Exploring the nuclear roles of Argonaute proteins in HIV-1 expression

Lors de l'infection des lymphocytes T CD4+ par le Virus de l'Immunodéficience Humaine de type 1 (VIH-1), le provirus intégré dans le génome de la cellule hôte est activement transcrit en un ARN pré-messager (pré-ARNm). Celui-ci peut-être traduit en protéines, ou incorporé dans les nouvelles particules virales en tant qu'ARN génomique. Il peut aussi être épissé en plus d'une cinquantaine d'ARNm viraux qui seront traduits en protéines nécessaires à la réplication du virus. Dans certains cas, le provirus peut être intégré de façon silencieuse et constituer un réservoir viral insensible aux thérapies antivirales. Cependant, lors de l'arrêt des traitements ce provirus silencieux peut être réactivé. Comprendre les mécanismes impliqués dans le contrôle de l'expression du VIH-1 constitue donc un enjeu majeur. Ce contrôle peut se faire au niveau de la transcription, de l'épissage, de la stabilité ou de la traduction des ARNm viraux. Les protéines Argonaute (Ago), sont principalement connues pour être impliquées dans la régulation de l'expression des gènes via la voie d'interférence à ARN. Cette voie fait intervenir de petits ARN non codants, les microARN (miARN), qui sont maturés successivement par les protéines Drosha et Dicer. Dans le cytoplasme, les miARN sont ensuite pris en charge par une des quatre Ago humaines pour former le miRISC (miRNA Induced Silencing Complex) capable d'inhiber la traduction des ARNm cibles. Même si les mécanismes sont encore peu clairs, plusieurs études montrent également qu'Ago1 et Ago2 ont des rôles nucléaires, notamment dans la transcription et l'épissage des ARNm cellulaires. Le rôle des miARN dans la réplication du VIH-1 est sujet à controverse. Les travaux du laboratoire ont montré qu'Ago1 et Ago2 sont impliqués dans la production des ARN viraux multi-épissés et des particules virales infectieuses, mais indépendamment de la présence de miARN. L'objectif de ma thèse est de mieux caractériser les possibles rôles nucléaires des Ago sur l'expression du VIH-1. Ma thèse s'articule autour de deux axes : le premier est de déterminer l'implication de ces protéines dans l'expression du VIH-1 dans des modèles de cellules infectées de façon latente. En m'appuyant sur des techniques de cytométrie en flux et de qPCR, j'ai montré que la déplétion d'Ago1, comme celle de Drosha, entraine la réactivation du provirus latent, tandis que la déplétion d'Ago2 ou de Dicer n'a pas d'effet. La réactivation du provirus est corrélée à une augmentation des ARNm viraux mais n'affecte pas leur stabilité. Finalement, des expériences de capture des ARN naissants et d'immunoprécipitation de la chromatine suggèrent qu'Ago1 se lie à la chromatine et participe à la répression de la transcription du provirus intégré, indépendamment des miARN. Le second axe consiste à approfondir le rôle d'Ago1 et Ago2 dans la régulation de l'épissage des ARNm viraux. Dans ce but, j'ai participé à une étude permettant d'analyser la régulation du transcriptome viral par séquençage pleine longueur dans des lymphocytes T CD4+ infectés. En générant des lectures de plusieurs milliers de nucléotides de long, nous avons montré que cet essai permet d'identifier et de quantifier l'ensemble des transcrits viraux produits lors d'une infection, et de suivre la cascade des évènements d'épissage impliqués. Cet outil permettra de caractériser le rôle d'Ago1 et d'Ago2 sur l'ensemble du transcriptome viral dans des clones cellulaires invalidés pour l'expression de ces protéines. En conclusion, mes travaux de thèse permettent d'approfondir nos connaissances sur les fonctions nucléaires des Ago encore peu étudiées et sur les mécanismes de régulation de la transcription virale dans des modèles de latence.During infection of CD4+ T cells by the Human Immunodeficiency virus 1 (HIV-1), the provirus is integrated into the host cell genome and is actively transcribed into a pre-messenger RNA (pre-mRNA). This viral pre-mRNA is either translated into the Gag and Gag-Pol viral proteins or is encapsidated into new viral particles as genomic RNA. It can also undergo alternative splicing, generating more than fifty different transcripts needed for the translation of other viral proteins. In resting memory CD4+ T cells, the provirus can be silently integrated and constitute a viral reservoir insensitive to antiviral therapies. However, following treatment interruption, the transcription of the provirus can be reactivated, leading to a rapid viral rebound. It is thus of utmost importance to better understand the mechanisms involved in the control of HIV-1 expression. This control can occur at several stages including viral transcription, splicing, viral RNA degradation or translation. Argonaute (Ago) proteins are mainly known to be involved in the regulation of gene expression via the RNA interference pathway. This pathway involves small non-coding RNAs, the miRNAs, which are subsequently matured by two proteins Drosha and Dicer. In the cytoplasm, the miRNA is loaded into one of the four human Argonaute proteins to form the miRISC (miRNA Induced Silencing Complex), that inhibits the translation of the target mRNA. In addition, several studies have shown that Ago1 and Ago2 can be localized in the nucleus and be involved in nuclear function such as transcription and mRNA splicing. The involvement of the miRNA pathway in the control of HIV-1 expression is controversial. A former study of the laboratory has shown that Ago1 and Ago2 are involved in the production of multiply-spliced mRNAs and in the production of infectious viral particles, independently of the presence of mature miRNAs. The objective of my thesis is to further explore the possible role of nuclear Ago proteins on HIV-1 expression. My thesis is articulated around two axes: the first one is to assess the implication of Ago proteins in HIV-1 expression in latently infected cell models. Using a combination of cytometry and qPCR techniques, I showed that while the downregulation of Ago1 or Drosha expression led to the reactivation of latent provirus, Ago2 and Dicer knockdown had no effect. The reactivation of the provirus correlated with an increase of the viral mRNA but did not affect viral RNA stability. Finally, capture of newly synthetized viral RNA and chromatin immunoprecipitation experiments suggested that Ago1 bind to the chromatin and participates to the maintenance of inactive integrated provirus in latency models, independently of the presence of miRNA. The second objective of my thesis is to better understand the role of Ago1 and Ago2 in the regulation of viral RNAs splicing. To this end, I participated in a study to analyze the viral transcriptome regulation during CD4+ T cells infection by long-read sequencing. By generating reads of several thousand nucleotides in length, we showed that this assay allows to identify and quantify all the viral transcripts produced during an infection and to follow the cascade of splicing events involved. Using this sequencing assay, we plan to further characterize the role of Ago1 and Ago2 on the viral transcriptome. For this purpose, I generated cellular clones knockout for Ago1 and Ago2 using the Crispr/Cas9 technology. To conclude, my thesis work allows deepening our knowledge into both Ago nuclear functions that remain poorly characterized, and on the mechanisms involved in the regulation of viral transcription during latency

Rôles nucléaires des protéines Argonaute dans l'expression du VIH-1

During infection of CD4+ T cells by the Human Immunodeficiency virus 1 (HIV-1), the provirus is integrated into the host cell genome and is actively transcribed into a pre-messenger RNA (pre-mRNA). This viral pre-mRNA is either translated into the Gag and Gag-Pol viral proteins or is encapsidated into new viral particles as genomic RNA. It can also undergo alternative splicing, generating more than fifty different transcripts needed for the translation of other viral proteins. In resting memory CD4+ T cells, the provirus can be silently integrated and constitute a viral reservoir insensitive to antiviral therapies. However, following treatment interruption, the transcription of the provirus can be reactivated, leading to a rapid viral rebound. It is thus of utmost importance to better understand the mechanisms involved in the control of HIV-1 expression. This control can occur at several stages including viral transcription, splicing, viral RNA degradation or translation. Argonaute (Ago) proteins are mainly known to be involved in the regulation of gene expression via the RNA interference pathway. This pathway involves small non-coding RNAs, the miRNAs, which are subsequently matured by two proteins Drosha and Dicer. In the cytoplasm, the miRNA is loaded into one of the four human Argonaute proteins to form the miRISC (miRNA Induced Silencing Complex), that inhibits the translation of the target mRNA. In addition, several studies have shown that Ago1 and Ago2 can be localized in the nucleus and be involved in nuclear function such as transcription and mRNA splicing. The involvement of the miRNA pathway in the control of HIV-1 expression is controversial. A former study of the laboratory has shown that Ago1 and Ago2 are involved in the production of multiply-spliced mRNAs and in the production of infectious viral particles, independently of the presence of mature miRNAs. The objective of my thesis is to further explore the possible role of nuclear Ago proteins on HIV-1 expression. My thesis is articulated around two axes: the first one is to assess the implication of Ago proteins in HIV-1 expression in latently infected cell models. Using a combination of cytometry and qPCR techniques, I showed that while the downregulation of Ago1 or Drosha expression led to the reactivation of latent provirus, Ago2 and Dicer knockdown had no effect. The reactivation of the provirus correlated with an increase of the viral mRNA but did not affect viral RNA stability. Finally, capture of newly synthetized viral RNA and chromatin immunoprecipitation experiments suggested that Ago1 bind to the chromatin and participates to the maintenance of inactive integrated provirus in latency models, independently of the presence of miRNA. The second objective of my thesis is to better understand the role of Ago1 and Ago2 in the regulation of viral RNAs splicing. To this end, I participated in a study to analyze the viral transcriptome regulation during CD4+ T cells infection by long-read sequencing. By generating reads of several thousand nucleotides in length, we showed that this assay allows to identify and quantify all the viral transcripts produced during an infection and to follow the cascade of splicing events involved. Using this sequencing assay, we plan to further characterize the role of Ago1 and Ago2 on the viral transcriptome. For this purpose, I generated cellular clones knockout for Ago1 and Ago2 using the Crispr/Cas9 technology. To conclude, my thesis work allows deepening our knowledge into both Ago nuclear functions that remain poorly characterized, and on the mechanisms involved in the regulation of viral transcription during latency.Lors de l'infection des lymphocytes T CD4+ par le Virus de l'Immunodéficience Humaine de type 1 (VIH-1), le provirus intégré dans le génome de la cellule hôte est activement transcrit en un ARN pré-messager (pré-ARNm). Celui-ci peut-être traduit en protéines, ou incorporé dans les nouvelles particules virales en tant qu'ARN génomique. Il peut aussi être épissé en plus d'une cinquantaine d'ARNm viraux qui seront traduits en protéines nécessaires à la réplication du virus. Dans certains cas, le provirus peut être intégré de façon silencieuse et constituer un réservoir viral insensible aux thérapies antivirales. Cependant, lors de l'arrêt des traitements ce provirus silencieux peut être réactivé. Comprendre les mécanismes impliqués dans le contrôle de l'expression du VIH-1 constitue donc un enjeu majeur. Ce contrôle peut se faire au niveau de la transcription, de l'épissage, de la stabilité ou de la traduction des ARNm viraux. Les protéines Argonaute (Ago), sont principalement connues pour être impliquées dans la régulation de l'expression des gènes via la voie d'interférence à ARN. Cette voie fait intervenir de petits ARN non codants, les microARN (miARN), qui sont maturés successivement par les protéines Drosha et Dicer. Dans le cytoplasme, les miARN sont ensuite pris en charge par une des quatre Ago humaines pour former le miRISC (miRNA Induced Silencing Complex) capable d'inhiber la traduction des ARNm cibles. Même si les mécanismes sont encore peu clairs, plusieurs études montrent également qu'Ago1 et Ago2 ont des rôles nucléaires, notamment dans la transcription et l'épissage des ARNm cellulaires. Le rôle des miARN dans la réplication du VIH-1 est sujet à controverse. Les travaux du laboratoire ont montré qu'Ago1 et Ago2 sont impliqués dans la production des ARN viraux multi-épissés et des particules virales infectieuses, mais indépendamment de la présence de miARN. L'objectif de ma thèse est de mieux caractériser les possibles rôles nucléaires des Ago sur l'expression du VIH-1. Ma thèse s'articule autour de deux axes : le premier est de déterminer l'implication de ces protéines dans l'expression du VIH-1 dans des modèles de cellules infectées de façon latente. En m'appuyant sur des techniques de cytométrie en flux et de qPCR, j'ai montré que la déplétion d'Ago1, comme celle de Drosha, entraine la réactivation du provirus latent, tandis que la déplétion d'Ago2 ou de Dicer n'a pas d'effet. La réactivation du provirus est corrélée à une augmentation des ARNm viraux mais n'affecte pas leur stabilité. Finalement, des expériences de capture des ARN naissants et d'immunoprécipitation de la chromatine suggèrent qu'Ago1 se lie à la chromatine et participe à la répression de la transcription du provirus intégré, indépendamment des miARN. Le second axe consiste à approfondir le rôle d'Ago1 et Ago2 dans la régulation de l'épissage des ARNm viraux. Dans ce but, j'ai participé à une étude permettant d'analyser la régulation du transcriptome viral par séquençage pleine longueur dans des lymphocytes T CD4+ infectés. En générant des lectures de plusieurs milliers de nucléotides de long, nous avons montré que cet essai permet d'identifier et de quantifier l'ensemble des transcrits viraux produits lors d'une infection, et de suivre la cascade des évènements d'épissage impliqués. Cet outil permettra de caractériser le rôle d'Ago1 et d'Ago2 sur l'ensemble du transcriptome viral dans des clones cellulaires invalidés pour l'expression de ces protéines. En conclusion, mes travaux de thèse permettent d'approfondir nos connaissances sur les fonctions nucléaires des Ago encore peu étudiées et sur les mécanismes de régulation de la transcription virale dans des modèles de latence

Rôles nucléaires des protéines Argonaute dans l'expression du VIH-1

During infection of CD4+ T cells by the Human Immunodeficiency virus 1 (HIV-1), the provirus is integrated into the host cell genome and is actively transcribed into a pre-messenger RNA (pre-mRNA). This viral pre-mRNA is either translated into the Gag and Gag-Pol viral proteins or is encapsidated into new viral particles as genomic RNA. It can also undergo alternative splicing, generating more than fifty different transcripts needed for the translation of other viral proteins. In resting memory CD4+ T cells, the provirus can be silently integrated and constitute a viral reservoir insensitive to antiviral therapies. However, following treatment interruption, the transcription of the provirus can be reactivated, leading to a rapid viral rebound. It is thus of utmost importance to better understand the mechanisms involved in the control of HIV-1 expression. This control can occur at several stages including viral transcription, splicing, viral RNA degradation or translation. Argonaute (Ago) proteins are mainly known to be involved in the regulation of gene expression via the RNA interference pathway. This pathway involves small non-coding RNAs, the miRNAs, which are subsequently matured by two proteins Drosha and Dicer. In the cytoplasm, the miRNA is loaded into one of the four human Argonaute proteins to form the miRISC (miRNA Induced Silencing Complex), that inhibits the translation of the target mRNA. In addition, several studies have shown that Ago1 and Ago2 can be localized in the nucleus and be involved in nuclear function such as transcription and mRNA splicing. The involvement of the miRNA pathway in the control of HIV-1 expression is controversial. A former study of the laboratory has shown that Ago1 and Ago2 are involved in the production of multiply-spliced mRNAs and in the production of infectious viral particles, independently of the presence of mature miRNAs. The objective of my thesis is to further explore the possible role of nuclear Ago proteins on HIV-1 expression. My thesis is articulated around two axes: the first one is to assess the implication of Ago proteins in HIV-1 expression in latently infected cell models. Using a combination of cytometry and qPCR techniques, I showed that while the downregulation of Ago1 or Drosha expression led to the reactivation of latent provirus, Ago2 and Dicer knockdown had no effect. The reactivation of the provirus correlated with an increase of the viral mRNA but did not affect viral RNA stability. Finally, capture of newly synthetized viral RNA and chromatin immunoprecipitation experiments suggested that Ago1 bind to the chromatin and participates to the maintenance of inactive integrated provirus in latency models, independently of the presence of miRNA. The second objective of my thesis is to better understand the role of Ago1 and Ago2 in the regulation of viral RNAs splicing. To this end, I participated in a study to analyze the viral transcriptome regulation during CD4+ T cells infection by long-read sequencing. By generating reads of several thousand nucleotides in length, we showed that this assay allows to identify and quantify all the viral transcripts produced during an infection and to follow the cascade of splicing events involved. Using this sequencing assay, we plan to further characterize the role of Ago1 and Ago2 on the viral transcriptome. For this purpose, I generated cellular clones knockout for Ago1 and Ago2 using the Crispr/Cas9 technology. To conclude, my thesis work allows deepening our knowledge into both Ago nuclear functions that remain poorly characterized, and on the mechanisms involved in the regulation of viral transcription during latency.Lors de l'infection des lymphocytes T CD4+ par le Virus de l'Immunodéficience Humaine de type 1 (VIH-1), le provirus intégré dans le génome de la cellule hôte est activement transcrit en un ARN pré-messager (pré-ARNm). Celui-ci peut-être traduit en protéines, ou incorporé dans les nouvelles particules virales en tant qu'ARN génomique. Il peut aussi être épissé en plus d'une cinquantaine d'ARNm viraux qui seront traduits en protéines nécessaires à la réplication du virus. Dans certains cas, le provirus peut être intégré de façon silencieuse et constituer un réservoir viral insensible aux thérapies antivirales. Cependant, lors de l'arrêt des traitements ce provirus silencieux peut être réactivé. Comprendre les mécanismes impliqués dans le contrôle de l'expression du VIH-1 constitue donc un enjeu majeur. Ce contrôle peut se faire au niveau de la transcription, de l'épissage, de la stabilité ou de la traduction des ARNm viraux. Les protéines Argonaute (Ago), sont principalement connues pour être impliquées dans la régulation de l'expression des gènes via la voie d'interférence à ARN. Cette voie fait intervenir de petits ARN non codants, les microARN (miARN), qui sont maturés successivement par les protéines Drosha et Dicer. Dans le cytoplasme, les miARN sont ensuite pris en charge par une des quatre Ago humaines pour former le miRISC (miRNA Induced Silencing Complex) capable d'inhiber la traduction des ARNm cibles. Même si les mécanismes sont encore peu clairs, plusieurs études montrent également qu'Ago1 et Ago2 ont des rôles nucléaires, notamment dans la transcription et l'épissage des ARNm cellulaires. Le rôle des miARN dans la réplication du VIH-1 est sujet à controverse. Les travaux du laboratoire ont montré qu'Ago1 et Ago2 sont impliqués dans la production des ARN viraux multi-épissés et des particules virales infectieuses, mais indépendamment de la présence de miARN. L'objectif de ma thèse est de mieux caractériser les possibles rôles nucléaires des Ago sur l'expression du VIH-1. Ma thèse s'articule autour de deux axes : le premier est de déterminer l'implication de ces protéines dans l'expression du VIH-1 dans des modèles de cellules infectées de façon latente. En m'appuyant sur des techniques de cytométrie en flux et de qPCR, j'ai montré que la déplétion d'Ago1, comme celle de Drosha, entraine la réactivation du provirus latent, tandis que la déplétion d'Ago2 ou de Dicer n'a pas d'effet. La réactivation du provirus est corrélée à une augmentation des ARNm viraux mais n'affecte pas leur stabilité. Finalement, des expériences de capture des ARN naissants et d'immunoprécipitation de la chromatine suggèrent qu'Ago1 se lie à la chromatine et participe à la répression de la transcription du provirus intégré, indépendamment des miARN. Le second axe consiste à approfondir le rôle d'Ago1 et Ago2 dans la régulation de l'épissage des ARNm viraux. Dans ce but, j'ai participé à une étude permettant d'analyser la régulation du transcriptome viral par séquençage pleine longueur dans des lymphocytes T CD4+ infectés. En générant des lectures de plusieurs milliers de nucléotides de long, nous avons montré que cet essai permet d'identifier et de quantifier l'ensemble des transcrits viraux produits lors d'une infection, et de suivre la cascade des évènements d'épissage impliqués. Cet outil permettra de caractériser le rôle d'Ago1 et d'Ago2 sur l'ensemble du transcriptome viral dans des clones cellulaires invalidés pour l'expression de ces protéines. 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Comment gérer l'ambiance sonore ?

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