The role of CDKs in co-transcriptional splicing through phosphorylation of the RNA Pol II carboxy-terminal domain (CTD)

Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.O processo de transcrição, no qual uma molécula de ácido ribonucleico (ARN) é produzido a partir de uma cadeia de ácido desoxirribonucleico complementar a ela, é caracterizado por diversas etapas em que envolvem centenas de proteínas e outros fatores constituídos por RNA. Por esse processo os genes se expressam e assim constituem os componentes celulares e teciduais formadores do organismo, além de darem origem às enzimas, elementos envolvidos nas reações necessárias ao funcionamento dos seres vivos. Ao longo do processo transcricional, o transcrito enquanto é polimerizado também passa por processamentos, os quais modificam a sequência e a constituição do mesmo. Algumas dessas edições podem ocorrer após a transcrição ser finalizada, mas o acoplamento do processamento à transcrição traz vantagens como a diminuição do tempo requerido entre um estímulo parece iniciar a expressão de um gene e o produto final dessa expressão estar pronto e disponível para executar sua função. Nesse sentido, o Domínio carboxi-terminal (do inglês CTD) da ARN polimerase II (Pol II) faz o acoplamento entre o processamento do ARN e a transcrição. O CTD assemelha se a uma cauda que se alonga a partir da maior subunidade da Pol II que não só serve de suporte aos fatores envolvidos na transcrição como também ativamente os recruta devido às modificações pós translacionais aos quais são submetidos os aminoácidos que o constituem. Esse domínio é, na verdade, composto por várias repetições da sequência Tyr1-Ser2-Pro3-Thr4-Ser5-Pro6-Ser7. Sabe-se razoavelmente como esses aminoácidos e suas isoformas modificadas, geralmente fosforiladas, influenciam o processo transcricional e o processamento do ARN. No entanto, no que diz respeito ao splicing co-transcricional são poucas as informações a esse respeito. Foi reportado que a maquinaria envolvida no splicing parece estar ligada a Ser5 fosforilada quando Pol II foram imunoprecipitadas com o uso de anticorpos para essa serina e ligada as polimerases foram encontrados 5’ intermediários da primeira reação de transesterificação do splicing. Também foi reportado que em células de Drosophila, ao se fazer uso da técnica de NET-seq observou-se que a polimerase se encontrava a curta distância de onde uma região em que um intron havia sido excisado quando os investigadores fizeram uso de anti-Ser5P. Neste trabalho hipotetizamos que a Ser5 fosforilada contribui para a ocorrência de splicings ainda próximos a Pol II em elongamento. Para testar se de fato a isoforma fosforilada dessa serina desempenha esse papel, decidimos inibir as cinases responsáveis pela fosforilação das mesmas (Cinase Dependentes de Ciclinas, do inglês CDKs) a fim de averiguar se essa inibição causa uma mudança nas dinâmicas do splicing co-transcricional. Primeiramente, selecionamos inibidores farmacológicos desenvolvidos em células humanas para usarmos em células de Drosophila com o intuito de evitar a fosforilação da Ser5 do CTD. Infelizmente, nenhum dos inibidores foi capaz de impedir que a Ser5 fosse fosforilada. Provavelmente, a razão para tal foi a incapacidade dos inibidores de se ligarem ao sítio ativo das cinases. Apesar de tanto as CDKs humanas quanto as de Drosophila apresentarem considerável similaridade na sua sequência de aminoácidos, a pequena diferença de aminoácidos entre as CDKs deve ser suficiente para que os inibidores não consigam se ligar as de Drosophila. Apesar de não ser nosso objetivo, conseguimos prevenir a fosforilação específica da Ser2 em Drosophila quando da inibição da CDK12. Diante do postulado, resolvemos mudar a estratégia e escolhemos o método Auxin-Inducible Degron (AID) para depletar de forma rápida as CDKs. Com esse método adicionamos uma tag a proteína alvo, e quando for conveniente, aplicamos auxina ao meio de cultura para que a mesma possa induzir a proteína à ubiquitinação seguida da degradação da própria. Antes que isso possa ser realizado, é necessário introduzir a tag no local devido dentro do genoma de Drosophila. Para tanto, selecionamos um protocolo desenvolvido para adição de sequências na porção N-terminal de genes de Drosophila utilizando a ferramenta CRISPR/Cas9. Essa técnica faz uso da extensão sobreposta de primers para produzir um guia curto de 19 nucleotídeos com a sequência correspondente ao local onde se deve criar uma quebra dupla no ADN, e um constructo formado de braços de homologia que flanqueiam a AID tag para servir de molde para o reparo por recombinação homóloga (RH). Em nossa primeira tentativa, apesar de termos conseguido produzir os guias e os constructos de RH para todas as três cinases transcricionais que queremos depletar, CDK7, CDK9 e CDK12, não obtivemos sucesso ao transfectar nossas células. Nos constructos também está incluída uma sequência que promove resistência ao antibiótico Blasticidina e que deveria servir para selecionar apenas as células em que a tag havia sido corretamente inserida no genoma. No entanto, ainda que as células tivessem se mostrado resistentes ao antibiótico, ao analisarmos se houve de fato inserção dos construtos no genoma por PCR, percebemos que as tags não estavam presentes na porção N-terminal das CDKs. Esses resultados nos levam a crer que uma possível inserção dos constructos em locais não específicos dentro do genoma das Drosophilas permitiu que essas células apresentassem resistência. Em uma posterior segunda tentativa, e após termos mudados a linha celular usada (S2 ao invés de DMEL) e termos substituído o agente de transfecção por FuGENE® HD, conseguimos inserir a AID-tag na porção desejada da CDK9. Por não termos tido mais tempo para inserir a tag nas demais CDKs, não foi possível estimular a degradação das mesmas pela indução com auxina. A fim de que possamos utilizar o método Degron futuramente para depletar as CDKs, alguns aspectos do método precisam ser revistos e melhorados. Visto que as células apresentaram resistência ao antibiótico Blasticidina apesar de o constructo não ter sido inserido no local desejado, isso nos leva a crer que talvez tenha havido uma inserção em outro lugar do genoma devido a falha em impedir a ocorrência de união de extremidades não homólogas (NHEJ em inglês). Uma solução possível pode ser aumentar a concentração de lig4 e mus308. Entretanto, enquanto ainda estávamos tentando inibir ou depletar as cinases transcricionais, repetidamente preparamos livrarias obtidas a partir do procedimento de NET-seq. Com essa técnica é possível detectar o transcrito nascente ainda acoplado a Pol II e sequenciá-lo com alta resolução os nucleotídeos nele presentes. Os protocolos disponíveis sobre a versão dessa técnica que faz uso de anticorpos para diversos perfis de fosforilação do CTD foram descritos para células de mamíferos (mNET-seq) ou embriões de Drosophila (dNET-seq). Apesar de similar em alguns pontos, o protocolo usado para essa dissertação teve de ser adaptado para células de Drosophila em cultura (DMEL). Para tanto, fizemos ensaios para testar a melhor concentração e tempo de digestão da enzima MNase. Também testamos diferentes concentrações de anticorpo e avaliamos a quantidade de beads necessária para a imunoprecipitação de Pol II. Tínhamos predito para esse trabalho a partir do uso do NET-seq, perceber mudanças nas pausas típicas para a Pol II downstream da 3’ SS como também alterações nas dinâmicas de splicing ao impedir a fosforilação de Ser5. No entanto, apesar de termos focado em uma possível correlação entre a ser5P e splicing, a técnica de Degron combinada ao NET-seq pode vir a ser utilizada para estudar o envolvimento de diversos fatores e o comportamento do Pol II CTD durante outros processos co-transcricionais como corte e adição da cauda poli(A). Portanto, acreditamos que a junção dessas duas técnicas pode vir a ser bastante útil no descobrimento de relações ainda pouco exploradas no que diz respeito às modificações pós-traducionais do CTD e a formação e edição do transcrito nascente.Splicing represents an incredible mechanism for evolutionary novelty: the possibility of a single gene to be expressed in the form of multiple, diverse transcripts. However, splicing dysregulation can lead to several disorders by compromising the correct production of functional proteins. In order to address the challenges originated by mis-splicing and its consequences in human health, it would be most fitting to understand better the intricate dynamics in which splicing occurs. It is well known that splicing can be coupled to transcription by the RNA Polymerase II. More specifically, the Carboxy-Terminal Domain (CTD) of the largest Pol II subunit capable of extensive post-translational modifications, is implicated in the regulation of transcription as well as most pre-mRNA processing changes. Regarding co-transcriptional splicing, recent findings show an association of CTD Ser5 phosphorylation with spliceosome machinery and spliced reads near Pol II positioning in human and Drosophila melanogaster, respectively. However, it is still not understood the role of this modification in the regulation of this process. To test the hypothesis of Ser5 phosphorylation requirement for close proximity splicing occurrence, we decided to prevent this phosphorylation to occur by inhibiting the Cyclin-Dependent Kinases (CDKs), known to phosphorylate the heptad residues in the CTD, in our selected model system, Drosophila cells. First, we inhibited the CDKs by using pharmacological inhibitors, and once this attempt failed to prevent Ser5 phosphorylation, we decided to implement the Auxin-Inducible Degron (AID) system to efficiently deplete these kinases. For that, we had to adapt and improve a CRISPR/Cas9 method to integrate the AID-tags into endogenous CDKs genes by homologous recombination. We were able to design and generate the transfection PCR products for the transcriptional CDKs 7, 9 and 12. However, only the AID-tag for CDK9 was successfully inserted at the desired location at the Drosophila genome. In order to investigate the differences originated in co-transcriptional splicing by the absence of phosphorylation, we intended to use Native Elongating Transcript Sequencing (NET-seq) to analyze with nucleotide resolution nascent transcripts associated with elongating Pol II. For that, we had to adapt and optimize mNET-seq to Drosophila culture cells.Com o patrocínio do Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes (IMM-JLA)

Evaluating a Doppler Radar Monitor for Assessing Honey Bee Colony Health

Honey bees pollinate an estimated $15 billion worth of crops each year. It is therefore vital that beekeepers assess the productivity and health of colonies in order to reassure the reproductive future of this species. Modern techniques in which beekeepers can assess honey bee colony health are labor intensive, costly, and invasive to the bees as they must open and rearrange the hive to assess colony health. A radar-based sensor, placed outside of the hive, can be used to assess colony activity and health in a non-invasive manner. In order to validate the function of this hive monitor and quantify colony health several colonies were studied with three objectives: (i) Objective I looked to affirm that bee activity was a good predictor of colony health. The relationship between honey bee colony health and hive activity of eleven hives were observed over the course of a week and then assessed for health status by estimating brood (immatures) and adult population size (total frame area occupied per colony) (ii); Objective II looked at the activity indices derived from the radar output were correlated with counts of foraging bees determined through the use of a manual counter (bees/second), an optical sensor, counting the Doppler signature tracks in recorded radar data and weather conditions; and (iii) the activity indices (RMS) vs colony health were observed for five hives over the course of two weeks. Results were characterized by statistically significant correlations in all objectives. A model was constructed in Objective I that resulted in an r2 of 0.84. This model confirmed that the radar-derived activity index was a good measure of bee activity. It also showed that solar radiation was the best weather factor predicting bee activity. Objective II affirmed that bee activity was a good predictor of colony health with an r2 of 0.53. Objective III affirmed that radar-derived activity was a good predictor of colony health with an r2 of 0.56. This data provides evidence that the radar-based hive activity monitor is a viable tool for monitoring honey bee colony health

Modeling and forecasting the volatility of Brazilian asset returns

The goal of this paper is twofold. First, using five of the most actively traded stocks in the Brazilian financial market, this paper shows that the normality assumption commonly used in the risk management area to describe the distributions of returns standardized by volatilities is not compatible with volatilities estimated by EWMA or GARCH models. In sharp contrast, when the information contained in high frequency data is used to construct the realized volatility measures, we attain the normality of the standardized returns, giving promise of improvements in Value-at-Risk statistics. We also describe the distributions of volatilities of the Brazilian stocks, showing that they are nearly lognormal. Second, we estimate a simple model to the log of realized volatilities that differs from the ones in other studies. The main difference is that we do not find evidence of long memory. The estimated model is compared with commonly used alternatives in an out-of-sample forecasting experiment.

Vitreoretinal interface: current concepts

Assessment of the vitreoretinal interface has been greatly aided by the development of optical coherence tomography, in 1995. This imaging technology has allowed us to study involutional and disease processes that were previously unrecognizable by biomicroscopy and ultrasonography alone.This article will review these studies and illustrate the usefulness of optical coherence tomography in the evaluation of the vitreoretinal interface.Atualmente, uma avaliação mais apurada da interface vítreo-retiniana tem sido propiciada pela utilização da tomografia de coerência óptica, criada em 1995. Este tipo de imagem tecnológica tem possibilitado um melhor entendimento das alterações involucionais e patológicas que acometem a interface vítreo-retiniana. Os métodos semiológicos até então disponíveis (biomicroscopia, lentes fundoscópicas e ultrassonografia) eram limitados em suas resoluções e formulações de conceitos etiopatogênicos relacionados com modificações desta interface vítreo-retiniana. Este artigo faz breves considerações sobre tais métodos semiológicos e enfatiza a importância da tomografia de coerência óptica na avaliação da interface vítreo-retiniana.UNIFESPUNIFESP, EPM, São Paulo, BrazilSciEL

Schopenhauer and Luhmann: Some Unlikely Similarities?

The purpose of this paper is to compare similarities between Schopenhauer's conception of the world as Representation and Niklas Luhmann's notion of society as Communication. We explore the similarities between the way in which Schopenhauer constructs his speculations on the comprehension of reality, and how Luhmann describes what he considers contemporary society’s intelligibility. The analyses presented here do not deal with the discussion of the nature of the Will and its manifestations in the process of construction of reality, which constitutes a relevant part of Schopenhauer's thought. At the end of our exposition we infer some points of convergence in these authors’ explanatory models, although it is not possible to deduce, in a direct and categorical way, a theoretical affiliation between them. Keywords: Schopenhauer. Representation. Luhmann. Communication. Systems. DOI: 10.7176/RHSS/12-16-06 Publication date:August 31st 202

O Estado e o turismo no Brasil: análise das políticas públicas no contexto da pandemia da COVID-19

Pandemics mark periods of instability, disruptions, and complex changes in society. Today, the world is facing the pandemic of COVID-19, a disease caused by the new coronavirus. In all social dimensions, the impacts have been significant, mainly because of social isolation, a measure considered efficient to stop the spread of the disease. In Brazil, isolation was established by the government and culminated in the temporary closure of developments that provide non-essential services, in which tourism is contemplated. Therefore, the objective of this article is to discuss the role of the State in mitigating the impacts of the pandemic in the tourism sector, analyzing the public policies adopted and characteristics such as: political sphere, context, scope, content and criteria for effectiveness. It is an exploratory and descriptive research, whose methodological path consisted of searching for keywords on scientific platforms and government websites and sectorial tourism institutions, both in Brazil and worldwide. The information obtained was organized, systematized, and analyzed using the Content Analysis technique. The results show that the public policies formulated by the government are of a structural nature, with a focus on maintaining jobs and income for entrepreneurs and workers in specific segments of the production chain; conjunctural/emergency, therefore, restricted to the pandemic period; and regulatory, standardizing security and prevention protocols for COVID-19 during the economic recovery process. In general, the policies that most benefit the sector do not come from important portfolios for the activity, such as the Ministry of Tourism, but from other spheres of government.Las pandemias marcan períodos de inestabilidad, perturbaciones y cambios complejos en la sociedad. Hoy, el mundo se enfrenta a la pandemia de COVID-19, una enfermedad provocada por el nuevo coronavirus. En todas las dimensiones sociales, los impactos han sido significativos, principalmente por el aislamiento social, medida considerada eficiente para frenar la propagación de la enfermedad. En Brasil, el aislamiento fue establecido por el gobierno y culminó con el cierre temporal de desarrollos que brindan servicios no esenciales, en los que se contempla el turismo. Por tanto, el objetivo de este artículo es discutir el papel del Estado en la mitigación de los impactos de la pandemia en el sector turístico, analizando las políticas públicas adoptadas y características como: ámbito político, contexto, alcance, contenido y criterios de efectividad. Se trata de una investigación exploratoria y descriptiva, cuyo recorrido metodológico consistió en la búsqueda de palabras clave en plataformas científicas y sitios web gubernamentales e instituciones sectoriales de turismo, tanto en Brasil como en el mundo. La información obtenida fue organizada, sistematizada y analizada mediante la técnica de Análisis de Contenido. Los resultados muestran que las políticas públicas formuladas por el gobierno son de carácter estructural, con un enfoque en el mantenimiento de empleos e ingresos para empresarios y trabajadores en segmentos específicos de la cadena productiva; coyuntural/emergencia, por lo tanto, restringido al período pandémico; y protocolos regulatorios, estandarizando la seguridad y prevención de COVID-19 durante el proceso de recuperación económica. En general, las políticas que más benefician al sector no provienen de portafolios importantes para la actividad, como el Ministerio de Turismo, sino de otras esferas de gobierno.As pandemias marcam períodos de instabilidade, rupturas e mudanças complexas na sociedade. Hoje, o mundo enfrenta a pandemia da COVID-19, doença causada pelo novo coronavírus. Em todas as dimensões sociais, os impactos têm sido significativos, sobretudo, por causa do isolamento social, medida considerada eficiente para frear a disseminação da doença. No Brasil, o isolamento foi estabelecido pelo governo e culminou no fechamento temporário dos empreendimentos que prestam serviços não essenciais, no qual o turismo é contemplado. Logo, o objetivo deste artigo é discutir o papel do Estado na mitigação dos impactos da pandemia no setor turístico, analisando-se as políticas públicas adotadas e características como: esfera política, contexto, abrangência, conteúdo e critérios para efetivação. Trata-se de uma pesquisa exploratória e descritiva, cujo percurso metodológico consistiu na busca de palavras-chave em plataformas científicas e sites governamentais e de instituições setoriais de turismo, tanto no Brasil quanto no mundo. As informações obtidas foram organizadas, sistematizadas e analisadas empregando-se a técnica da Análise de Conteúdo. Os resultados mostram que as políticas públicas formuladas pelo governo são de caráter estrutural, com foco na manutenção de emprego e renda para empresários e trabalhadores de segmentos específicos da cadeia produtiva; conjuntural/emergencial, portanto, restritas ao período da pandemia; e regulatórias, normatizando protocolos de segurança e prevenção da COVID-19 durante o processo de retomada da economia. De modo geral, as políticas que mais beneficiam o setor não são oriundas de pastas importantes para a atividade, tal qual, o Ministério do Turismo, mas provenientes de outras esferas de atuação governamental

On the Complexity of the Median and Closest Permutation Problems

Genome rearrangements are events where large blocks of DNA exchange places during evolution. The analysis of these events is a promising tool for understanding evolutionary genomics, providing data for phylogenetic reconstruction based on genome rearrangement measures. Many pairwise rearrangement distances have been proposed, based on finding the minimum number of rearrangement events to transform one genome into the other, using some predefined operation. When more than two genomes are considered, we have the more challenging problem of rearrangement-based phylogeny reconstruction. Given a set of genomes and a distance notion, there are at least two natural ways to define the "target" genome. On the one hand, finding a genome that minimizes the sum of the distances from this to any other, called the median genome. Finding a genome that minimizes the maximum distance to any other, called the closest genome. Considering genomes as permutations, some distance metrics have been extensively studied. We investigate median and closest problems on permutations over the metrics: breakpoint, swap, block-interchange, short-block-move, and transposition. In biological matters some values are usually small, such as the solution value d or the number k of input permutations. For each of these metrics and parameters d or k, we analyze the closest and the median problems from the viewpoint of parameterized complexity. We obtain the following results: NP-hardness for finding the median/closest permutation for some metrics, even for k = 3; Polynomial kernels for the problems of finding the median permutation of all studied metrics, considering the target distance d as parameter; NP-hardness result for finding the closest permutation by short-block-moves; FPT algorithms and infeasibility of polynomial kernels for finding the closest permutation for some metrics parameterized by the target distance d

Morphological and Functional Aspects of Cytoskeleton of Trypanosomatids

Trypanosomatidae are protozoans that include monogenetic parasites, such as the Blastocrithidia and Herpetomonas genera, as well as digenetic parasites, such as the Trypanosoma and Leishmania genera. Their life cycles alternate between insect vectors and mammalian hosts. The parasite’s life cycle involves symmetrical division and different transitional developmental stages. In trypanosomatids, the cytoskeleton is composed of subpellicular microtubules organized in a highly ordered array of stable microtubules located beneath the plasma membrane, the paraflagellar rod, which is a lattice-like structure attached alongside the flagellar axoneme and a cytostome-cytopharynx. The complex life cycle, the extremely precise cytoskeletal organization and the single copy structures present in trypanosomatids provide interesting models for cell biology studies. The introduction of molecular biology, FIB/SEM (focused ion beam scanning electron microscopy) and electron microscopy tomography approaches and classical methods, such as negative staining, chemical fixation and ultrafast cryofixation have led to the determination of the three-dimensional (3D) structural organization of the cells. In this chapter, we highlight the recent findings on Trypanosomatidae cytoskeleton emphasizing their structural organization and the functional role of proteins involved in the biogenesis and duplication of cytoskeletal structures. The principal finding of this review is that all approaches listed above enhance our knowledge of trypanosomatids biology showing that cytoskeleton elements are essential to several important events throughout the protozoan life cycle

MODELO DE PLANEJAMENTO ESTRATÉGICO EM UNIVERSIDADES PÚBLICAS: Um estudo de caso na Universidade do Estado da Bahia.

O planejamento estratégico é uma ferramenta de gestão essencial para qualquer tipo de organização, seja pública ou privada. No entanto, o processo de planejamento, principalmente nas universidades, não é uma tarefa simples em função das características deste tipo de organização. Desta forma, este trabalho teve como objetivo identificar e analisar o modelo de formulação do processo de planejamento estratégico desenvolvido na Universidade do Estado da Bahia (UNEB). Utiliza-se a abordagem de pesquisa qualitativa através do uso da técnica de estudo de caso, no sentido de verificar, por meio de uma análise comparativa as atividades propostas e executadas na formulação do planejamento estratégico da Universidade do Estado da Bahia (UNEB), a partir dos parâmetros elencados na metodologia e sistematizados dos modelos de Planejamento Estratégico de Meyer Jr. (1988) e de Bryson (1995). Ficou demonstrado que embora a UNEB tenha empreendido esforços no processo de formulação do Planejamento Estratégico, faltaram ações mais efetivas e cuidados mais substanciais com todas as etapas do processo de planejamento, o que gerou impactos na legitimidade e no processo como um todo na Universidade