Mechanism of action of low molecular weight acid phosphatases

la propiedad de hidrolizar fosfomonoésteres a pH 5,0, liberando como productos de la reacción un alcohol y fosfato inorgánico. Cuando se compara los valores de kcat/Km de las fosfatasas de hígado, de bovino, alpaca y porcino, nos permite sugerir que estas enzimas tienen elevada afinidad por el sustrato p-nitrofenil fosfato. Los productos que se liberan durante la catálisis por fosfatasa ácida, muestran que el fenol o el p-nitrofenol se comportan como inhibidores de tipo no competitivo, mientras que el fosfato inorgánico muestra una inhibición de tipo competitiva. Para evidenciar la probable formación de un complejo covalente en la secuencia catalítica, se utilizó diversos nucleófilos más eficientes que el agua, tales como metanol, etanol y glicerol. Las modificaciones que produjeron en los valores Km, Vmax y los productos liberados en la reacción sugieren la formación de un complejo enzima-fosfato. El pH afecta los valores de Km y Vmax de las fosfatasas ácidas, un análisis del comportamiento de estas enzimas en un rango de pH comprendido entre 3,8 y 6,8 sugieren que en el sitio activo existe un residuo de aminoácido con un valor pKa de 6,0. El uso del dietilpirocarbonato, un compuesto que selectivamente reacciona con el residuo histidina en las proteínas, inhibe completamente a estas fosfatasas. Así mismo, un experimento de cinética de inhibición múltiple realizado en presencia de fosfato inorgánico y dietilpirocarbonato permite calcular un valor Ki que es igual al obtenido en otras condiciones experimentales. En tal sentido, las fosfatasas ácidas de bajo peso molecular catalizarían las reacciones a través de un modelo de tipo uni biordenado, con la formación de un complejo covalente intermedio, y que el residuo histidina participaría directamente en la catálisis.Acid phosphatases are enzymes widespread in nature that hydrolyze phosphomonoesters at pH 5,0; this reaction yields alcohol and inorganic phosphate. Comparison of bovine, alpaca and porcine liver phosphatases kcat/Km values suggests these enzymes have a high affinity for p-nitrophenyl phosphate substrate. Products that are released during acid phosphatase catalysis show that phenol or p-nitrophenol behave as non competitive inhibitors, whereas inorganic phosphate shows competitive inhibition. Different nucleophiles more efficient than water have been used, such as methanol, ethanol and glycerol, showing the probable formation of a covalent complex in the catalytic sequence. Modifications produced in Km and Vmax values as well as in the reaction released products suggest the development of an enzyme-phosphate complex. pH affects acid phosphatases Km and Vmax values. Behavioral analysis of these enzymes at 3,8 to 6,8 pH range suggests the location of a pKa 6,0 aminoacid residue in the active site. The use of a diethylpyrocarbonate compound which selectively reacts with protein histidine residues completely inhibits this kind of phosphatases. Also, multiple inhibition kinetic survey performed in presence of inorganic phosphate and diethylpyrocarbonate allows a Ki value calculation equal to that obtained in other experimental conditions. In this respect, low molecular weight acid phosphatases would catalyze reactions through a uni biordered model, forming an intermediate covalent complex; histidine residues would directly participate in the catalysis

Effect of glycerol on catalysis by low molecular weight acid phosphatase from alpaca liver (Lama pacos)

Objetivo: Determinar el efecto del glicerol sobre la hidrólisis del p-nitrofenil fosfato a pH 5,0 por fosfatasa ácida de bajo peso molecular de hígado de alpaca. Diseño: Estudio analítico experimental. Lugar: Centro de Investigación de Bioquímica y Nutrición, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Materiales: Se utilizó los reactivos químicos p-nitrofenil fosfato sal disódica, ácido acético glacial, glicerol, ácido tricloroacético, ácido sulfúrico, molibdato de amonio, ácido ascórbico, sulfato de amonio, sephadex G-75 (45-120), sulfoetil sephadex C-50 y etilendiaminotetraacético (EDTA). Métodos: Se determinó los parámetros cinéticos Km y Vmax utilizando como sustrato el p-nitrofenil fosfato, en presencia de concentraciones variables de glicerol. Así mismo, se determinó la velocidad de liberación de los productos de la reacción en función de la concentración de dicho nucleófilo. Principales medidas de resultados: Efecto del glicerol sobre la hidrólisis del p-nitrofenil fosfato. Resultados: El glicerol en concentraciones comprendidas entre 1,16 y 3,49 M incrementó linealmente la liberación del p-nitrofenol; en cambio, la formación del fosfato inorgánico -el segundo producto liberado- no se modificó. Así mismo, los valores de Km y Vmax se incrementaron linealmente dependientes de las concentraciones de glicerol, en un rango comprendido entre 0,58 y 2,32 M. Conclusiones: Un análisis de las modificaciones que ejerce el glicerol sobre los valores de Km y Vmax y la velocidad de liberación de los productos de la reacción permite sugerir un modelo en el que la fosfatasa ácida de bajo peso molecular de hígado de alpaca cataliza la hidrólisis de fosfomonoésteres a través de un mecanismo uni biordenado, con la formación de un complejo enzima-fosfato, que sería escindido por agua o un nucleófilo, como el glicerol; en este modelo a k2 le corresponde un valor mucho mayor que k3 y k4 N.Objective: To determine the effect of glycerol on hydrolisis of p-nitrophenyl phosphate at pH 5,0 by low molecular weight acid phosphatase from alpaca liver. Design: Experimental analytical study. Setting: Biochemistry and Nutrition Research Center, Faculty of Medicine, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Peru. Materials: Disodic p-nitrophenyl phosphate salt, glacial acetic acid, glycerol, tricloroacetic acid, sulfuric acid, ammonium molibdate, ascorbic acid, ammonium sulphate, sephadex G-75 (45-120), sulpho ethyl sephadex C-50 and ethylene diaminotetraacetic (EDTA) chemical reactives. Methods: Both Km and Vmax kinetic parameters were determined with p-nitrophenyl phosphate as substrate in presence of different concentrations of glycerol. The rate of formation of products was determined as a function of the concentration of such nucleophile. Main outcome measures: Glycerol effect on p-nitrophenyl phosphate hydrolysis. Results: Glycerol linearly increased pnitrophenol release at concentrations between 1,16 and 3,49M. Instead, inorganic phosphate formation, the second product, was not modified. Also, Km and Vmax values increased linearly between 0,58 and 2,32 M depending on glycerol concentrations. Conclusions: Analysis of modifications induced by glycerol on Km and Vmax values as well as on liberation velocity of the reaction products suggests a model in which low molecular weight acid phosphatase isolated from alpaca liver catalyses phosphomonoesters hydrolysis through an uni biordered mechanism, with formation of an enzyme-phosphate complex that will be splitted by water or a nucleophile such a glycerol; in this model, k2 corresponds to a much higher value than k3 or k4 N

Distribution of plasma homocysteine, folate and B-12 vitamin in Lima, Peru's young adults

Objetivo: Estudiar la distribución de homocisteína plasmática y su relación con los niveles de ácido fólico y vitamina B-12, en una población de jóvenes adultos de la ciudad de Lima. Material y Métodos: Estudio de corte transversal en una muestra de 65 personas con edades entre 18 y 30 años. La homocisteína plasmática fue determinada por inmunoensayo de polarización fluorescente (FPIA), ácido fólico por captura iónica y B-12 enzimáticamente. Resultados: La distribución de los niveles de homocisteina varió entre 1,40 y 24,04 mmoles/L, con una media de 8,32±5,46; mediana 7,76 mmol/L. Los niveles medios de homocisteína fueron significativamente mayores (p=0,005) en varones (9,97±4,81 mmol/L), que en mujeres (7,35±2,03 mmol/L). Los niveles de homocisteína se correlacionan significativamente con las mediciones de ácido fólico (r=-0,329; p=0,007), pero no hay indicios de asociación con la vitamina B-12; sin embargo, se encontró asociación con el índice de masa corporal (IMC) (r=0,391; p=0,001). Conclusiones: La distribución de los niveles de homocisteína en la muestra estudiada se encuentra dentro de los niveles referenciales sugeridos por la literatura; sin embargo, estos valores tienden a estar próximos al límite inferior del rango de normalidad. Los niveles de ácido fólico en sangre pueden ser un factor determinante de la variación de los niveles de homocisteína.Objective: To describe the distribution of plasma homocysteine, folic acid, B-12 vitamin concentrations among students living in the city of Lima, Peru. Material and Methods: Transversal cohort study of 65 young adults between 18 and 30 year-old. The plasma homocysteine concentration was determined by fluorescence polarization inmunoassay FPIA from Abbott Laboratories, folic acid by ionic capture and vitamin B-12 by enzimatic assay. Results: The distribution of homocysteine values ranged from 1,40 to 24,04 mmol /L; geometric mean homocysteine 8,32±5,46, median 7,76 mmol/L. Homocysteine geometric means were significantly higher (p=0,005) in men (9,97±4,81 mmol/L) than in women (7,35±2,03 mmol/L). Plasma homocysteine level was significantly correlated with folic acid plasma level (r=-0,329, p=0,007) but not with B-12 vitamin. However, plasma homocysteine level was correlated with body mass index (r=0,391; p=0,001). Conclusions: The distribution of homocysteine levels in our sample is within the reference range already reported. However, there was a complete shift of the homocysteine distribution curve towards lower values. Plasma folic acid levels may be a determinant factor in the variation of homocysteine levels

Determinación de la capacidad antioxidante de la Passiflora ligularis (granadilla)

Objetivos: Determinar la actividad antioxidante de la Passiflora ligularis. Diseño: Descriptivo, observacional. Institución: Centro de Investigación de Bioquímica y Nutrición, Facultad de Medicina, UNMSM. Material biológico: Passiflora ligularis (granadilla). Intervenciones: Se separó la parte comestible de la fruta, la que fue homogenizada con agua destilada, centrifugada y el sobrenadante usado para realizar las diferentes determinaciones analíticas, tales como, los niveles de compuestos antioxidantes y la capacidad para captar el radical DPPH, para cuyo propósito de utilizó concentraciones diferentes de la fruta. Principales medidas de resultados: Determinación de compuestos antioxidantes, evaluación de la capacidad antioxidante, capacidad captadora del radical DPPH. Resultados: La Passiflora ligularis mostró un valor de polifenoles de 28,7 mg eq de ácido gálico/100 mL de jugo, flavonoides 1,66 mg eq de catequina/100 mL de jugo, vitamina C 20 mg/100 mL de jugo, FRAP 0,37 mmoles de Fe-II/100 mL de jugo y DPPH IC50 0,011 mg/mL. Conclusiones: La actividad antioxidante de la Passiflora ligularis fue moderada, comparada con otras frutas, que mostraron valores más elevados

Daño pulmonar generado por sulfato ferroso y vitamina C en embriones de ratas y crías, y regeneración posnecrótica por Petroselinum sativum (perejil)

Objetivos: Identificar histológicamente la protección por el Petroselinum sativum (perejil) del tejido pulmonar, frente al daño por la ingesta de sulfato ferroso y vitamina C, en ratas madre, fetos y crías. Diseño: Analítico, experimental. Institución: Centro de Investigación de Bioquímica y Nutrición, Facultad de Medicina, UNMSM. Material biológico: Ratas hembras albinas en su primera, segunda o tercera semana de preñez, fetos y crías. Intervenciones: Se utilizó 36 ratas. Recibieron la misma dieta y agua ad líbitum y tratamientos por vía oral, durante 7 días, primera (1), segunda (2) o tercera (3) semana de preñez. Los subgrupos A1, A2, A3 recibieron sulfato ferroso (1 mg de hierro elemental) y vitamina C (10 mg); los subgrupos B1, B2, B3, sulfato ferroso (1 mg de hierro elemental), vitamina C (10 mg) y extracto acuoso de perejil (150 mg/kg); los subgrupos C1, C2, C3, agua destilada (1 mL). Principales medidas de resultados: Hemorragia septal e intraalveolar, enfisema focal. Resultados: El tratamiento con sulfato ferroso y vitamina C ocasionó daño pulmonar, hemorragia septal e intraalveolar moderada a severa, enfisema focal moderado; el tratamiento con sulfato ferroso, vitamina C y perejil ocasionó menos daño pulmonar y hemorragia septal leve a moderada. Las ratas sin tratamiento mostraron pulmones sin alteraciones. Hubo diferencia estadísticamente significativa entre los grupos. Conclusiones: El tratamiento antianémico con sulfato ferroso y vitamina C administrado a ratas preñadas produjo daño pulmonar en ellas y en sus fetos y crías. El perejil las protegió, presentando menor daño pulmonar

Actividad antiinflamatoria de la enzima superóxido dismutasa (SOD), purificada de la especie Allium sativum (ajo)

Objetivos: Demostrar la actividad antiinflamatoria de la enzima superóxido dismutasa (SOD) purificada de Allium sativum (ajo). Diseño: Experimental. Institución: Centro de Investigación de Bioquímica y Nutrición, Facultad de Medicina, UNMSM Material biológico: Ratas y Allium sativum. Principales medidas de resultados: Muestra de ajo triturada con tampón fosfato 50 mM pH 7,4, incubada 40 minutos y filtrada; fue sometida a extracción con cloroformo:etanol 1:1 (v/v). Se descartó la fase acuosa. La fase orgánica fue concentrada en un sistema vacío-evaporación a 43-45 ºC; se midió actividad de SOD y de proteína. Para la actividad antiinflamatoria in vivo se formó 4 grupos de ratas hembras y se les administró vía subplantar: grupo control (NaCl), referencia (indometacina 10 mg/kg de peso) y dos grupos con SOD de ajo (extracto crudo y SOD parcialmente purificada). Después de una hora, se inyectó a todos carragenina por vía subplantar. El volumen del edema fue medido con un pletismómetro a los 30, 60, 120, 180 y 240 minutos. Resultados: La enzima SOD de ajo fue purificada 1,8 veces. El extracto crudo y el SOD parcialmente purificado no lograron reducir la acción inflamatoria producida a nivel local. La indometacina redujo significativamente la inflamación desde las 2 horas. Conclusiones: El extracto crudo y la SOD parcialmente purificada, en este modelo, no presentaron actividad antiinflamatoria local

Efecto neuroprotector del Lepidium meyenii, ecotipo negro (maca negra) en ratas crías frente al daño cerebral inducido por la ingesta de sulfato ferroso y vitamina C durante la gestación de las ratas madre

Objetivo: Evaluar el efecto neuroprotector del Lepidium meyenii, ecotipo negro en ratas crías por ingesta de sulfato ferroso y vitamina C (SFC) durante la gestación de ratas madre. Diseño: Experimental, analítico. Institución: Centro de Investigación de Bioquímica y Nutrición. Material biológico: Lepidium meyenii, ecotipo negro (maca negra: MN), ratas. Intervenciones: Se distribuyeron 30 ratas albinas de dos meses de edad, en tres grupos. Tratamiento en los últimos 7 días de gestación: grupo A, SFC (1 mg de hierro elemental y 10 mg de vitamina C); grupo B: SFC (1 mg de hierro elemental y 10 mg de vitamina C) y extracto acuoso de MN (1,0 g/kg pc); grupo C: agua destilada (1 mL). Al nacimiento, la mitad de la camada fue sacrificada y el cerebro separado; la otra mitad fue sometida a la prueba de laberinto de agua de Morris, a los 21 días de edad, sacrificada y el cerebro separado. Principales medidas de resultados: Signos histopatológicos de necrosis cerebral y tiempo (segundos) en la Prueba de Morris. Resultados: Las ratas del grupo A presentaron hemorragia intercisural severa, homogenización del parénquima, ausencia de núcleo y pérdida de la membrana celular neuroglial, ausencia de células piramidales. Los grupos B y C no mostraron alteraciones. Hubo correspondencia con la Prueba de Morris

Efecto del glicerol sobre la catálisis por fosfatasa ácida de bajo peso molecular de hígado de alpaca (Lama pacos)

Objetivo: Determinar el efecto del glicerol sobre la hidrólisis del p-nitrofenil fosfato a pH 5,0 por fosfatasa ácida de bajo peso molecular de hígado de alpaca. Diseño: Estudio analítico experimental. Lugar: Centro de Investigación de Bioquímica y Nutrición, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Materiales: Se utilizó los reactivos químicos p-nitrofenil fosfato sal disódica, ácido acético glacial, glicerol, ácido tricloroacético, ácido sulfúrico, molibdato de amonio, ácido ascórbico, sulfato de amonio, sephadex G-75 (45-120), sulfoetil sephadex C-50 y etilendiaminotetraacético (EDTA). Métodos: Se determinó los parámetros cinéticos Km y Vmax utilizando como sustrato el p-nitrofenil fosfato, en presencia de concentraciones variables de glicerol. Así mismo, se determinó la velocidad de liberación de los productos de la reacción en función de la concentración de dicho nucleófilo. Principales medidas de resultados: Efecto del glicerol sobre la hidrólisis del p-nitrofenil fosfato. Resultados: El glicerol en concentraciones comprendidas entre 1,16 y 3,49 M incrementó linealmente la liberación del p-nitrofenol; en cambio, la formación del fosfato inorgánico -el segundo producto liberado- no se modificó. Así mismo, los valores de Km y Vmax se incrementaron linealmente dependientes de las concentraciones de glicerol, en un rango comprendido entre 0,58 y 2,32 M. Conclusiones: Un análisis de las modificaciones que ejerce el glicerol sobre los valores de Km y Vmax y la velocidad de liberación de los productos de la reacción permite sugerir un modelo en el que la fosfatasa ácida de bajo peso molecular de hígado de alpaca cataliza la hidrólisis de fosfomonoésteres a través de un mecanismo uni biordenado, con la formación de un complejo enzima-fosfato, que sería escindido por agua o un nucleófilo, como el glicerol; en este modelo a k2 le corresponde un valor mucho mayor que k3 y k4 N