A single tRNA base pair mediates bacterial tRNA-dependent biosynthesis of asparagine

In many prokaryotes and in organelles asparagine and glutamine are formed by a tRNA-dependent amidotransferase (AdT) that catalyzes amidation of aspartate and glutamate, respectively, mischarged on tRNA(Asn) and tRNA(Gln). These pathways supply the deficiency of the organism in asparaginyl- and glutaminyl-tRNA synthtetases and provide the translational machinery with Asn-tRNA(Asn) and Gln-tRNA(Gln). So far, nothing is known about the structural elements that confer to tRNA the role of a specific cofactor in the formation of the cognate amino acid. We show herein, using aspartylated tRNA(Asn) and tRNA(Asp) variants, that amidation of Asp acylating tRNA(Asn) is promoted by the base pair U(1)–A(72) whereas the G(1)–C(72) pair and presence of the supernumerary nucleotide U(20A) in the D-loop of tRNA(Asp) prevent amidation. We predict, based on comparison of tRNA(Gln) and tRNA(Glu) sequence alignments from bacteria using the AdT-dependent pathway to form Gln-tRNA(Gln), that the same combination of nucleotides also rules specific tRNA-dependent formation of Gln. In contrast, we show that the tRNA-dependent conversion of Asp into Asn by archaeal AdT is mainly mediated by nucleotides G(46) and U(47) of the variable region. In the light of these results we propose that bacterial and archaeal AdTs use kingdom-specific signals to catalyze the tRNA-dependent formations of Asn and Gln

Genomic and functional analysis of unconventional aminoacylation systems in pathogens

Τhe term “unconventional (or unusual) aminoacylation systems” describes biosynthetic pathways that involve aminoacyl-tRNAs as essential factors, not only during protein synthesis but also in alternative processes (tRNA-dependent). During recent years, many functional genomic studies have demonstrated the unconventional role of aminoacyl-tRNAs outside protein synthesis and their participation in many different but equally essential biochemical pathways. In the first part, the present dissertation deals with the study and biochemical characterization of the role of tRNA molecules during the tRNAdependent conversion of aspartate to asparagine in the pathogen Neisseria meningitides. This pathway is catalyzed by the tRNA-dependent amidotransferase AdT). This biosynthetic pathway is present in all pathogens with known genome plays a dual role. It supplies the necessary Asn-tRNAAsn substrates for the incorporation of asparagine into nascent polypeptides, but it also plays critical role the biosynthesis of asparagine, in the organisms that lack the appropriate biosynthetic enzymes for this specific amino acid. It was found that the crucial determinant elements for recognition by bacterial amidotransferases constitute by first base-pair U1-A72 of tRNAAsn and the length and the sequence of the variable loop for the archaeal enzymes. In addition, an extra nucleotide in the Dloop of tRNAAsp is the anti-determinant element that prevents the interaction with amidotransferases. In the second part, the present dissertation deals with the study and elucidation of the tRNA-dependent synthesis of the cell wall in the pathogen Staphylococcus aureus. The peptidoglycan moiety in this specific pathogen is stabilized through characteristic pentaglycine interpeptide bridges, which are synthesized independent of ribosomal activity. As donors of glycine this pathway utilizes Gly-tRNAGly molecules. However, until today it was not known, how many which tRNAGly molecules are actually encoded, expressed and involved in this exo-ribosomal pathway of peptide synthesis. In the present dissertation was determined the exact number of genes encoding for tRNAGly isoacceptors that are expressed. In addition, biochemical studies lead to the characterization of specific tRNAGly isoacceptors as proteinogenic (those partipating solely into ribosomal protein synthesis, 2 molecules P1 and P2) and as non-proteinogenic (those devoted exo-ribosomal bacterial cell wall synthesis, 3 molecules NP1, NP2 and NEW). The study of both unconventional aminoacylation systems focuses on the essential role of tRNA molecules not only as passive adaptors during the flow of the genetic information but as key-players in essential biochemical pathways that are now considered as novel molecular targets for specific inactivation for the majority of pathogensΩς ασυνήθη συστήματα αμινοακυλίωσης ορίζονται βιοσυνθετικά μονοπάτια τα οποία εμπλέκουν μόρια tRNA ως κεντρικούς παράγοντες, τόσο κατά τη διαδικασία της πρωτεϊνοσύνθεσης όσο και εκτός αυτής. Τα τελευταία χρόνια, λειτουργικές και γονιδιωματικές αναλύσεις έχουν δείξει ότι αμινοακυλιωμένα μόρια tRNA συμμετέχουν σε μία ποικιλία σημαντικών κυτταρικών διεργασιών πέραν της πρωτεϊνοσύνθεσης. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη παραγόντων που εμπλέκονται σε δύο ασυνήθη συστήματα αμινοκυλίωσης. Στο πρώτο σκέλος της διατριβής μελετήθηκε και χαρακτηρίστηκε βιοχημικά ο ρόλος των μορίων tRNA κατά την tRNA-εξαρτώμενη μετατροπή του ασπαραγινικού οξέος σε ασπαραγίνη στο παθογόνο βακτήριο Neisseria meningitidis, μία αντίδραση η οποία καταλύεται από την tRNA-εξαρτώμενη αμιδοτρανσφεράση (AdT). Η βιοσυνθετική αυτή πορεία, η οποία είναι παρούσα σε όλα τα παθογόνα βακτήρια των οποίων το γονιδίωμα είναι γνωστό, έχει διττό ρόλο. Παρέχει τα Asn-tRNAAsn υποστρώματα για την ενσωμάτωση ασπαριγίνης στις νεοσυντιθέμενες πρωτεΐνες των οργανισμών, ενώ παράλληλα παίζει σημαντικό ρόλο κατά τη βιοσύνθεση της ασπαραγίνης, όταν από τους οργανισμούς απουσιάζουν τα ένζυμα που ευθύνονται για τη βιοσύνθεση του συγκεκριμένου αμινοξέος. Βρέθηκε ότι το καθοριστικό στοιχείο αναγνώρισης του tRNAAsn από τις βακτηριακές αμιδοτρανσφεράσες είναι το πρώτο ζεύγος βάσεων U1- A72, ενώ για τα αντίστοιχα ένζυμα των αρχαίων είναι το μέγεθος και η αλληλουχία της μεταβλητής θηλιάς. Αντίστοιχα, το αντικαθοριστικό στοιχείο που παρεμποδίζει την αναγνώριση του tRNAAsp είναι το μέγεθος της θηλιάς D. Το δεύτερο ασύνηθες σύστημα αμινοακυλίωσης που μελετήθηκε ήταν η tRNA- εξαρτώμενη σύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος του παθογόνου Staphylococcus aureus. H πεπτιδογλυκάνη του κυτταρικού τοιχώματος στο συγκεριμένο παθογόνο σταθεροποιείται από χαρακτηριστικές γέφυρες πενταγλυκίνης οι οποίες συντίθενται εξω-ριβοσωμικά. Ως δότες γλυκίνης διαμεσολαβούν Gly-tRNAGly μόρια ο αριθμός και η ταυτότητα των οποίων ήταν μέχρι σήμερα άγνωστα. Στην παρούσα διατριβή διευκρινίστηκε ο αριθμός και ο ρόλος των ισοδεκτικών μορίων tRNAGly του S. aureus που υπάρχουν και εκφράζονται στο συγκεκριμένο παθογόνο. Βρέθηκε ότι 5 ισοδεκτικά μόρια κωδικοποιούνται και εκφράζονται στο συγκεκριμένο οργανισμό. Επιπρόσθετα, με βιοχημικές προσεγγίσεις έγινε εφικτός ο διαχωρισμός τους σε εκείνα που συμμετέχουν στην πρωτεΐνοσυνθετική μηχανή (πρωτεϊνογενετικά, 2 μόρια Ρ1 και Ρ2) και σε εκείνα που εμπλέκονται στη σύνθεση του βακτηριακού κυτταρικού τοιχώματος (μη-πρωτεϊνογενετικά, 3 μόρια ΝΡ1, ΝΡ2 και NEW). H παρούσα διατριβή εστιάσθηκε στο σημαντικό ρόλο των μορίων tRNA, όχι ως απλών προσαρμοστικών μορίων, αλλά ως σημαντικών παραγόντων σε βιοχημικές διεργασίες, οι οποίες σήμερα αναγνωρίζονται στην πλειοψηφία των παθογόνων, ως νέοι μοριακοί στόχοι για εξειδικευμένη απενεργοποίηση

Patient-reported needs predict perceived psychosocial disability and quality of life beyond symptom severity in schizophrenia

Purpose We examined whether patient-rated or clinician-rated needs are more strongly associated with perceived psychosocial disability (PPD) and subjective quality of life (SQOL) of schizophrenia patients, beyond symptom severity. Methods Hierarchical regression analyses were computed to test patient and clinician-rated unmet and met needs (estimated by eighty-two patient-clinician pairs) as predictors of PPD and SQOL above and beyond demographics and psychopathology. Needs, symptomatology, PPD and SQOL were estimated using Camberwell Assessment of Need (CAN), PANSS, WHODAS 2.0 and WHOQOL-BREF respectively. Results Needs were significantly associated with all WHODAS 2.0 and WHOQOL-BREF domains above and beyond demographics and PANSS variables. Clinician-rated needs were better predictors of only one WHODAS 2.0 domain, while patient-rated needs were better predictors of all other WHODAS 2.0 and WHOQOL-BREF domains. Patient-rated unmet needs were more strongly than met needs associated with the most WHODAS 2.0 and WHOQOL-BREF subscores. Conclusion This study offers the first evidence that patient-rated needs, especially unmet needs, are strongly associated, above and beyond symptomatology, with global and domain-specific PPD of schizophrenia patients. Accordingly, strong relations of patient-rated needs with SQOL emerged. Identifying and addressing patient-reported needs could facilitate PPD and SQOL improvement more effectively than interventions confined solely to symptom remission