Molecular characterization of mutations identified in genes related to different epilepsies

Orientador: Iscia Lopes CendesDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias MedicasResumo: A epilepsia acomete uma considerável parcela da população mundial (0,5 ? 1%). Dentre suas causas destacam-se as epilepsias idiopáticas e as malformações corticais, por possuírem uma base genética bem definida. As epilepsias idiopáticas possuem uma etiologia genética, mas na maioria das vezes nenhuma anormalidade estrutural é identificável. Já as malformações corticais são desordens conseqüentes de falhas no desenvolvimento do córtex cerebral, por isso também denominadas de distúrbios do desenvolvimento cortical (DDC). Analisando pacientes com Epilepsia de Lobo Temporal Lateral Autossômica Dominante (ELTLAD), nosso grupo localizou uma alteração no sítio de splicing no gene LGI1. Nosso grupo também descreveu uma mutação de sentido trocado no gene FLN1, em duas pacientes (mãe e filha) acometidas por Heterotopia Nodular Periventricular, um tipo de DDC. O objetivo principal desse projeto foi caracterizar, em nível molecular, essas alterações gênicas, como um primeiro passo na elucidação dos mecanismos destas desordens genéticas. Além disso, era nosso interesse observar se as alterações moleculares encontradas poderiam explicar a variabilidade clínica observada em nossos pacientes (Sheen et al., 2001; Parrini et al., 2004). Para tal, extraímos o RNAm dos pacientes portadores destas síndromes, convertendo-o em cDNA, que foi amplificado com primers específicos, e posteriormente seqüenciados. O RNAm dos pacientes acometidos por Heterotopia Nodular Periventricular foi extraído de sangue periférico. Já no caso de pacientes com EPADSA, obtivemos amostras de epiderme para obtenção do RNAm. Nossos experimentos indicam que o mecanismo molecular mais provável envolvido na mutação 1159G?C no gene FLN1 é destruição do sítio doador de splicing do intron 6, levando à manutenção do intron 6 durante o processamento do RNAm e a conseqüente aquisição de um codon de parada prematuro que resultaria na síntese de uma proteína truncada. Quanto à análise da mutação IVS7(-2)A?G no gene LGI1, infelizmente não fomos capazes de obter resultados conclusivos. O estudo in silico da proteína truncada que seria formada em decorrência da mutação no gene FLN1 prediz a perda de domínios funcionais essenciais da proteína. Além disso, encontramos evidências experimentais de que as diferenças clínicas encontradas nas duas pacientes que apresentam a mesma mutação em FLN1 (mãe e filha), podem em parte, ser explicadas por alterações no mecanismo de inativação randômica do cromossomo XAbstract: Epilepsy is a very frequent condition, been present in around 0.5 to 1% of human population. Among the most frequent causes of epilepsy we can identify genetic predisposition to seizures and cortical malformations. The idiopathic epilepsies are regarded as caused by genetic mechanisms, most of them with no structural abnormalities being detected. By the other hand, malformations of cortical development (MCD) are the result of abnormalities during the normal developmental stages of the brain and will generally result in identifiable brain structural abnormalities. We studied patients with a form of temporal lobe named autosomal dominant partial epilepsy with auditory features (ADPEAF) and identified a splicing site mutation in the LGI1 gene. In addition, we identified a point mutation in the FLN1 gene in two patients (mother and daughter) with a type of MCD, periventricular nodular heterotopia. The main objective of this project was to characterize the molecular defect resulting from both mutations, as well as to investigate if these mechanisms could explain the clinical variability observed in our patients. We extracted mRNA from patients carrying both mutations for subsequent synthesis of cDNA. In patients with FLN1 mutation mRNA was obtained from peripheral blood and in patients with LGI1 mutation mRNA extractions were attempted from skin fibroblasts. Our results indicate that the molecular mechanism involved in the FLN1 1159G?C mutation is probably the destruction of the splicing donor site at intron 6, leading to the its transcription during mRNA processing, which, in turn, will add a premature stop codon resulting in a truncated protein. Unfortunately we were unable to obtain conclusive results in the LGI1 experiments. In addition, in silico prediction studies o the truncated FLNI1 protein shows that important functional domains are lost in the resulting mutated form. Furthermore, we found experimental evidence that the clinical variability observed in the two patients with FLN1 mutation could be explained, at least in part, by abnormal skewed X chromosome inactivationMestradoNeurocienciasMestre em Fisiopatologia Médic

MONITORAMENTO TECNOLÓGICO RELACIONADO A GENES E PROTEÍNAS DA TEIA DE ARANHAS NO INCREMENTO ESTRUTURAL DE MATERIAIS

Componentes estruturais encontrados na natureza há muito inspiram estudiosos no desenvolvimento de novos produtos. As teias de aranhaunem características de grande interesse para as ciências de materiais, o que tem encorajado muitos grupos a buscar protocolos para sua produção heteróloga, além de explorar detalhes de sua estrutura física e molecular. Esse trabalho realizou o monitoramento tecnológico, tanto da produção, quanto da utilização de proteínas de seda de aranha, entre os anos de 2002 e 2013, permitindo traçar um panorama com os principais autores, instituições e países atuantes na área. Os resultados mostraram que tanto a produção do conhecimento como a geração de tecnologias relacionadas a proteínas de seda de aranha são realizadas principalmente pelos Estados Unidos, China, Alemanha e Reino Unido. Também foi possível concluir que a tecnologia e seu modo de produção ainda necessitam de uma série de adaptações para o estabelecimento de produtos viáveis

Genetics and molecular study in group of patients with malformations of cerebral cortex

OBJECTIVES: Malformations of cerebral cortex (MCC) are an important cause of epilepsy. Our main goals were: to search for mutations in genes responsible for MCC (FLN1, LIS1, DCX and EMX2), to map the locus for familial perisylvian polymicrogyria and to investigate the molecular mechanisms of the mutations identified. Methods: Mutation screening was performed by PCR, DHPLC and sequencing. HUMARA and Real Time PCR were performed to study the molecular mechanisms of mutations. Linkage analysis was carried out by PCR, Fragment profiler® and MLINK® software. RESULTS: Deleterious mutations were identified in 3/108 patients. We found a G987C splicing mutation in the FLN1 in two related patients with periventricular nodular heterotopia. Skewed X-chromosome inactivation was detected as the possible mechanism responsible for clinical differences observed in the two patients. An A1385C transversion (H277P) in LIS1 was identified in one patient with lisencephaly. Only neutral variants were identified in DCX and EMX2. Linkage analysis has detected a locus in Xq27.2-Xq27.3 for familial polymicrogyria. CONCLUSION: We believe that the low frequency of mutations identified may be due to mosaicism, mutations in non-coding regions, deletions and patients with atypical neuroimaging findings. Deleterious mutations in EMX2 were not found in patients with schizencephaly and polymicrogyria. We found a locus for familial perisylvian polymicrogyria in Xq27.2-Xq27.3.OBJETIVOS: As malformações do córtex cerebral (MCC) são uma causa importante de epilepsia. Nossas metas foram: triagem de mutações em genes associados às MCC (FLN1, LIS1, DCX e EMX2), investigar funcionalmente as mutações e mapear o locus para polimicrogiria perisylviana familiar. MÉTODOS: A triagem de mutações foi realizada por PCR, DHPLC e sequênciamento. Estudo funcional foi realizado por RT-PCR, PCR em tempo real e HUMARA. O estudo de ligação foi realizado por PCR e análise com programas Fragment Profiler® e MLINK®. RESULTADOS: Mutações deletérias foram identificadas em 3/108 pacientes. Uma mutação de splicing (G987C) em FLN1 foi identificada em duas pacientes aparentadas com heterotopia nodular periventricular. Mudança no padrão de inativação do cromossomo X é responsável pelas diferenças clínicas entre as pacientes. Uma substituição A1385C (H277P) foi identificada em LIS1 em um indivíduo com lissencefalia. Alterações neutras foram identificadas em DCX e EMX2. A análise de ligação identificou um locus em Xq27.2-Xq27.3 para polimicrogiria familiar. CONCLUSÃO: Mosaicismo, mutações em regiões não codificantes, deleções, rearranjos e casos atípicos podem estar contribuindo para a baixa freqüência de mutações identificadas. Esquizencefalia e polimicrogiria parecem não ter base genética relacionada com o gene EMX2. Um novo locus candidato em Xq27.2-Xq27.3 foi identificado para polimicrogiria perisylviana familiar.101105Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES

Strategy of molecular investigation on epilepsy with the identification of genes related to poymicrogyrias

Orientador: Iscia Teresinha Lopes Cendes, Fábio Rossi TorresTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências MédicasResumo: A polimicrogiria (PMG) é uma malformação do córtex cerebral causada por falhas no seu desenvolvimento, caracterizando-se por um número excessivo de pequenos giros e laminação anormal, dando à superfície cortical uma aparência irregular e grosseira. A gravidade de suas manifestações clínicas se relaciona diretamente com a extensão da malformação e das regiões cerebrais afetadas, sendo que a presença de lesões bilaterais ou unilaterais extensas indica um pior prognóstico. Uma das síndromes de polimicrogiria mais frequentes e, consequentemente, mais bem descritas clinicamente, é a polimicrogiria perisylviana bilateral (PPB). Essa forma de polimicrogiria atinge a região que tange a fenda Sylviana, podendo apresentar-se tanto unilateralmente quanto em ambos os hemisférios. O padrão de herança da PPB foi descrito inicialmente como ligada ao cromossomo X por Borgatti et al. em 1999. Já em 2000, Guerreiro et al. confirmaram o padrão de herança consistente com herança ligada ao cromossomo X, mas ainda nenhum gene havia sido identificado como responsável pelo distúrbio. Nosso grupo recentemente mapeou uma nova região candidata para a PPB em Xq27.1-q27.3, e esta tese se propôs a avaliar essa região através da técnica de sequenciamento em larga escala aliada à tecnologia de captura para o cromossomo X. Os resultados apontaram como potenciais patogênicos os genes MAGEC1, UBE2NL, além da região do gene SPANXC, todos localizados na região candidata, mas uma avaliação mais detalhada levantou a hipótese de uma relação complexa entre as alterações encontradas no gene MAGEC1 e o quadro clínico dos pacientes. Além da análise da região Xq27.1-q27.3, considerando o grande número de genes de microtúbulo que tem sido relacionado a malformações do córtex cerebral, esse trabalho também avaliou pacientes esporádicos e famílias com histórico de PPB realizando triagem de mutações nas regiões codificantes dos genes AFF2, SLITRK2 e SLITRK4, localizados na região candidata, nos genes de microtúbulo TUBA1A, TUBB2B e TUBA8, além dos genes SRPX2 e WDR62, presentes em trabalhos na literatura de malformações corticais. A triagem foi realizada utilizando as técnicas de DHPLC e de sequenciamento utilizando a técnica de Sanger por eletroforese capilar. Foi encontrada uma alteração potencialmente patogênica no gene AFF2. As alterações identificadas neste estudo que resultam em troca de aminoácidos foram avaliadas utilizando as ferramentas in silico MutPred, SNPs&GO, Polyphen 2, Panther e SIFT, de forma a fornecer mais informações a respeito de seu potencial patogênico. Além disso, as variantes inéditas identificadas nesse trabalho foram estudadas em uma amostra de indivíduos normais (grupo controle). Com esses dados foi possível sugerir que algumas dessas variantes encontradas possuem potencial patogênico que deve ser futuramente investigado através de estudos funcionaisAbstract: Polimicrogyria (PMG) is a cortical malformation caused by failures during the brain cortex development process and is characterized by an excessive number of small gyri, resulting in an irregular cortical surface. The severity of its clinical manifestations is directly related to the extension of the tissue abnormalities. Bilateral Perisylvian Polimicrogyria (BPP) is the most comum and, consequently, a very well described syndrome that affects the cortex surrounding the Sylvian fissures in both hemispheres. The genetic pattern for BPP was initially described by Borgatti et al. as an X-linked pattern, confirmed by Guerreiro et al. in 2000, but with no specific gene identified. We have recently described a candidate site for BPP at the Xq27.1-27.3 region and, in this project, we proposed to evaluate this site through next generation sequencing technology combined with capture technology. Our results suggest that MAGEC1 and UBE2NL genes, or the SPANXC gene area might be related to the pathogeny in this case, however a further analysis brought up the hypothesis of a complex relation between the MAGEC1 mutations and the clinical manifestations in each different patient. Considering recurrent description of relations between microtubule genes and cortex malformations, we also performed the evaluation of exon regions of eight selected genes from sporadic patients and BPP families through DHPLC and sequencing. The analysis focused on AFF2, SLITRK2 and SLITRK4 genes, located at the identified site, microtubule genes TUBA1A, TUBB2B and TUBA8, and SRPX2 and WDR62 genes, also related to cortical malformations. As a result from this screening, we identified a potentially pathogenic mutation in gene AFF2. All non-synonymous SNPs were evaluated using the in silico tools MutPred, SNPs&GO, Polyphen 2, Panther and SIFT, providing further insights for their analysis. A control group of individuals was analyzed for the presence of the non-described SNPs. These data suggest a pathogenic potential for these genetic alterations that must be investigated through function studiesDoutoradoFisiopatologia MédicaDoutora em Ciência