Single dose pharmacodynamics of amphotericin B against Aspergillus species in an in vitro pharmacokinetic/pharmacodynamic model

Conventional MIC testing of amphotericin B results in narrow MIC ranges challenging the detection of resistant strains. In order to discern amphotericin B pharmacodynamics, the in vitro activity of amphotericin B was studied against Aspergillus isolates with the same MIC with a new in vitro pharmacokinetic/pharmacodynamic (PK/PD) model that simulates amphotericin B human plasma levels. Clinical isolates of A. fumigatus, A. terreus and A flavus with the same CLSI modal MICs of 1 mg/l were exposed to amphotericin B concentrations following the plasma concentration-time profile after single bolus administration with Cmax 0.6, 1.2, 2.4 and 4.8 mg/L. Fungal growth was monitored up to 72h based on galactomannan production. Complete growth inhibition was observed only against A. fumigatus with amphotericin B Cmax ≥2.4 mg/L. At lower Cmaxs 0.6 and 1.2 mg/L, a significant growth delay of 34h and 52h was observed, respectively (pA flavus>A. terreus in the in vitro PK/PD model possibly reflecting the different concentration- and time-dependent inhibitory/killing activities amphotericin B exerting against these species

Voriconazole efficacy against Candida glabrata and Candida krusei: preclinical data using a validated in vitro pharmacokinetic/pharmacodynamic model

Background: Voriconazole exhibits in vitro activity against Candida glabrata and Candida krusei (EUCAST/CLSI epidemiological cut-off values 1/0.25 and 1/0.5 mg/L, respectively). Yet, EUCAST found insufficient evidence to set breakpoints for these species. We explored voriconazole pharmacodynamics (PD) in an in vitro dynamic model simulating human pharmacokinetics (PK). Methods: Four C. glabrata and three C. krusei isolates (voriconazole EUCAST and CLSI MICs of 0.03–2 mg/L) were tested in the PK/PD model simulating voriconazole exposures (t1=2 6 h q12h dosing for 3 days). PK/PD breakpoints were determined calculating the PTA for exposure indices fAUC0–24/MIC associated with half-maximal activity (EI50) using Monte Carlo simulation analysis. Results: Fungal load increased from 3.60±0.35 to 8.41±0.24 log10 cfu/mL in the drug-free control, with a maximum effect of 1 log10 kill of C. glabrata and C. krusei isolates with MICs of 0.06 and 0.25 mg/L, respectively, at high drug exposures. The 72 h log10 cfu/mL change versus fAUC0–24/MIC relationship followed a sigmoid curve for C. glabrata (R2 =0.85–0.87) and C. krusei (R2 =0.56–0.76) with EI50 of 49 (32–76) and 52 (33–78) fAUC/MIC for EUCAST and 55 (31–96) and 80 (42–152) fAUC/MIC for CLSI, respectively. The PTAs for C. glabrata and C. kr

A multicentre study to optimize echinocandin susceptibility testing of Aspergillus species with the EUCAST methodology and a broth microdilution colorimetric method

BACKGROUND: The determination of the minimal effective concentration (MEC) of echinocandins against Aspergillus species is subjective, time consuming and has been associated with very major errors. METHODS: The MECs/MICs of 40 WT [10 each of Aspergillus fumigatus species complex (SC), Aspergillus flavus SC, Aspergillus terreus SC and Aspergillus niger SC] and 4 non-WT A. fumigatus isolates were determined with EUCAST E.Def 9.3.1 read microscopically, macroscopically, spectrophotometrically and colorimetrically in three centres. The optimal conditions for spectrophotometric (single- versus multi-point readings) and colorimetric (XTT/menadione concentration and stability, incubation time) methods were evaluated in preliminary studies using different cut-offs for the determination of macroscopic, spectrophotometric and colorimetric MIC endpoints compared with the microscopically determined MEC. Inter-centre and inter-method essential (within one 2-fold dilution) agreement (EA) and categorical agreement (CA) were determined. RESULTS: Both macroscopic and spectr

Optimizing antifungal therapy against azole-resistant Aspergillus fumigatus isolates using an in vitro pharmacokinetic/pharmacodynamic simulation model

Η ταχεία αύξηση στη συχνότητα εμφάνισης της αντοχής στις ιατρικές αζόλες προκαλεί ιδιαίτερη ανησυχία αναφορικά με τη θεραπεία πρώτης γραμμής με βορικοναζόλη σε ασθενείς υψηλού κινδύνου με υποψία διηθητικής ασπεργίλλωσης. Οι εναλλακτικές θεραπευτικές επιλογές είναι περιορισμένες. Μια θεραπευτική στρατηγική για αυτή τη δύσκολα ιάσιμη λοίμωξη που έχει συγκεντρώσει το ενδιαφέρον είναι ο συνδυασμός αντιμυκητιακών που ανήκουν σε διαφορετικές κατηγορίες φαρμάκων. Το χαρακτηριστικό γνώρισμα συγκέντρωσης φαρμάκου-επίδρασης θα μπορούσε να υποβληθεί σε φαρμακοκινητική/φαρμακοδυναμική (ΦΚ/ΦΔ) μοντελοποίηση, καθώς η συγκεκριμένη προσέγγιση μπορεί να παρέχει σημαντικές πληροφορίες σχετικά με την κλινική έκβαση. Ακριβή και επικυρωμένα in vitro ΦΚ/ΦΔ μοντέλα μπορούν να χρησιμεύσουν ως χρήσιμα εργαλεία για την ποσοτική εκτίμηση της αποτελεσματικότητας της συνδυαστικής θεραπείας, ενώ μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την εκτέλεση πιο εκτεταμένων πειραμάτων σε σύγκριση με ζωικά μοντέλα και κλινικές δοκιμές. Στο Κεφάλαιο 2, ένα πρόσφατα αναπτυχθέν δυναμικό in vitro ΦΚ/ΦΔ μοντέλο αξιολογήθηκε σύμφωνα με τα αποτελέσματα που ελήφθησαν από ένα πειραματικό μυϊκό μοντέλο ασπεργίλλωσης χρησιμοποιώντας τα ίδια στελέχη A. fumigatus και προσομοιώνοντας τη ΦΚ στον ορό των ποντικών. Στη συνέχεια, προσομοιώνοντας τη ΦΚ στον ανθρώπινο ορό και χρησιμοποιώντας στελέχη A. fumigatus με διακριτούς μηχανισμούς αντοχής στις αζόλες, προσδιορίστηκαν τα όρια ευαισθησίας στη βορικοναζόλη για διαφορετικές μεθοδολογίες που εφαρμόζονται στην καθημερινή εργαστηριακή πρακτική για τον έλεγχο ευαισθησίας στα αντιμυκητιακά. Επιπροσθέτως, προσδιορίστηκαν η περιοχή κάτω από την καμπύλη συγκέντρωσης-χρόνου (AUC) και τα ελάχιστα επίπεδα βορικοναζόλης στον ανθρώπινο ορό που απαιτούνται για τη βέλτιστη θεραπευτική αποτελεσματικότητα και την ελάχιστη δυνατή εμφάνιση τοξικότητας σε σχέση με τις ελάχιστες ανασταλτικές συγκεντρώσεις (MICs). Η in vitro fAUC0-24/MIC που αντιστοιχεί στο 50% της μέγιστης αντιμυκητιακής δράσης ήταν 28.61, παραπλήσια της αντίστοιχης 14.67 fAUC0-24/MIC που βρέθηκε στα πειραματόζωα. Εκ παραλλήλου, το ποσοστό επίτευξης στόχου βρέθηκε σύμφωνο με την ποσοστιαία αποτελεσματικότητα του φαρμάκου σε σχέση με τις CLSI MICs σε κλινικές μελέτες διηθητικής ασπεργίλλωσης, παρέχοντας μια επιπλέον σημαντική κλινική συσχέτιση του in vitro ΦΚ/ΦΔ μοντέλου. Τα όρια ευαισθησίας για την ανίχνευση ευαίσθητων/μετρίως ευαίσθητων/ανθεκτικών στη βορικοναζόλη στελεχών προσδιορίσθηκαν να είναι 0.25/0.5-1/2 mg/L και 0.5/1-2/4 mg/L για τη μέθοδο αραιώσεων σε ζωμό κατά CLSI και EUCAST, αντίστοιχα, και 0.25/0.375-1/1.5 mg/L για τη μέθοδο ταινιών διαβαθμισμένης συγκέντρωσης. Ως εκ τούτου, η παρακολούθηση επιπέδων βορικοναζόλης δύναται να χρησιμοποιηθεί με σκοπό τη βελτιστοποίηση της θεραπείας, ιδιαίτερα έναντι στελεχών με CLSI MIC 0.5-1 mg/L και EUCAST MIC 1-2 mg/L, στοχεύοντας σε ελάχιστες συγκεντρώσεις 1 και 2 mg/L, αντίστοιχα, ενώ η χορήγηση βορικοναζόλης θα πρέπει να αποφεύγεται έναντι στελεχών με CLSI και EUCAST MICs >2 και >4 mg/L, αντίστοιχα. Δεδομένης της επιβεβαίωσης των αποτελεσμάτων του in vitro μοντέλου με προηγούμενα in vivo δεδομένα, το προκλινικό αυτό εργαλείο μπορεί να αποδειχθεί τελεσφόρο για την πρόβλεψη του in vivo αποτελέσματος, ενώ τα προτεινόμενα όρια ευαισθησίας και οι προσδιοριζόμενες τιμές-στόχοι θα μπορούσαν να συμβάλουν στη βελτιστοποίηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας. Κατόπιν της βελτιστοποίησης και επικύρωσης του in vitro ΦΚ/ΦΔ μοντέλου, δεδομένης της αξιόπιστης προσομοίωσης της ΦΚ της βορικοναζόλης στον ανθρώπινο ορό και της συσχέτισης με in vivo δεδομένα ζωικών μοντέλων και κλινικών δοκιμών, το σύστημα προσαρμόστηκε για την ταυτόχρονη μελέτη δύο φαρμάκων με διαφορετικούς χρόνους ημίσειας ζωής επιτρέποντας έτσι τη διερεύνηση του συνδυασμού τους. Συγκεκριμένα, στο Κεφάλαιο 3.1, προσομοιώθηκαν τα προφίλ συγκέντρωσης-χρόνου της αμφοτερικίνης Β (κάθε 24 ώρες) και της βορικοναζόλη (κάθε 12 ώρες) στον ανθρώπινο ορό και μελετήθηκαν οι ΦΔ αλληλεπιδράσεις που λαμβάνουν χώρα κατά τη συγχορήγηση τους έναντι ευαίσθητων και ανθεκτικών στις αζόλες στελεχών A. fumigatus χρησιμοποιώντας το κριτήριο ανεξαρτησία κατά Bliss και την ανάλυση επιφάνειας-απόκρισης κανονικών μειγμάτων. Ακολούθως, προκειμένου να γεφυρωθούν τα in vitro ΦΚ/ΦΔ δεδομένα με στοιχεία της ΦΚ στον άνθρωπο, διεξήχθη ανάλυση προσομοίωσης Monte Carlo, οπότε και προσδιορίστηκαν τόσο τα ποσοστά επίτευξης στόχου όσο και τα επίπεδα των συγχορηγούμενων φαρμάκων που απαιτούνται προκειμένου να επιτευχθεί η κλινικά σημαντική in vitro ΦΚ/ΦΔ παράμετρος για διαφορετικές MICs. Παρατηρήθηκαν δοσο-εξαρτώμενες αλληλεπιδράσεις: συνέργεια βρέθηκε κατά την έκθεση σε χαμηλές συγκεντρώσεις αμφοτερικίνης Β-υψηλές συγκεντρώσεις βορικοναζόλης, ενώ ανταγωνισμός σε υψηλές συγκεντρώσεις αμφοτερικίνης Β-χαμηλές συγκεντρώσεις βορικοναζόλης για όλα τα εξεταζόμενα στελέχη. Ο ΦΔ στόχος επιτεύχθηκε για σχήματα συνδυασμού με αναλογίες συγκέντρωσης φαρμάκου στον ορό/MIC 1.1 tCmin/MIC για τη βορικοναζόλη και 0.5 tCmax/MIC για την αμφοτερικίνη Β, ενώ για τα εξίσου αποτελεσματικά σχήματα μονοθεραπείας απαιτούνταν αναλογίες 1.8 tCmin/MIC και 3.4 tCmax/MIC, αντίστοιχα. Επεκτείνοντας τα in vitro ευρήματα στον άνθρωπο, o συνδυασμός αμφοτερικίνης Β-βορικοναζόλης είχε ως αποτέλεσμα 17 έως 48% υψηλότερα ποσοστά επίτευξης στόχου συγκριτικά με τις αντίστοιχες μονοθεραπείες, ιδιαίτερα στην περίπτωση στελεχών με βορικοναζόλη/αμφοτερικίνη Β MICs 1-4 mg/L. Η παρακολούθηση επιπέδων φαρμάκων θα μπορούσε να εφαρμοσθεί στοχεύοντας στη βελτιστοποίηση της συνδυαστικής θεραπείας με χαμηλής δόσης (≤0,6 mg/kg) αμφοτερικίνη Β-συνδυαστικά δοσολογικά σχήματα έναντι αζολο-ανθεκτικών στελεχών με την εμφάνιση ελάχιστης δυνατής τοξικότητας. Στο Κεφάλαιο 3.2, διερευνήθηκαν οι ΦΔ αλληλεπιδράσεις του συνδυασμού βορικοναζόλης-ανιντουλαφουγκίνης έναντι A. fumigatus, συμπεριλαμβανομένων αζολο-ανθεκτικών στελεχών, προσομοιώνοντας τα προφίλ επιπέδων ανιντουλαφουγκίνης-χρόνου στον ανθρώπινο ορό για την καθιερωμένη και χαμηλότερες δοσολογίες της με τη βοήθεια του επικυρωμένου in vitro ΦΚ/ΦΔ μοντέλου. Οι ΦΔ αλληλεπιδράσεις αναλύθηκαν με το κριτήριο ανεξαρτησίας κατά Bliss και τη μη-γραμμική ανάλυση επιφάνειας-απόκρισης κανονικών μειγμάτων βασισμένη στην προσθετικότητα κατά Loewe. Τα ποσοστά επίτευξη στόχου εκτιμήθηκαν για διαφορετικές δόσεις ανιντουλαφουγκίνης και για νοσοκομειακά κέντρα με αυξανόμενα ποσοστά αντοχής στις αζόλες με προσομοίωση Monte Carlo. Εντοπίστηκαν δοσο- και MIC-εξαρτώμενων αλληλεπιδράσεις: συνέργεια παρατηρήθηκε σε χαμηλές συγκεντρώσεις ανιντουλαφουγκίνης (fCmax/MΕC<10) και βορικοναζόλης (fCmax/MIC<10), ενώ ανταγωνισμός βρέθηκε σε υψηλότερες. Η μεγαλύτερη αύξηση στην πιθανότητα επίτευξης στόχου εντοπίστηκε με τη δόση των 25mg ανιντουλαφουγκίνης και για κατανομές MIC βορικοναζόλης με υψηλά ποσοστά αντοχής (>10%), υποδεικνύοντας ότι η χαμηλή δόση ανιντουλαφουγκίνης δύναται να ενισχύσει την αποτελεσματικότητα και να μειώσει το κόστος της συνδυαστικής θεραπείας, ιδιαίτερα έναντι αζολο-ανθεκτικών στελεχών A. fumigatus και σε ασθενείς με υποθεραπευτικά επίπεδα στον ορό. Βάσει των προαναφερθέντων αποτελεσμάτων, η παρακολούθηση επιπέδων φαρμάκων διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στη βελτιστοποίηση της αντιμυκητιακής συνδυαστικής θεραπείας, ενώ για να έχει κλινική αξία και λόγο να πραγματοποιηθεί πρέπει να υπάρχουν ακριβείς, γρήγορες και αποδοτικές του κόστους μέθοδοι προσδιορισμού. Οι μικροβιολογικές δοκιμασίες υιοθετούνται συχνά και χρησιμοποιούνται συστηματικά δεδομένου ότι χαρακτηρίζονται από τεχνική απλότητα και χαμηλό κόστος αναλώσιμων και εξοπλισμού. Εντούτοις, δεν έχουν αναπτυχθεί έως τώρα μικροβιολογικές δοκιμασίες προσδιορισμού της βορικοναζόλης σε περιπτώσεις χορήγησης συνδυαστικής θεραπείας αντιμυκητιακών για δύσκολα θεραπεύσιμες λοιμώξεις. Ως εκ τούτου, στο Κεφάλαιο 3.3 τα επίπεδα βορικοναζόλης προσδιορίστηκαν με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) και με μια νέα μικροβιολογική τεχνική διάχυσης σε άγαρ σε 103 δείγματα ορού προερχόμενα από ένα πρόγραμμα εξωτερικού ελέγχου ποιότητας (n=39), 21 ασθενείς υπό μονοθεραπεία βορικοναζόλης (n=39) και 7 ασθενείς που έλαβαν συνδυαστική θεραπεία βορικοναζόλης-εχινοκανδίνης (n=25). Τα αποτελέσματα της αναπτυχθείσας μικροβιολογικής μεθόδου συσχετίστηκαν σημαντικά με τα αντίστοιχα της HPLC (συντελεστής συσχέτισης Spearman >0.93, % διαφορά <12 ± 3.8%). Για πρώτη φορά στη διεθνή βιβλιογραφία αναπτύχθηκε μια μικροβιολογική μέθοδος βασιζόμενη στη διάχυση σε άγαρ για τον προσδιορισμό επιπέδων βορικοναζόλης σε δείγματα ορού ασθενών που λαμβάνουν συνδυαστική θεραπεία με εχινοκανδίνες, η οποία δίνει συγκρίσιμα αποτελέσματα με την HPLC.The emergence of azole resistance raises concerns about first-line voriconazole treatment in high-risk patients with suspected invasive aspergillosis. Alternative therapeutic options are limited. A treatment strategy of growing interest for this difficult-to-treat infection is the combination of antifungals from distinct drug classes. The concentration-effect feature of this investigation could be amenable to pharmacokinetic/pharmacodynamic (PK/PD) modeling as this approach may provide important information regarding the outcome. Accurate and validated in vitro PK/PD models may serve as useful tools in order to quantitatively assess the efficacy of combination therapy, while they can be used to perform more comprehensive experiments compared to animal models and clinical trials. In Chapter 2, a recently developed dynamic in vitro PK/PD model was evaluated based on the results obtained from a murine model of experimental aspergillosis using the same A. fumigatus strains and simulating mouse PK. Susceptibility breakpoints for voriconazole were then determined for different antifungal susceptibility testing methodologies applicable in the laboratory routine setting by simulating human PK and using A. fumigatus strains with distinct mechanisms of azole resistance. Moreover, the area under concentration-time curve (AUC) and trough levels of voriconazole in human serum required for optimal treatment and minimal toxicity were determined in relation to minimum inhibitory concentrations (MICs). The in vitro fAUC0-24/MIC associated with 50% antifungal activity was 28.61, close to the corresponding in vivo 14.67 fAUC0-24/MIC. Furthermore, the percentage target attainment was in agreement with the percentage efficacy in clinical trials of invasive aspergillosis in relation to CLSI MICs providing also a clinical correlation of the in vitro PK/PD model. The susceptible/ intermediate/resistant breakpoints were determined to be 0.25/0.5-1/2 mg/L for CLSI, 0.5/1-2/4 mg/L for EUCAST and 0.25/0.375-1/1.5 mg/L for gradient concentration strips. Hence, therapeutic drug monitoring could be used to optimize voriconazole therapy particularly against isolates with CLSI MICs of 0.5-1 mg/L and EUCAST MICs of 1-2 mg/L, targeting trough levels of 1 and 2 mg/L, respectively, whereas voriconazole should be avoided against isolates with CLSI and EUCAST MICs of >2 and >4 mg/L, respectively. Given the corroboration of the in vitro model with previous in vivo data, this tool may prove useful for predicting the in vivo outcome, while the determined susceptibility breakpoints and target values could assist in optimizing voriconazole therapy against A. fumigatus. After having optimized and validated the in vitro PK/PD model, as it reliably simulated voriconazole PK in human serum and correlated with in vivo outcomes observed in animal models and clinical trials, it was adapted to accommodate two drugs with different half-lives, thus enabling the study of drug combinations. Particularly, in Chapter 3.1, human serum concentration-time profiles of amphotericin B (q24h) and voriconazole (q12h) administered concomitantly were simulated in the in vitro system and the PD interactions against azole-susceptible and -resistant A. fumigatus strains were studied using Bliss independence and canonical mixture response surface analyses. In vitro PK/PD combination data were then combined with human PK data using Monte Carlo analysis and both target attainment rate and serum levels of combination therapy regimens were calculated for isolates with different MICs. Concentration-dependent interactions were found: synergy was observed at low amphotericin B-high voriconazole exposures, whereas antagonism was found at high amphotericin B-low voriconazole exposures for all isolates. By bridging in vitro PK/PD combination data with human PK, combination therapy resulted in 17 to 48% higher target attainment rates than those of monotherapy regimens for isolates with voriconazole/ amphotericin B MICs of 1 to 4 mg/L. The PD target was attained for combination regimens with a 1.1 tCmin/MIC for voriconazole and a 0.5 tCmax/MIC for amphotericin B, while the equally effective monotherapy regimens required a voriconazole tCmin/MIC ratio of 1.8 and an amphotericin B tCmax/MIC ratio of 2.8. Therapeutic drug monitoring could be employed to optimize antifungal combination therapy with low-dose (≤0.6 mg/kg) amphotericin B-based combination regimens against resistant isolates for minimal toxicity. In Chapter 3.2, the validated in vitro PK/PD model was used in order to investigate the PD effects of voriconazole/anidulafungin combination against A. fumigatus, including azole-resistant isolates, simulating human serum concentration-time profiles of standard and lower dosages of anidulafungin. PD interactions were assessed using Bliss independence analysis and Loewe additivity-based canonical mixture response-surface non-linear regression analysis. Target serum levels of combination regimens were determined for isolates with increasing MICs and target attainment rates were calculated for centers with different resistance rates using Monte Carlo analysis. Exposure- and MIC-dependent interactions were revealed: synergy was found at low anidulafungin (fCmax/MEC <10) and voriconazole (fAUC/MIC <10) exposures, whereas antagonism was observed at higher drug exposures. The largest increase in the probability of target attainment was found with 25 mg of anidulafungin and voriconazole MIC distributions with high (>10%) resistance rates, indicating that the combination of voriconazole with low-dose anidulafungin may increase the efficacy and reduce the cost and potential toxicity of antifungal therapy, particularly against azole-resistant A. fumigatus isolates and in patients with subtherapeutic serum levels. Based on the aforementioned results, therapeutic drug monitoring plays a critical role in the optimization of antifungal combination therapy, while its clinical use and value are related to accurate, rapid and cost-effective assays. Bioassays are frequently adopted and routinely performed because of their relative technical simplicity and low consumable and equipment costs. To date, there are no microbiological assays for measuring voriconazole serum concentration in patients on antifungal combination therapy for difficult-to-treat fungal infections. Hence, in Chapter 3.3 voriconazole levels were determined with high-performance liquid chromatography (HPLC) and a new microbiological agar diffusion assay in 103 serum samples from an HPLC-tested external quality control program (n=39), 21 patients receiving voriconazole monotherapy (n=39), and 7 patients receiving voriconazole-echinocandin combination therapy (n=25). The results of the bioassay were highly correlated with the HPLC results (Spearman's rank correlation coefficient >0.93, % difference <12 ± 3.8%). This is the first report in literature of a bioassay that can be used for measuring voriconazole serum concentration in the presence of echinocandins giving comparable results to HPLC

Βελτιστοποίηση αντιμυκητιακής θεραπείας έναντι στελεχών Aspergillus fumigatus ανθεκτικών στις αζόλες χρησιμοποιώντας ένα in vitro φαρμακοδυναμικό μοντέλο φαρμακοκινητικής προσομοίωσης

The emergence of azole resistance raises concerns about first-line voriconazole treatment in high-risk patients with suspected invasive aspergillosis. Alternative therapeutic options are limited. A treatment strategy of growing interest for this difficult-to-treat infection is the combination of antifungals from distinct drug classes. The concentration-effect feature of this investigation could be amenable to pharmacokinetic/pharmacodynamic (PK/PD) modeling as this approach may provide important information regarding the outcome. Accurate and validated in vitro PK/PD models may serve as useful tools in order to quantitatively assess the efficacy of combination therapy, while they can be used to perform more comprehensive experiments compared to animal models and clinical trials. In Chapter 2, a recently developed dynamic in vitro PK/PD model was evaluated based on the results obtained from a murine model of experimental aspergillosis using the same A. fumigatus strains and simulating mouse PK. Susceptibility breakpoints for voriconazole were then determined for different antifungal susceptibility testing methodologies applicable in the laboratory routine setting by simulating human PK and using A. fumigatus strains with distinct mechanisms of azole resistance. Moreover, the area under concentration-time curve (AUC) and trough levels of voriconazole in human serum required for optimal treatment and minimal toxicity were determined in relation to minimum inhibitory concentrations (MICs). The in vitro fAUC0-24/MIC associated with 50% antifungal activity was 28.61, close to the corresponding in vivo 14.67 fAUC0-24/MIC. Furthermore, the percentage target attainment was in agreement with the percentage efficacy in clinical trials of invasive aspergillosis in relation to CLSI MICs providing also a clinical correlation of the in vitro PK/PD model. The susceptible/ intermediate/resistant breakpoints were determined to be 0.25/0.5-1/2 mg/L for CLSI, 0.5/1-2/4 mg/L for EUCAST and 0.25/0.375-1/1.5 mg/L for gradient concentration strips. Hence, therapeutic drug monitoring could be used to optimize voriconazole therapy particularly against isolates with CLSI MICs of 0.5-1 mg/L and EUCAST MICs of 1-2 mg/L, targeting trough levels of 1 and 2 mg/L, respectively, whereas voriconazole should be avoided against isolates with CLSI and EUCAST MICs of >2 and >4 mg/L, respectively. Given the corroboration of the in vitro model with previous in vivo data, this tool may prove useful for predicting the in vivo outcome, while the determined susceptibility breakpoints and target values could assist in optimizing voriconazole therapy against A. fumigatus. After having optimized and validated the in vitro PK/PD model, as it reliably simulated voriconazole PK in human serum and correlated with in vivo outcomes observed in animal models and clinical trials, it was adapted to accommodate two drugs with different half-lives, thus enabling the study of drug combinations. Particularly, in Chapter 3.1, human serum concentration-time profiles of amphotericin B (q24h) and voriconazole (q12h) administered concomitantly were simulated in the in vitro system and the PD interactions against azole-susceptible and -resistant A. fumigatus strains were studied using Bliss independence and canonical mixture response surface analyses. In vitro PK/PD combination data were then combined with human PK data using Monte Carlo analysis and both target attainment rate and serum levels of combination therapy regimens were calculated for isolates with different MICs. Concentration-dependent interactions were found: synergy was observed at low amphotericin B-high voriconazole exposures, whereas antagonism was found at high amphotericin B-low voriconazole exposures for all isolates. By bridging in vitro PK/PD combination data with human PK, combination therapy resulted in 17 to 48% higher target attainment rates than those of monotherapy regimens for isolates with voriconazole/ amphotericin B MICs of 1 to 4 mg/L. The PD target was attained for combination regimens with a 1.1 tCmin/MIC for voriconazole and a 0.5 tCmax/MIC for amphotericin B, while the equally effective monotherapy regimens required a voriconazole tCmin/MIC ratio of 1.8 and an amphotericin B tCmax/MIC ratio of 2.8. Therapeutic drug monitoring could be employed to optimize antifungal combination therapy with low-dose (≤0.6 mg/kg) amphotericin B-based combination regimens against resistant isolates for minimal toxicity.In Chapter 3.2, the validated in vitro PK/PD model was used in order to investigate the PD effects of voriconazole/anidulafungin combination against A. fumigatus, including azole-resistant isolates, simulating human serum concentration-time profiles of standard and lower dosages of anidulafungin. PD interactions were assessed using Bliss independence analysis and Loewe additivity-based canonical mixture response-surface non-linear regression analysis. Target serum levels of combination regimens were determined for isolates with increasing MICs and target attainment rates were calculated for centers with different resistance rates using Monte Carlo analysis. Exposure- and MIC-dependent interactions were revealed: synergy was found at low anidulafungin (fCmax/MEC 10%) resistance rates, indicating that the combination of voriconazole with low-dose anidulafungin may increase the efficacy and reduce the cost and potential toxicity of antifungal therapy, particularly against azole-resistant A. fumigatus isolates and in patients with subtherapeutic serum levels. Based on the aforementioned results, therapeutic drug monitoring plays a critical role in the optimization of antifungal combination therapy, while its clinical use and value are related to accurate, rapid and cost-effective assays. Bioassays are frequently adopted and routinely performed because of their relative technical simplicity and low consumable and equipment costs. To date, there are no microbiological assays for measuring voriconazole serum concentration in patients on antifungal combination therapy for difficult-to-treat fungal infections. Hence, in Chapter 3.3 voriconazole levels were determined with high-performance liquid chromatography (HPLC) and a new microbiological agar diffusion assay in 103 serum samples from an HPLC-tested external quality control program (n=39), 21 patients receiving voriconazole monotherapy (n=39), and 7 patients receiving voriconazole-echinocandin combination therapy (n=25). The results of the bioassay were highly correlated with the HPLC results (Spearman's rank correlation coefficient >0.93, % difference 2 και >4 mg/L, αντίστοιχα. Δεδομένης της επιβεβαίωσης των αποτελεσμάτων του in vitro μοντέλου με προηγούμενα in vivo δεδομένα, το προκλινικό αυτό εργαλείο μπορεί να αποδειχθεί τελεσφόρο για την πρόβλεψη του in vivo αποτελέσματος, ενώ τα προτεινόμενα όρια ευαισθησίας και οι προσδιοριζόμενες τιμές-στόχοι θα μπορούσαν να συμβάλουν στη βελτιστοποίηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας.Κατόπιν της βελτιστοποίησης και επικύρωσης του in vitro ΦΚ/ΦΔ μοντέλου, δεδομένης της αξιόπιστης προσομοίωσης της ΦΚ της βορικοναζόλης στον ανθρώπινο ορό και της συσχέτισης με in vivo δεδομένα ζωικών μοντέλων και κλινικών δοκιμών, το σύστημα προσαρμόστηκε για την ταυτόχρονη μελέτη δύο φαρμάκων με διαφορετικούς χρόνους ημίσειας ζωής επιτρέποντας έτσι τη διερεύνηση του συνδυασμού τους. Συγκεκριμένα, στο Κεφάλαιο 3.1, προσομοιώθηκαν τα προφίλ συγκέντρωσης-χρόνου της αμφοτερικίνης Β (κάθε 24 ώρες) και της βορικοναζόλη (κάθε 12 ώρες) στον ανθρώπινο ορό και μελετήθηκαν οι ΦΔ αλληλεπιδράσεις που λαμβάνουν χώρα κατά τη συγχορήγηση τους έναντι ευαίσθητων και ανθεκτικών στις αζόλες στελεχών A. fumigatus χρησιμοποιώντας το κριτήριο ανεξαρτησία κατά Bliss και την ανάλυση επιφάνειας-απόκρισης κανονικών μειγμάτων. Ακολούθως, προκειμένου να γεφυρωθούν τα in vitro ΦΚ/ΦΔ δεδομένα με στοιχεία της ΦΚ στον άνθρωπο, διεξήχθη ανάλυση προσομοίωσης Monte Carlo, οπότε και προσδιορίστηκαν τόσο τα ποσοστά επίτευξης στόχου όσο και τα επίπεδα των συγχορηγούμενων φαρμάκων που απαιτούνται προκειμένου να επιτευχθεί η κλινικά σημαντική in vitro ΦΚ/ΦΔ παράμετρος για διαφορετικές MICs. Παρατηρήθηκαν δοσο-εξαρτώμενες αλληλεπιδράσεις: συνέργεια βρέθηκε κατά την έκθεση σε χαμηλές συγκεντρώσεις αμφοτερικίνης Β-υψηλές συγκεντρώσεις βορικοναζόλης, ενώ ανταγωνισμός σε υψηλές συγκεντρώσεις αμφοτερικίνης Β-χαμηλές συγκεντρώσεις βορικοναζόλης για όλα τα εξεταζόμενα στελέχη. Ο ΦΔ στόχος επιτεύχθηκε για σχήματα συνδυασμού με αναλογίες συγκέντρωσης φαρμάκου στον ορό/MIC 1.1 tCmin/MIC για τη βορικοναζόλη και 0.5 tCmax/MIC για την αμφοτερικίνη Β, ενώ για τα εξίσου αποτελεσματικά σχήματα μονοθεραπείας απαιτούνταν αναλογίες 1.8 tCmin/MIC και 3.4 tCmax/MIC, αντίστοιχα. Επεκτείνοντας τα in vitro ευρήματα στον άνθρωπο, o συνδυασμός αμφοτερικίνης Β-βορικοναζόλης είχε ως αποτέλεσμα 17 έως 48% υψηλότερα ποσοστά επίτευξης στόχου συγκριτικά με τις αντίστοιχες μονοθεραπείες, ιδιαίτερα στην περίπτωση στελεχών με βορικοναζόλη/αμφοτερικίνη Β MICs 1-4 mg/L. Η παρακολούθηση επιπέδων φαρμάκων θα μπορούσε να εφαρμοσθεί στοχεύοντας στη βελτιστοποίηση της συνδυαστικής θεραπείας με χαμηλής δόσης (≤0,6 mg/kg) αμφοτερικίνη Β-συνδυαστικά δοσολογικά σχήματα έναντι αζολο-ανθεκτικών στελεχών με την εμφάνιση ελάχιστης δυνατής τοξικότητας. Στο Κεφάλαιο 3.2, διερευνήθηκαν οι ΦΔ αλληλεπιδράσεις του συνδυασμού βορικοναζόλης-ανιντουλαφουγκίνης έναντι A. fumigatus, συμπεριλαμβανομένων αζολο-ανθεκτικών στελεχών, προσομοιώνοντας τα προφίλ επιπέδων ανιντουλαφουγκίνης-χρόνου στον ανθρώπινο ορό για την καθιερωμένη και χαμηλότερες δοσολογίες της με τη βοήθεια του επικυρωμένου in vitro ΦΚ/ΦΔ μοντέλου. Οι ΦΔ αλληλεπιδράσεις αναλύθηκαν με το κριτήριο ανεξαρτησίας κατά Bliss και τη μη-γραμμική ανάλυση επιφάνειας-απόκρισης κανονικών μειγμάτων βασισμένη στην προσθετικότητα κατά Loewe . Τα ποσοστά επίτευξη στόχου εκτιμήθηκαν για διαφορετικές δόσεις ανιντουλαφουγκίνης και για νοσοκομειακά κέντρα με αυξανόμενα ποσοστά αντοχής στις αζόλες με προσομοίωση Monte Carlo. Εντοπίστηκαν δοσο- και MIC-εξαρτώμενων αλληλεπιδράσεις: συνέργεια παρατηρήθηκε σε χαμηλές συγκεντρώσεις ανιντουλαφουγκίνης (fCmax/MΕC10%), υποδεικνύοντας ότι η χαμηλή δόση ανιντουλαφουγκίνης δύναται να ενισχύσει την αποτελεσματικότητα και να μειώσει το κόστος της συνδυαστικής θεραπείας, ιδιαίτερα έναντι αζολο-ανθεκτικών στελεχών A. fumigatus και σε ασθενείς με υποθεραπευτικά επίπεδα στον ορό.Βάσει των προαναφερθέντων αποτελεσμάτων, η παρακολούθηση επιπέδων φαρμάκων διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στη βελτιστοποίηση της αντιμυκητιακής συνδυαστικής θεραπείας, ενώ για να έχει κλινική αξία και λόγο να πραγματοποιηθεί πρέπει να υπάρχουν ακριβείς, γρήγορες και αποδοτικές του κόστους μέθοδοι προσδιορισμού. Οι μικροβιολογικές δοκιμασίες υιοθετούνται συχνά και χρησιμοποιούνται συστηματικά δεδομένου ότι χαρακτηρίζονται από τεχνική απλότητα και χαμηλό κόστος αναλώσιμων και εξοπλισμού. Εντούτοις, δεν έχουν αναπτυχθεί έως τώρα μικροβιολογικές δοκιμασίες προσδιορισμού της βορικοναζόλης σε περιπτώσεις χορήγησης συνδυαστικής θεραπείας αντιμυκητιακών για δύσκολα θεραπεύσιμες λοιμώξεις. Ως εκ τούτου, στο Κεφάλαιο 3.3 τα επίπεδα βορικοναζόλης προσδιορίστηκαν με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) και με μια νέα μικροβιολογική τεχνική διάχυσης σε άγαρ σε 103 δείγματα ορού προερχόμενα από ένα πρόγραμμα εξωτερικού ελέγχου ποιότητας (n=39), 21 ασθενείς υπό μονοθεραπεία βορικοναζόλης (n=39) και 7 ασθενείς που έλαβαν συνδυαστική θεραπεία βορικοναζόλης-εχινοκανδίνης (n=25). Τα αποτελέσματα της αναπτυχθείσας μικροβιολογικής μεθόδου συσχετίστηκαν σημαντικά με τα αντίστοιχα της HPLC (συντελεστής συσχέτισης Spearman >0.93, % διαφορά <12 ± 3.8%). Για πρώτη φορά στη διεθνή βιβλιογραφία αναπτύχθηκε μια μικροβιολογική μέθοδος βασιζόμενη στη διάχυση σε άγαρ για τον προσδιορισμό επιπέδων βορικοναζόλης σε δείγματα ορού ασθενών που λαμβάνουν συνδυαστική θεραπεία με εχινοκανδίνες, η οποία δίνει συγκρίσιμα αποτελέσματα με την HPLC

Comparative Evaluation of Vitek 2 and Etest versus Broth Microdilution for Ceftazidime/Avibactam and Ceftolozane/Tazobactam Susceptibility Testing of <i>Enterobacterales</i> and <i>Pseudomonas aeruginosa</i>

Ceftazidime/avibactam (CZA) and ceftolozane/tazobactam (C/T) are novel antibiotics with activity against multidrug-resistant Gram-negative pathogens. Nevertheless, resistance to both agents has been reported emphasizing the need for accurate and widely accessible susceptibility testing. In the present study, Vitek 2 and Etest CAZ and C/T MIC results for 100 non-repetitive clinical isolates (83 Enterobacterales and 17 P. aeruginosa, whereof 69 challenge isolates) were compared to the standard broth microdilution (BMD) method. EUCAST breakpoints were used for assessing the categorical (CA) and essential (EA) agreement between the methods along with the corresponding error rates. The Vitek 2 performance was comparable to that of BMD for testing both antimicrobial agents exceeding the ISO requirements (CA 98–99%, EA 96–100%, major errors (MEs) 0–1%, very major error (VMEs) 1%). Likewise, the Etest provided accurate results for CZA and C/T testing against Enterobacterales and P. aeruginosa, respectively (CA 100%, EA 97–100%, MEs 0%, VMEs 0%). On the contrary, EA of 85% and 6% VME rate were found for CZA Etest and P. aeruginosa. Overall, Vitek 2 measurements of CZA and C/T susceptibility correlated closely with the reference BMD, indicating that it can represent a suitable alternative to BMD for susceptibility testing of Enterobacterales and P. aeruginosa. The Etest did not fulfill the ISO performance criteria of EA and VME for CZA and P. aeruginosa. Further studies are needed to assess whether the Etest allows a reliable assessment of CZA and C/T EUCAST MICs

Comparative pharmacodynamics of echinocandins against aspergillus fumigatus using an in vitro pharmacokinetic/ pharmacodynamic model that correlates with clinical response to caspofungin therapy:Is there a place for dose optimization?

Echinocandins have been used as primary therapy of invasive aspergillosis (IA), with suboptimal results at standard dosing. Here, we explored the efficacy of dose escalation in a validated in vitro pharmacokinetic/pharmacodynamic (PK/PD) model. Six echinocandin wild-type (WT) and three non-WT A. fumigatus isolates were tested in an in vitro PK/PD model simulating anidulafungin, caspofungin, and micafungin exposures with a free drug maximum concentration (fC(max)) of 0.01 to 16 mg/liter and a half-life (t(1/2)) of 8 to 22 h. The relationship between the area under the dosing interval time-free drug concentration curve (fAUC(0–24))/minimum effective concentration (MEC) and % aberrant mycelium formation was analyzed. PK/PD indices associated with 50 to 99.99% maximal activity (EI(50) to EI(99.99)) were correlated with the clinical outcome of a 50-mg/day standard dose of caspofungin. The probability of target attainment (PTA) was calculated for different dosing regimens of each echinocandin via Monte Carlo analysis. A sigmoidal PK/PD relationship was found for WT isolates with EI(99) values of 766, 8.8, and 115 fAUC(0–24)/CLSI MEC for anidulafungin, caspofungin, and micafungin, respectively. No aberrant mycelia were observed for non-WT isolates, irrespective of their MEC and drug exposure. The EI(99), EI(99.9), and EI(99.99) values corresponded to 2-, 3-, and 4-log(10) formation of aberrant mycelia and correlated with survival, favorable, and complete response rates to caspofungin primary therapy in patients with IA. A very low PTA (<13%) was found for the standard doses of all echinocandins, whereas a PTA of ≥90% was found with 100 and 150 mg/day of caspofungin and 1,400 mg/day micafungin against WT isolates. For anidulafungin, the PTA for 1,500 mg/day was 10%. Among the three echinocandins, only caspofungin at 2 or 3 times the licensed dosing was associated with a high PTA. Caspofungin dose escalation might deserve clinical validation

Epidemiology and Incidence of COVID-19-Associated Pulmonary Aspergillosis (CAPA) in a Greek Tertiary Care Academic Reference Hospital

Introduction Invasive pulmonary aspergillosis is an emerging complication among intensive care unit (ICU) patients with COVID-19 (CAPA). In the present study, all CAPA cases during the first year of the pandemic were reviewed in critically ill patients at a 650-bed tertiary Greek COVID-19 reference hospital. Methods Data regarding patients admitted to the ICU of Attikon Hospital in Athens, Greece, between 22 March 2020 and 28 February 2021 with a positive PCR for SARS-CoV-2 infection were reviewed. Clinical and microbiological records were analysed including demographic, clinical, laboratory and radiological features, treatment and outcomes. CAPA was determined according to the recent 2020 ECMM/ISHAM definitions. Results A total of 179 patients were admitted in the ICU and 6 (3.3%) patients were diagnosed with CAPA (4 probable and 2 possible CAPA) with 5/6 with co-infection with multidrug-resistant (MDR) gram-negative pathogens. No patient had a history of immunosuppression. All suffered from acute respiratory distress syndrome. The median (range) time from intubation to diagnosis was 6 (1-14) days. Five patients had positive Aspergillus cultures in bronchial secretions (1 A. fumigatus, 1 A. flavus, 1 A. fumigatus + A. flavus, 1 A. fumigatus + A. terreus and 1 A. terreus) while culture was negative in one patient. All isolates were susceptible to antifungal drugs. Serum galactomannan (GM), pan-Aspergillus PCR and (1,3)-beta-d-glucan (BDG) were positive in 4/6 (67%), 5/6 (83%, 3/5 in two consecutive samples) and 4/6 (67%, in consecutive samples) patients, respectively. GM and PCR positive bronchial secretions had GM indices &gt; 9.95 and PCR C-t &lt; 34. All were treated with antifungal drugs with 5 out of 6 receiving isavuconazole. Mortality was 67% (4/6) with 1/4 attributed to CAPA (two died as a result of bacterial septic shock and one as a result of multiorgan failure). Conclusion The incidence of CAPA in ICU patients was 3.3% and it was associated with approximately a 17% attributable mortality in the setting of MDR gram-negative pathogen co-infections