenes in Germany, in cross-sectoral collaboration, a large number of listeriosis outbreaks could be clarified and stopped. This work provides insight into a large national listeriosis outbreak lasting several years, which was lead investigated in the present doctoral project. Using WGS typing, the outbreak was traced back to ready-to-eat meat products and their producer. By using forward checking as a supplement to the usual backtracking in outbreak investigations, two different clusters of listeriosis cases could be assigned to the same producer. Only through such a two-sided control strategy, combining backtracking and forward checking, can listeriosis outbreaks be significantly minimised in the future. As a result of the intensive sampling at the producer, a very diverse L. monocytogenes population was found, with some strains persisting for several years. Listeria monocytogenes was found especially in niches of the food processing environment, difficult to reach for cleaning and disinfection. This study pointed to weaknesses in industrial hygiene that resulted in the production of contaminated food and thus triggered the listeriosis outbreak. If L. monocytogenes is found in a food product, the European RASFF enables international communication of this risk and, for example, immediate product recalls. In this way, it makes an essential contribution to protecting consumers from foodborne infections. An analysis of the RASFF notifications concerning L. monocytogenes as part of this doctoral project highlighted the complexity of international processing and distribution channels. This underlines how important international cooperation is with regard to food safety. The fact that individual producers were involved in many RASFF notifications in different years again showed the influence of inadequate industrial hygiene and persistence on the spread of L. monocytogenes. In addition, the results of the study highlighted the need for food processing companies to take greater responsibility for their own operations. The success of the WGS-based surveillance strategy for L. monocytogenes, which was established as part of this doctoral project and continuously optimised over its course, was already evident during the project term. For the first time, the number of reported cases of listeriosis in Germany no longer increased in 2018, but decreased, and continued to decrease in 2019. The dissertation project has thus made a decisive contribution to controlling the spread of L. monocytogenes along the food chain and thus reducing the number of listeriosis cases in Germany.Die humane Listeriose ist eine vergleichsweise seltene, aber schwerwiegende Infektionserkrankung. Die hohe Hospitalisierungs- und Sterblichkeitsrate machen sie weltweit zu einem großen Problem für die öffentliche Gesundheit. Ältere, Schwangere und Immungeschwächte haben ein erhöhtes Infektionsrisiko. Verursacht wird die Listeriose durch den Verzehr von Lebensmitteln, die mit dem Bakterium Listeria (L.) monocytogenes kontaminiert sind. Listeria monocytogenes ist weit verbreitet in der Umwelt und Tierwelt. In die Lebensmittelkette gelangt es entweder über kontaminierte rohe tierische oder pflanzliche Produkte oder über Kreuzkontaminationen während der Verarbeitung von Lebensmitteln. Das übergeordnete Ziel der vorliegenden Arbeit war es, mittels modernster molekularepidemiologischer Methoden und genetischem Profiling von Bakterienisolaten Listeriosefälle beim Menschen zu verhindern. Neben der klassischen Epidemiologie werden molekulare Typisierungsmethoden angewendet, um den Eintrag und die Verbreitung von L. monocytogenes entlang der Lebensmittelkette bis hin zum Verbraucher aufzudecken. In den letzten Jahren wurde die molekulare Typisierung durch die Möglichkeit zur Gesamtgenomsequenzierung (WGS, whole genome sequencing) bakterieller Isolate revolutioniert. Anhand der in der vorliegenden Promotionsarbeit gewonnenen Erkenntnisse konnte der bisherige Goldstandard zur Feintypisierung, die Pulsed-Field-Gelektrophorese, im Nationalen Referenzlabor (NRL) für L. monocytogenes in 2018 komplett durch die WGS abgelöst werden. Der Wert der WGS als hochauflösendes, molekulares Überwachungstool für L. monocytogenes wurde im Rahmen des Promotionsprojekts umfassend an die Stakeholder entlang der Lebensmittelkette kommuniziert. Auf der Basis der im Zuge des Promotionsprojekts im NRL etablierten Protokolle steht das Tool den nationalen Überwachungsbehörden nun zur Verfügung. Innerhalb des Promotionsvorhabens wurde die bioinformatische Analyse von WGS-Daten von L. monocytogenes für den Datenaustausch optimiert, beispielhaft ein Listerioseausbruch und die Verbreitung von Listeria spp. in einem lebensmittelverarbeitenden Betrieb untersucht, sowie die Bedeutung des europäischen Schnellwarnsystems für lebensmittelbedingte Krankheitsausbrüche evaluiert. Mittels WGS lassen sich Kontaminations- und Infektionsketten mit beispielloser Genauigkeit nachvollziehen und so unterbrechen. Die Verfahren zur Analyse von WGS-Daten sind jedoch vielfältig und noch nicht umfassend harmonisiert, was den Datenaustausch erschwert. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass mit verschiedenen WGS-Analysemethoden für L. monocytogenes größtenteils vergleichbare Ergebnisse generiert werden können. Ein innerhalb der Promotionsarbeit entwickelter Übersetzungscode ermöglicht es, Informationen zu Clustern auch ohne harmonisierte Methoden zwischen Sektoren (z.B. Lebensmittelsicherheit, Öffentliches Gesundheitswesen) und Ländern auszutauschen. Dieses Vorgehen bietet einen großen Vorteil, indem es gerade in zeitkritischen Situationen wie Listerioseausbrüchen eine schnelle Kommunikation zwischen den Stakeholdern erlaubt. Eine wichtige Voraussetzung, um Listerioseinfektionen zu verhindern, ist ein stärkerer Fokus auf die Betriebshygiene in der Lebensmittelverarbeitung. Deutlich wurde dies am Beispiel einer im Rahmen der Promotionsarbeit durchgeführten Studie einer Geflügelverarbeitungskette. Mittels WGS-Typisierung konnte gezeigt werden, dass Listeria spp. vom Tier und aus der Umwelt bis in das fertige Lebensmittelprodukt übertragen werden. Zusätzlich zeigte sich eine Ausbreitung auf Oberflächen in der Produktionsumgebung, wodurch gefährliche Kreuzkontaminationen begünstigt werden. Seit der Einführung der WGS für die Typisierung von L. monocytogenes in Deutschland konnte in sektorübergreifender Zusammenarbeit eine Vielzahl von Listerioseausbrüchen aufgeklärt und beendet werden. Die vorliegende Arbeit gibt Einblick in einen großen, über mehrere Jahre anhaltenden, nationalen Listeriseausbruch, der im Rahmen des Promotionsvorhabens federführend untersucht wurde. Mittels WGS-Typisierung konnte der Ausbruch auf verzehrfertige Fleischprodukte und deren Herstellerbetrieb zurückverfolgt werden. Durch eine vorwärts gerichtete Überprüfung (forward checking) als Ergänzung zu der in Ausbruchsuntersuchungen üblichen Rückverfolgung (backtracking), konnten zwei verschiedene Cluster von Listeriosefällen demselben Betrieb zugeordnet werden. Nur durch solch eine zweiseitige Kontrollstrategie, bei der backtracking und forward checking kombiniert werden, können Listerioseausbrüche in Zukunft wesentlich minimiert werden. Als Resultat der intensiven Beprobung des Herstellerbetriebs zeigte sich eine sehr diverse L. monocytogenes-Population mit teils über mehrere Jahre persistierenden Stämmen. Listeria monocytogenes wurde insbesondere in für Reinigung und Desinfektion schwer zu erreichenden Nischen gefunden. Diese Studie deutete auf Schwachpunkte in der Betriebshygiene hin, die die Produktion kontaminierter Lebensmittel nach sich zogen und so Auslöser des Listerioseausbruchs waren. Wird L. monocytogenes in einem Lebensmittel gefunden, ermöglicht das europäische Schnellwarnsystem für Lebensmittel und Futtermittel (RASFF, Rapid Alert System for Food and Feed) eine internationale Kommunikation dieses Risikos und beispielsweise umgehende Produktrückrufe. Auf diese Weise trägt es essenziell dazu bei, Verbraucher vor lebensmittelbedingten Infektionen zu schützen. Die Analyse von RASFF-Meldungen bezüglich L. monocytogenes im Rahmen der vorliegenden Arbeit verdeutlichte die Komplexität internationaler Verarbeitungs- und Vertriebswege. Dies unterstreicht, wie wichtig auch die internationale Zusammenarbeit im Hinblick auf die Lebensmittelsicherheit ist. Die Tatsache, dass einzelne lebensmittelverarbeitende Betriebe in zahlreiche RASFF-Meldungen in unterschiedlichen Jahren involviert waren, zeigte erneut den Einfluss unzureichender Betriebshygiene und Persistenz auf die Ausbreitung von L. monocytogenes. Zudem verdeutlichten die Studienergebnisse den Bedarf einer stärkeren Eigenverantwortung lebensmittelverarbeitender Betriebe. Schon während der Laufzeit zeigte sich der Erfolg der im Rahmen des Promotionsprojekts etablierten und im Projektverlauf stetig optimierten WGS-basierten Überwachungsstrategie von L. monocytogenes. Die Zahl gemeldeter Listeriosefälle in Deutschland war in 2018 erstmals nicht mehr ansteigend, sondern rückläufig, und sank in 2019 weiter. Das Promotionsvorhaben hat damit entscheidend dazu beigetragen, die Ausbreitung von L. monocytogenes entlang der Nahrungskette zu kontrollieren und so die Zahl der Listerioseerkrankungen in Deutschland zu reduzieren

Translatability of WGS typing results can simplify data exchange for surveillance and control of Listeria monocytogenes

Where classical epidemiology has proven to be inadequate for surveillance and control of foodborne pathogens, molecular epidemiology, using genomic typing methods, can add value. However, the analysis of whole genome sequencing (WGS) data varies widely and is not yet fully harmonised. We used genomic data on 494 Listeria monocytogenes isolates from readyto- eat food products and food processing environments deposited in the strain collection of the German National Reference Laboratory to compare various procedures for WGS data analysis and to evaluate compatibility of results. Two different core genome multilocus sequence typing (cgMLST) schemes, different reference genomes in single nucleotide polymorphism (SNP) analysis and commercial as well as opensource software were compared. Correlation of allele distances from the different cgMLST approaches was high, ranging from 0.97 to 1, and unified thresholds yielded higher clustering concordance than schemespecific thresholds. The number of detected SNP differences could be increased up to a factor of 3.9 using a specific reference genome compared with a general one. Additionally, specific reference genomes improved comparability of SNP analysis results obtained using different software tools. The use of a closed or a draft specific reference genome did not make a difference. The harmonisation of WGS data analysis will finally guarantee seamless data exchange, but, in the meantime, knowledge on threshold values that lead to comparable clustering of isolates by different methods may improve communication between laboratories. We therefore established a translation code between commonly applied cgMLST and SNP methods based on optimised clustering concordances. This code can work as a first filter to identify WGS- based typing matches resulting from different methods, which opens up a new perspective for data exchange and thereby accelerates timecritical analyses, such as in outbreak investigations

Distribution and Characteristics of Listeria spp. in Pigs and Pork Production Chains in Germany

Listeria (L.) monocytogenes is a foodborne pathogen that can cause disease, mainly in elderly, pregnant or immunocompromised persons through consumption of contaminated food, including pork products. It is widespread in the environment and can also be found in asymptomatic carrier animals, for example, in different tissues of pigs. To learn more about their nature, 16 Listeria spp. isolates found in tonsils and intestinal content of pigs and 13 isolates from the slaughterhouse environment were characterized using next-generation sequencing (NGS). A wide distribution of clonal complexes was observed in pigs, as well as in the pork production chain, suggesting multiple sources of entry. Hypervirulent clones were found in pig tonsils, showing the potential risk of pigs as source of isolates causing human disease. The presence of closely related isolates along the production chain suggests a cross-contamination in the slaughterhouse or recontamination from the same source, strengthening the importance of efficient cleaning and disinfection procedures. The phenotypical antimicrobial resistance status of L. monocytogenes isolates was examined via broth microdilution and revealed a low resistance level. Nevertheless, genotypical resistance data suggested multiple resistances in some non-pathogenic L. innocua isolates from pig samples, which might pose a risk of spreading resistances to pathogenic species

Contamination Pathways can Be Traced along the Poultry Processing Chain by Whole Genome Sequencing of Listeria innocua

Foodborne infection with Listeria causes potentially life-threatening disease listeriosis. Listeria monocytogenes is widely recognized as the only species of public health concern, and the closely related species Listeria innocua is commonly used by the food industry as an indicator to identify environmental conditions that allow for presence, growth, and persistence of Listeria spp. in general. In our study, we analyze the occurrence of Listeria spp. in a farm-to-fork approach in a poultry production chain in Egypt and identify bacterial entry gates and transmission systems. Prevalence of Listeria innocua at the three production stages (farm, slaughterhouse, food products) ranged from 11% to 28%. The pathogenic species Listeria monocytogenes was not detected, and Listeria innocua strains under study did not show genetic virulence determinants. However, the close genetic relatedness of Listeria innocua isolates (maximum 63 SNP differences) indicated cross-contamination between all stages from farm to final food product. Based on these results, chicken can be seen as a natural source of Listeria. Last but not least, sanitary measures during production should be reassessed to prevent bacterial contamination from entering the food chain and to consequently prevent human listeriosis infections. For this purpose, surveillance must not be restricted to pathogenic species

Listeriose-Ausbrüche in Deutschland – Hinweise auf geräucherte oder gebeizte Lachsprodukte als Ursache von Infektionen, Fortschreibung des Berichts aus 2021

Listeriose, verursacht durch das Bakterium Listeria (L.) monocytogenes, tritt in verschiedenen Formen auf und wird vor allem durch Konsum kontaminierter Lebensmittel übertragen. Die Krankheit ist mit teilweise schweren Verläufen und einer hohen Sterblichkeit assoziiert. Im Epidemiologischen Bulletin 3/2021 wurde ein Artikel zu 22 Listeriose-Ausbrüchen in Deutschland mit Hinweisen auf geräucherte oder gebeizte Lachsprodukte als Ursache von Infektionen publiziert. Im vorliegenden Bericht wird nun ein Update zur aktuellen Situation gegeben: Es konnten insgesamt 24 bundeslandübergreifende Listeriose-Ausbrüche mit Hinweisen auf geräucherte oder gebeizte Lachsprodukte als Ursache seit 2010 identifiziert werden. Dies sind zwei Ausbrüche mehr als im vorherigen Bericht. In den Jahren 2021 und 2022 gab es 66 Listeriose-Fälle in 15 Ausbrüchen. Die Daten bestätigen, dass geräucherte oder gebeizte Lachsprodukte in Deutschland weiterhin ein relevantes Risiko für Listeriose darstellen. Zudem ist insgesamt bei allen Listeriose-Ausbrüchen mit einer starken Untererfassung zu rechnen. Es ist deshalb davon auszugehen, dass die Erkrankungszahlen in der Bevölkerung in Deutschland deutlich höher sind.Peer Reviewe

Impact of wet-lab protocols on quality of whole-genome short-read sequences from foodborne microbial pathogens

For successful elucidation of a food-borne infection chain, the availability of high-quality sequencing data from suspected microbial contaminants is a prerequisite. Commonly, those investigations are a joint effort undertaken by different laboratories and institutes. To analyze the extent of variability introduced by differing wet-lab procedures on the quality of the sequence data we conducted an interlaboratory study, involving four bacterial pathogens, which account for the majority of food-related bacterial infections: Campylobacter spp., Shiga toxin-producing Escherichia coli, Listeria monocytogenes, and Salmonella enterica. The participants, ranging from German federal research institutes, federal state laboratories to universities and companies, were asked to follow their routine in-house protocols for short-read sequencing of 10 cultures and one isolated bacterial DNA per species. Sequence and assembly quality were then analyzed centrally. Variations within isolate samples were detected with SNP and cgMLST calling. Overall, we found that the quality of Illumina raw sequence data was high with little overall variability, with one exception, attributed to a specific library preparation kit. The variability of Ion Torrent data was higher, independent of the investigated species. For cgMLST and SNP analysis results, we found that technological sequencing artefacts could be reduced by the use of filters, and that SNP analysis was more suited than cgMLST to compare data of different contributors. Regarding the four species, a minority of Campylobacter isolate data showed the in comparison highest divergence with regard to sequence type and cgMLST analysis. We additionally compared the assembler SPAdes and SKESA for their performance on the Illumina data sets of the different species and library preparation methods and found overall similar assembly quality metrics and cgMLST statistics

Large Nationwide Outbreak of Invasive Listeriosis Associated with Blood Sausage, Germany, 2018–2019

International audienceInvasive listeriosis is a severe foodborne infection in humans and is difficult to control. Listeriosis incidence is increasing worldwide, but some countries have implemented molecular surveillance programs to improve recognition and management of listeriosis outbreaks. In Germany, routine whole-genome sequencing, core genome multilocus sequence typing, and single nucleotide polymorphism calling are used for subtyping of Listeria monocytogenes isolates from listeriosis cases and suspected foods. During 2018-2019, an unusually large cluster of L. monocytogenes isolates was identified, including 134 highly clonal, benzalkonium-resistant sequence type 6 isolates collected from 112 notified listeriosis cases. The outbreak was one of the largest reported in Europe during the past 25 years. Epidemiologic investigations identified blood sausage contaminated with L. monocytogenes highly related to clinical isolates; withdrawal of the product from the market ended the outbreak. We describe how epidemiologic investigations and complementary molecular typing of food isolates helped identify the outbreak vehicle