In vitro pharmakologische Risikobewertung neuer therapeutischer Wirkstoffe gegen Osteoarthritis an osteochondralen Gewebekulturen - ein Risikoprofil von CCL25

Auf dem Gebiet der arthritischen Gelenkerkrankungen werden es derzeit zahlreiche neue the-rapeutische Stoffe wie z.B. BMP-2, FGF-18 sowie das Chemokin CCL25 zur Regeneration von Knorpelgewebe untersucht. Die unbekannten klinischen Nebenwirkungsprofile dieser Stoffe stellen jedoch für einen potenziellen Hersteller ein hohes wirtschaftliches Entwicklungsrisiko dar. Präklinische Optionen zur Risikostratifizierung neuer Therapeutika beschränken sich ent-weder auf wenig aussagekräftige Zellkulturmodelle oder auf logistisch immens kostspielige und ethisch fragwürdige Tierversuche. Daher besteht ein deutlicher Bedarf an aussagekräftigen präklinischen Modellen, die in großen Mengen und zu geringen Kosten hergestellt werden kön-nen, um Nebenwirkungen und Toxizität experimenteller therapeutischer Ansätze für Gelenker-krankungen zu bewerten. Ziel dieser Arbeit war es, ein solches Gelenkmodell zu etablieren und es anschließend auf mög-liche Nebenwirkungen von CCL25 auf das Gewebe zu untersuchen. Dafür wurde eine neuartige Methode zur Herstellung von osteochondralen Explantatkulturen aus nativem menschlichem Gelenksgewebe etabliert, die aus einer einzigen Gewebeprobe bis zu 100 Gewebekulturen gewinnen kann. Um in-vitro hergestellte Gewebe als potenzielles pharmakologisches Screening-Instrument einzubeziehen, wurden Osteoid-Gewebekulturen aus verschiedenen menschlichen Knochenzellen stereolithografisch 3D-gedruckt. Nach dem Vergleich beider Methoden auf ihre Anwendbarkeit, wurden die Explantmodelle 21 Tage lang mit verschiedenen Konzentrationen von CCL25 stimuliert und anschließend auf schädliche Auswirkungen untersucht. Weiterhin wurde das inflammatorische Potential von CCL25 in ei-nem sepparaten Versuchsaufbau mit menschliche Immunzellsubklassen analysiert. In der pharmakologischen Analyse von CCL25 an Gewebekulturen wurden keine direkten toxi-schen oder starke metabolische Einflüsse auf osteochondrales Gewebe festgestellt. Der CCL25-spezifische Rezeptor CCR9 konnte jedoch in der oberflächlichen Knorpelschicht nach-gewiesen werden und genetische Analysen zeigten proproliferative Einflüsse bei niedrigen Kon-zentrationen- und leicht katabole Einflüsse bei hohen CCL25-Konzentrationen. Die immunologische Untersuchung von CCL25 ergaben, dass CCL25 ab Konzentrationen von 50-100 nM ein immenses pro-inflammatorisches Potential besitzt und dies als wichtige Quelle von Nebenwirkungen im Rahmen einer therapeutischen Anwendung betrachtet werden muss. Zusammenfassend erwiesen sich die Dünnschnittkulturen als ein sehr geeignetes pharmakolo-gisches Screeninginstrument mit hoher Herstellungskapazität bei gleichzeitig langer Gewebe-stabilität. Die Untersuchung an CCL25 zeigten keine direkten Gewebetoxizität- oder Metabo-lismusalterationen, gleichwohl aber eine paradoxe Proliferationsstimulation und ein hohes inflammatorisches Potential, welches bei einer möglichen Translations dieses Wirkstoffes die absolute Notwendigkeit einer Dosierungskontrolle bei Applikation unterstreichtIn the field of arthritic joint diseases, numerous new therapeutic substances such as BMP-2, FGF-18 and the chemokine CCL25 are currently being investigated for the regeneration of carti-lage tissue. However, the unknown clinical side effect profiles of these compounds pose a high economic development risk for a potential manufacturer. Preclinical options for risk stratifica-tion of new therapeutics are limited to either poorly informative cell culture models or logistically immensely costly and ethically questionable animal studies. Therefore, there is a clear need for informative preclinical models that can be produced in large quantities and at low cost to evalu-ate side effects and toxicity of experimental therapeutic approaches for joint diseases. The goal of this work was to establish such a joint model and subsequently evaluate it for poten-tial side effects of CCL25 on tissue. For this purpose, a novel method for the preparation of osteochondral explant cultures from na-tive human joint tissue was established, which can obtain up to 100 tissue cultures from a single tissue sample. To include in vitro-produced tissues as a potential pharmacological screening tool, osteoid tissue cultures were 3D printed stereolithographically from various human bone cells. After comparing both methods for their applicability, the explant models were stimulated with different concentrations of CCL25 for 21 days and subsequently evaluated for adverse ef-fects. Furthermore, the inflammatory potential of CCL25 was analyzed in a separate experi-mental setup with human immune cell subclasses. In the pharmacological analysis of CCL25 on tissue cultures, no direct toxic or strong metabolic effects on osteochondral tissue were found. However, the CCL25-specific receptor CCR9 was detected in the superficial cartilage layer, and gene expression analyses showed pro-prolifera-tive influences at low concentrations and mild catabolic influences at high CCL25 concentra-tions. Immunological analysis of CCL25 revealed that CCL25 has immense pro-inflammatory potential from concentrations of 50-100 nM and this must be considered as an important source of side effects in the context of therapeutic application. In conclusion, the thin section cultures proved to be a very suitable pharmacological screening tool with high production capacity and long tissue stability at the same time. The investigation of CCL25 did not show any direct tissue toxicity or metabolism alterations, but nevertheless a par-adoxical proliferation stimulation and a high inflammatory potential, which underlines the abso-lute necessity of a dosage control during application in case of a possible translation of CCL25 as therapeutic agent