15 research outputs found
A novel proteasome inhibitor acting in mitochondrial dysfunction, ER stress and ROS production
In cancer-treatment, potentially therapeutic drugs trigger their effects through apoptotic mechanisms. Generally, cell response is manifested by Bcl-2 family protein regulation, the impairment of mitochondrial functions, and ROS production. Notwithstanding, several drugs operate through proteasome inhibition, which, by inducing the accumulation and aggregation of misfolded or unfolded proteins, can lead to endoplasmic reticulum (ER) stress. Accordingly, it was shown that Amblyomin-X, a Kunitz-type inhibitor identified in the transcriptome of the Amblyomma cajennense tick by ESTs sequence analysis of a cDNA library, obtained in recombinant protein form, induces apoptosis in murine renal adenocarcinoma (RENCA) cells by: inducing imbalance between pro- and anti-apoptotic Bcl-2 family proteins, dysfunction/mitochondrial damage, production of reactive oxygen species (ROS), caspase cascade activation, and proteasome inhibition, all ER-stress inductive. Moreover, there was no manifest action on normal mouse-fibroblast cells (NHI3T3), suggesting an Amblyomin-X tumor-cell selectivity. Taken together, these evidences indicate that Amblyomin-X could be a promising candidate for cancer therapy.Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)Uniao Quimica Farmaceutica NacionalConselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e Tecnológico (CNPq)Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de NÃvel Superior (CAPES)Inst Butantan, Lab Bioquim & Biofis, BR-05503900 São Paulo, BrazilUniversidade Federal de São Paulo, Dept Bioquim, São Paulo, BrazilInst Butantan, Programa Posgrad Interunidades Biotecnol, USP, IPT, BR-05503900 São Paulo, BrazilUniv São Paulo, Fac Med, Lab Oncol Expt LIM24, São Paulo, BrazilUniversidade Federal de São Paulo, Dept Bioquim, São Paulo, BrazilFAPESP: FAPESP 2010/52669-3FAPESP: CAT/CEPID - 1998/14307-9Web of Scienc
Oviposition and eclosion periods of Ixodes didelphidis Fonseca and Aragão, 1951 (Acari: Ixodidae) under laboratory conditions
Kinetics and functional caracterization of inhibitor of the FXa blood coagulation from glands salivary from tick Amblyomma cajannense (Acari: Ixodidae) (Fabricius, 1787)
Muitas substâncias anticoagulantes provenientes da secreção salivar e das glândulas salivares de diversas espécies de carrapatos têm sido relatadas. Através de métodos de bioquÃmica clássica, previamente foram isolados da saliva do carrapato Amb!Jomma eqjenneme 2 inibidores de FXa, um de trombina e outro da agregação plaquetária. No presente trabalho, um inibidor de FXa foi isolado da saliva através de uma cromatografia de troca iônica em resina Resource -Q (Sistema FPLC- GE), o qual foi denominado INFXa, é capaz de inibir a atividade amidolÃtica do FXa sobre o substrato cromogênico especÃfico S-2765 (IC50 = 0,2 /-lg) de maneira dose-resposta além de prolongar o tempo de tromboplastina parcial ativada do plasma humano. A inibição do FXa não é alterada pelo INFXa na presença do zimogênio (FX). Através de um gel bidirnensional da saliva 110 spots foram revelados, sendo que suas massas moleculares variaram de 110 a 9 kDa e o pl entre 3.5 a 9.6. Entretanto, uma maior quantidade de proteÃnas se localizaram entre pl de 4.0 a 7.0 sugerindo um caráter mais ácido à saliva. As seqüências de aminoácidos de oito spots foram obtidas através da espectrometria de massa (MALDI-TOF e Q-TOF), as quais apresentaram similaridade com hemoglobina de manúferos, mas não com inibidores já conhecidos. A partir de uma biblioteca de cDNA das glândulas salivares do carrapato Amb!Jomma cajennense foi previamente clonado e expresso um importante inibidor denominado Amblyomin X, que inibe o FXa da coagulação como induz a remissão de tumor de melanoma implantado em camundongo, sem contudo afetar células normais. O Amblyomin-X foi inicialmente expresso em E.eoli transformada com o vetor de pAE o qual insere uma cauda de 6 resÃduos de histidina à molécula. Como o Amblyomin-X foi obtido contendo cauda de poli histidina o que dificulta a validação do sistema para testes pré-clÃnicos. Neste trabalho avaliou a expressão de Amblyomin-X expresso em PÚhia pastoris. O inibidor foi então expresso em sistema de levedura utilizando a Piehia pastoris tendo como vetor o pPIC9K. Este sistema oferece a vantagem de produzir o inibidor sem a cauda de histidina e ser um processo escalonável. Foram produzidos 5,0 litros do inibidor em um fermentador. O Amblyomin-X foi separado do meio de cultura por dois processos distintos de clarificação, por membranas de fibra oca e por centrifugação, ambos os materiais foram parcialmente purificados através de uma cromatografia de troca iônica em resina Source Q (Sistema AKTA purifier - GE) em sistema rastreável e validado. O Amblyomin-X expresso em de levedura inibiu a atividade amidolÃtica do FXa sobre o substrato cromogênico S-2765 (Ki= 0,6 uM), e prolongou o tempo de tromboplastina parcial ativada de maneira dose-dependente, a inibição do FXa foi alterada pelo Amblyomin-X na presença do zimogênio (FX) na reação, reproduzindo as atividades encontradas no Amblyomin-X expresso...(au).BV UNIFESP: Teses e dissertaçõe
Characterization of blood coagulation and platelet aggregation inhibitors present in the saliva of tick Amblyomma cajennense (Acari: Ixodidae) (Fabricius, 1787)
Os carrapatos constituem um dos mais importantes grupos de artropode parasitas hematofagos de animais domesticos, silvestres e do homem. 0 Amblyomma cajennese constitui uma das principais especies de vetores de varios patogenos causadores de doencas como a babesiose, febre maculosa e Lyme simile. Objetivo: Avaliar a atividade da saliva do carrapato Amalyomma cajennese sobre os mecanismos de coagulacao, agregacao de plaquetas e fibrinolise, alem de isolar e caracterizar um inibidor de Fator Xa, um inibidor de trombina e um inibidor de agregacao plaquetaria. Metodos: A obtencao da saliva bruta foi realizada seguindo o metodo de Tatchell modificado. A atividade inibitoria sobre FXa e trombina, tanto da saliva bruta quanto das fracoes obtidas apos cromatografia foram avaliadas utilizando-se os substratos cromogenicos S-2765 e S-2238 respectivamente; a atividade fibrinolitica foi verificada em placas de fibrina humana, contendo plasminogenio e a inibicao da agregacao plaquetaria foi verificada tanto em PRP (induzida por ADP, colageno, ristocetina e acido araquidonico) quanto em plaquetas lavadas (induzida por colageno. Tanto o p1 quanto as massas moleculares das proteinas da saliva foram determinados por eletroforese bi-dimensional. 0 fracionamento das proteinas da saliva foi realizado atraves de cromatografia de troca ionica (Resource Q) eluida com um gradiente linear de NaCI (0-500mM), as fracoes com atividade inibitoria sobre FXa, trombina e agregacao plaquetaria foram separadas em pools, sendo que o Plli que apresentava atividade inibitoria sobre o FXa foi submetido a uma gel filtracao (TSK gel 2000 sw) e o material obtido denominado Amblyomim-X. A capacidade inibitoria do Amblyomin-X foi analisada frente diferentes condicoes (efeito de ions calcio, presenca de deferentes concentracoes do inibidor, diferentes tempos de incubacao e na presenca de componentes do complexo protrombinase). Resultados: A saliva bruta inibiu o FXa, a trombina e a agregacao plaquetaria, e um inibidor de FXa de cerca de 67kDa, denominado Amblyomin-X foi isolado. 0 Ambiyomin-X inibiu de forma eficiente e rapida o FXa isolado (IC50 de 4,7gg) e tambem inibiu a geracao de trombina no complexo protrombinase de forma dose...(au)BV UNIFESP: Teses e dissertaçõe
Oviposition and eclosion periods of Ixodes didelphidis Fonseca and Aragão, 1951 (Acari: Ixodidae) under laboratory conditions
Oviposition and eclosion periods for Ixodes didelphidis were observed under two temperatures (25ºC and 27ºC) and 90-95% humidity. Although there was a significant increase in the eclosion period (p<0.05) and a tendency to increase the oviposition period at 25ºC, there was neither significant differences in the interval (days), until maximum peak of eclosion nor in the number of emerging larvae during the peak nor the total number of emerged larvae. These temperature values are not critical for embryological development of the species. Because at 27ºC and under high humidity the oviposition and eclosion periods are shorter, and the percentage of emerged larvae is higher, we consider this to be the ideal temperature for laboratory studies
Ornithodoros cerradoensis n. sp. (Acari: Argasidae), a member of the Ornithodoros talaje (Guérin-Méneville, 1849) group, parasite of rodents in the Brazilian Savannah
Ornithodoros cerradoensis n. sp. is described from field-collected and laboratory reared nymphs, males, females, and larvae parasitizing the rodents Cavia aperea and Thrichomys sp. in the Brazilian Savannah. This new species is morphologically and genetically related with the Ornithodoros talaje group and can be separated from other Neotropical species using the following combination of characters: larva with 18 pairs of setae on dorsum (seven anterolateral, four central and seven posterolateral), hypostome with median dentition 2/2; adults provided with large mammillae; dorsal disks surrounded by bulked marginal ridges delimiting barely pebbled areas; three disks in the anterolateral file, and median disk not merging with the posteromedian file. Feeding assays in the laboratory demonstrated that (1) larvae of O. cerradoensis are slow-feeders (∼6 days), (2) first nymphal instar (N1) molts to second instar (N2) without feeding, and (3) N2 and third nymphal instar (N3) engorge rapidly (minutes). With the exception of Ornithodoros hasei nymphs that depict flattened bodies, O. cerradoensis N1, N2, and N3 highly resemble homologous instars of other species in O. talaje sensu lato, therefore are not suitable for morphological comparisons within the group. In addition to morphological signature of larvae and adults that separate this new species; results of cross-mating attempts between O. cerradoensis and Ornithodoros guaporensis a morphologically and phylogenetically closely related species that also parasitizes rodents in the Brazilian Savannah; a Principal Component Analysis using larval characters; and a phylogenetic analysis using mitochondrial markers, support O. cerradoensis as an independent lineage within the Ornithodorinae.EEA RafaelaFil: Muñoz-Leal, Sebastián. Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal; BrasilFil: Martins, Maria Marlene. Universidade Federal de Uberlândia. Faculdade de Medicina Veterinária. Laboratório de Ixodologia; BrasilFil: Nava, Santiago. Instituto Nacional de TecnologÃa Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Rafaela; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones CientÃficas y Técnicas; ArgentinaFil: Landulfo, Gabriel Alves Lves. Instituto Butantan. Laboratório de Parasitologia; BrasilFil: Simons, Simone Michaela. Instituto Butantan. Laboratório de Parasitologia; BrasilFil: Rodrigues, VinÃcius Da Silva. Universidade Federal de Uberlândia. Faculdade de Medicina Veterinária. Laboratório de Ixodologia; BrasilFil: Ramos, Vanessa Do Nascimento. Universidade Federal de Uberlândia. Faculdade de Medicina Veterinária. Laboratório de Ixodologia; BrasilFil: Suzin, Adriane. Universidade Federal de Uberlândia. Faculdade de Medicina Veterinária. Laboratório de Ixodologia; BrasilFil: Szabó, MatÃas P.J. Universidade Federal de Uberlândia. Faculdade de Medicina Veterinária. Laboratório de Ixodologia; BrasilFil: Labruna, Marcelo B. Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal; Brasi
A new tick Kunitz type inhibitor, Amblyomin-X, induces tumor cell death by modulating genes related to the cell cycle and targeting the ubiquitin-proteasome system
The aim of this study was to evaluate the anti-tumor activity of Amblyomin-X, a serine protease Kunitz-type inhibitor. Amblyomin-X induced tumor mass regression and decreased number of metastatic events in a B16F10 murine melanoma model. Alterations on expression of several genes related to cell cycle were observed when two tumor cell lines were treated with Amblyomin-X. PSMB2, which encodes a proteasome subunit, was differentially expressed, in agreement to inhibition of proteasomal activity in both cell lines. In conclusion, our results indicate that Amblyomin-X selectively acts on tumor cells by inducing apoptotic cell death, possibly by targeting the ubiquitin-proteasome system. (C) 2010 Elsevier Ltd. All rights reserved
Immobilized Kidney 28-kDa Endostatin- Related (KES28kDa) Fragment Promotes Endothelial Cell Survival
Background/Objective: Renal ischemia-hypoxia is a leading cause of acute kidney injury (AKI). Ischemia causes extracellular matrix breakdown of the tubular basement membrane. Endostatin (ES) is the C-terminal fragment of collagen XVIII generated by proteolytic cleavage. Recent studies have demonstrated that ES expression is upregulated in ischemic kidneys. the present study aimed to characterize ES from ischemic kidneys. Methods: Ischemic renal failure was induced via 45 min of occlusion of the left renal artery and vein. After the ischemic period, blood was collected. Kidneys were harvested and used for immunohistochemical testing and protein extraction. Three-step purification was used. Soluble and immobilized purified ES were tested in cell viability and adhesion assays. Results: the soluble KES28kDa inhibited endothelial cell proliferation: 25 versus 12.5 mu g (p < 0.05); 12.5 versus 3.15 mu g (p < 0.05). Immobilization of KES28kDa supports endothelial cell survival over the control p = 0.021). Human umbilical vein endothelial cells plated on immobilized KES28kDa showed an increase in membrane ruffles and stress fibers. Conclusion: These data demonstrate the local synthesis of a 28-kDa ES-related fragment following AKI and suggest its role in endothelium survival. Copyright (C) 2010 S. Karger AG, BaselFundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)CNEN SP, IPEN, Ctr Biotechnol, Energy & Nucl Res Inst, BR-05508000 São Paulo, BrazilUniversidade Federal de São Paulo, Discipline Nephrol, São Paulo, BrazilUniv São Paulo, Butantan Inst, Biochem & Biophys Lab, São Paulo, BrazilUniv São Paulo, Dept Cell & Dev Biol, Inst Biomed Sci, São Paulo, BrazilUniv São Paulo, Dept Surg, São Paulo, BrazilUniversidade Federal de São Paulo, Discipline Nephrol, São Paulo, BrazilFAPESP: 2007-51204-4Web of Scienc