Estatística em biologia molecular: o passado, o presente e o futuro

Vivemos na era mais mensurável da história. Na era do petabyte (1000 terabytes) o desafio não é mais o armazenamento de dados, é dar-lhes sentido. Sendo esta a era da revolução dos dados, a respetiva análise torna-se parte integrante de várias ciências. Por exemplo, a biologia molecular deixa de ser uma ciência onde os biólogos estudam um gene de cada vez, para passar a produzir milhares (agora milhões) de medições por amostra para analisar. Além disso, ao contrário da análise do ADN, que é estática, a análise da expressão genética é dinâmica, uma vez que nos vários tecidos expressam-se genes diferentes. O geneticista John Craig Venter, sequenciava organismos isolados, mas com o aparecimento de novas tecnologias e computadores com elevada capacidade de memória, que permitem a análise de dados bastante complexos, passou a estudar ecossistemas inteiros: sequenciação dos microorganismos do oceano, desde 2003, e do ar, desde 2005. A complexidade dos dados é ainda potenciada pelas novas tecnologias que, ao surgirem, são ainda pouco exploradas, produzindo dados com mais ruído dos que as anteriores. Esta complexidade e grau de variabilidade fazem com que a estatística seja um importante e inequívoco contributo na análise. Na realidade, o papel da estatística na biologia molecular vai além de uma mera intervenção. Trata-se de um pilar indissociável desta ciência! A estatística tem vindo a conquistar o seu espaço nesta nova área, tornando-se uma componente essencial de mérito reconhecido

Rastreio de estratégias terapêuticas num modelo de ratinho da doença de Machado-Joseph: foco na proteostase

Tese de Doutoramento em Ciências da SaúdeMachado-Joseph Disease (MJD) belongs to the group of nine Polyglutamine (PolyQ) diseases, which are characterized by the appearance of misfolded protein species, protein aggregates, neuronal dysfunction and ultimately cell death, of which is triggered by the presence of an expanded CAG repeat in the respective disease-causing genes. Along with the pathogenic motif, all these disease-associated proteins are widely expressed but the diseases only affect specific subsets of neurons. So far there is no effective treatment available for these disorders. Because the pathogenic mechanism(s) underlying MJD are poorly understood, which might be hampering the progression of effective therapeutical targets, this work focused on the search for new therapies based on hypotheses, that additionally allow the study of molecular mechanism(s) of disease. For this, we used the CMVMJD135 mouse model, which recapitulates the human disease both at the phenotypic and neuropathologic levels. We tested the efficacy of several compounds acting on different aspects of cellular function: (i) molecular chaperone load, (Hsp90 inhibitor - 17-dimethyl aminoethylamino-17-demethoxygeldanamycin hydrochloride - 17-DMAG); (ii) autophagy (lithium chloride and a combination of lithium chloride – LiCl - and temsirolimus - CCI-779); (iii) Endoplasmic reticulum (ER) stress response, (taroursodeoxycholic acid - TUDCA), also known to have multiple actions in the cells, and (iv) the energy status in the cell (creatine). Chronic treatment of CMVMJD mice with 17-DMAG resulted in a delay in progression of the motor coordination deficits and a reduction in neuropathology. While we observed limited induction of heat-shock proteins with treatment, we found evidence that 17-DMAG could be acting through autophagy, as levels of LC3-II and beclin-1 were induced in the brain of treated animals. This resulted in decreased levels of the mutant ataxin-3 (ATXN3) and reduced intranuclear aggregation of this protein. To further test autophagy induction as potential therapeutic approach for MJD, we tested LiCl alone and a combination of LiCl with CCI-779 (m-TOR independent and dependent inducers, respectively). In spite of activating autophagy, as suggested by the increased levels of Beclin-1, Atg7, and LC3- II, and a reduction in the p62 protein levels, lithium had no overall beneficial effects in MJD model concerning motor performance. Furthermore, the combined therapy using LiCl and CCI-779 proved to be deleterious to both WT and transgenic animals, failing to rescue their neurological symptoms in the first and exerting in neurotoxic effects in the latter. TUDCA is an orally bioavailable and BBB permeable bile acid with known neuroprotective action, through its anti-amyloidogenic and chemical chaperone activities and its ability to modulate apoptotic pathways. In addition, TUDCA is FDA-approved for chronic use in humans to treat liver disorders, but has also been shown to be beneficial in several models of different neurodegenerative diseases. In the CMVMJD135 model, TUDCA delayed the onset of disease and improved the motor phenotype, including balance, motor coordination and gait parameters, and ameliorated neurological reflexes, exploratory movement deficits and muscular strength problems. Although TUDCA treatment did not reduce the ATXN3 aggregate load in the brain, it normalized the RNA levels of TNF-α, Il1β and Il10 in the brainstem and reduced the astrogliosis in the substantia nigra and brainstem. These results demonstrated the therapeutic efficacy of TUDCA supplementation for MJD, most likely mediated by its anti-inflammatory properties, making this compound an attractive for the treatment of neurodegenerative diseases, including MJD.Lastly, we tested the efficacy of creatine, another naturally-occurring compound known to balance energy status in the cell. Creatine-supplemented diet led to an overall improvement in the motor phenotype of CMVMJD135 mice, namely improved motor coordination, limb strength and gait quality, and amelioration of some neurological parameters such as tremors and abnormal reflexes. Remarkably, chronic creatine treatment delayed the onset of several symptoms and, in some cases, completely abolished their appearance, supporting creatine supplementation as a useful strategy to slow the progression of MJD. In summary in this work we validated a new MJD mouse model for use in preclinical trials as a powerful tool to study simultaneously pathogenic mechanisms associated with the disease and to develop novel therapeutic strategies. Furthermore, we found that Hsp90 inhibitors, TUDCA and creatine are relevant therapeutic candidates for MJD, some of which could be advanced to clinical trials in MJD patients.A doença de Machado Joseph (DMJ) pertence ao grupo de nove doenças poliglutaminas em que o gene causador da doença possui uma expansão anómala do codão CAG. A presença desta expansão conduz ao aparecimento de espécies proteicas com conformação incorreta, agregados proteicos, disfunção neuronal e consequentemente, morte celular. Para além da expansão, todos os genes associados a este grupo de doenças possuem expressão ubíqua apesar de só afetarem subconjuntos específicos de neurónios. Atualmente, não existe tratamento eficaz para a DMJ. Uma das razões pelas quais há um atraso no desenvolvimento de alvos terapêuticos está relacionada com o conhecimento incompleto do(s) mecanismo(s) de patogénese associados à DMJ. Assim sendo, o objetivo deste estudo centrou-se na procura de novas terapias, usando uma abordagem baseada em hipóteses, que pode também permitir o estudo dos mecanismo(s) moleculares da doença. Para tal, foi usado o modelo de ratinho CMVMJD135 que recapitula a doença humana a vários níveis, nomeadamente fenotípico e neuropatológico. Testámos a eficácia de diversos compostos com alvos terapêuticos relacionados com diferentes funções celulares: (i) níveis de chaperones moleculares (inibidor de Hsp90 – 17-dimetil aminoetillamino 17- demetoxigeldanamicina - 17-DMAG); (ii) autofagia (cloreto de lítio e combinação de cloreto de lítico –LiCL e temsirolimus - CCI-779); (iii) resposta ao stress do retículo endoplasmático (ácido tauroursodesoxicólico – TUDCA), com múltiplas acções celulares, e (iv) estado energético celular (creatina). O tratamento crónico com 17-DMAG no ratinho CMVMJD135 resultou num atraso da progressão da descoordenação motora e redução da neuropatologia. Apesar de ter sido observada uma indução limitada das chaperonas moleculares, este tratamento poderá ter atuado a nível da autofagia na medida em que houve indução dos níveis de LC3-II e beclina-1 no cérebro de animais tratados. Esta indução resultou na diminuição dos níveis de ataxina-3 (ATXN3) e uma redução da agregação intranuclear desta proteína. Para testar mais aprofundadamente a indução da autofagia como potencial terapia para a DMJ, foi testado LiCl isoladamente e em combinação com CCI-779 (atuando de forma independente e dependente da sinalização mTOR, respectivamente). Apesar da ativação da autofagia, sugerida pelos níveis aumentados de beclina-1, Atg7, LC3-II e redução dos níveis proteicos de p62, o tratamento do modelo DMJ com lítio foi de uma forma geral ineficaz ao nível do desempenho motor. Além disso, a terapia combinada de LiCl e CCI-779 revelou-se prejudicial em ambos os ratinhos WT e transgénicos, falhando na recuperação de sintomas neurológicos e sendo neurotóxico. O TUDCA é um ácido biliar com administração oral e permeável à BBB com funções neuroprotectoras conhecidas, através da sua capacidade anti-amiloidogénica, actividade de chaperona química e de modulação de vias apoptóticas. Adicionalmente, o TUDCA é um composto aprovado pela FDA para administração crónica no tratamento de doenças hepáticas, sendo também benéfico em diversos modelos de doenças neurodegenerativas. No modelo CMVMJD135, o tratamento com TUDCA atrasou o início da doença e melhorou o fenótipo motor incluindo equilíbrio, coordenação motora, e parâmetros da marcha, reduziu os reflexos neurológicos anómalos, melhorou os défices no movimento exploratório e força muscular. Apesar de o tratamento com este composto não ter reduzido os níveis de agregação da proteína ATXN3, foi eficaz na redução dos níveis de expressão de TNF-α, Il1β e Il10, tendo também reduzido a astrogliose no tronco cerebral e substantia nigra. Estes resultados demonstram a eficácia terapêutica da suplementação com TUDCA na DMJ, muito provavelmente através das suas capacidades anti-inflamatórias, o que torna este composto atrativo no tratamento de doenças neurodegenerativas, incluindo a DMJ. Por fim foi testada a creatina, outro composto natural reconhecido pela eficácia em restabelecer o equilíbrio energético na célula. A dieta suplementada com creatina conduziu a uma melhoria geral no fenótipo motor do ratinho CMVMJD135; nomeadamente, melhorou a coordenação motora, força nos membros e qualidade da marcha. Também teve impacto positivo em parâmetros neurológicos como os tremores e reflexos anormais. Surpreendentemente, o tratamento crónico com creatina atrasou o início do aparecimento de diversos sintomas e até aboliu a presença de alguns, o que reinforça a suplementação com creatina como uma estratégica eficaz no atraso na progressão de DMJ. Em conclusão, este estudo validou o novo modelo DMJ de ratinho para ensaios pré-clínicos como uma ferramenta valiosa para estudar simultaneamente mecanismos patogénicos associado à doença e para desenvolver novas estratégias terapêuticas. Além disso foi demonstrado que inibidores da Hsp90, TUDCA e creatina são candidatos terapêuticos relevantes para a DMJ, alguns dos quais com possibilidade de avançarem para ensaios clínicos em doentes.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) SFRH/BD/78388/201

Does host LDL receptor contribute to tumor progression?

Tese de mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015O cancro é uma das principais causa de morte em todo o mundo e sabe-se que cada vez mais factores extrínsecos, como a dieta, podem afectar o seu desenvolvimento. Diversos estudos têm demonstrado que as células tumorais aumentam as suas necessidades de colesterol para a síntese de novas membranas, pensando-se que este seja um factor que facilite a proliferação deste tipo de células. Do ponto de viste epidemiológico, foram já identificadas associações causais entre níveis sistémicos de colesterol e desenvolvimento (incidência) de cancro, nomeadamente de cancro da mama. No nosso laboratório foi inclusivé demonstrado que a estimulação in vitro de células de cancro da mama com a lipoproteina de baixa densidade (do inglês, low-density lipoprotein - LDL) levava a um aumento da proliferação celular, diminuição da adesão e aquisição de um fenótipo mesenquimatoso, associado a um aumento de capacidade migratória das células tumorais. No presente projecto pretendemos avaliar de que forma a ausência do receptor do LDL nas células do microambiente tumoral poderia afectar a progressão tumoral. Neste sentido, optámos por utilizar um modelo genético, ao contrário da maioria dos estudos em que são utilizadas dietas ricas em colesterol para aumentar os níveis deste em circulação. O ratinho knock-out para o receptor do LDL (criado em 1993) permite-nos avaliar se é especificamente o colesterol transportado pelo LDL e a interação deste com o receptor (LDLR) que é capaz de potenciar uma maior progressão tumoral. É de salientar que estes ratinhos já apresentam elevados níveis de LDL em circulação, não sendo necessário utilizar uma dieta rica em colesterol para que estes níveis sejam aumentados. Neste projecto, o desenho experimental baseia-se na introdução de células tumorais de melanoma positivas para o receptor do LDL em ratinhos também eles positivos para o receptor, mas também em ratinhos LDLR knockout. Através deste modelo experimental, podemos verificar se o receptor nas células do microambiente tumoral é crucial para o desenvolvimento e progressão tumorais. Este trabalho permitiu ainda avaliar a importância de um receptor de colesterol nas células no microambiente tumoral. Em particular na formação de vasos sanguíneos, verificámos que apesar de não existirem diferenças no número de vasos endoteliais, normalmente formados através do clássico processo angiogénico já largamente descrito na literatura, existiam diferenças quanto ao número de canais que também fazem o aporte sanguíneo aos tumores, e que são formados pelas próprias células tumorais intercaladas com as células endoteliais. Este tipo de canais é descrito na literatura como “Mimetismo Vascular”, mais específicamente como Vasos Mosaico ou Mosaicismo Vascular. Relativamente à influência que o colesterol transportado pelo LDL possa ter sobre as células tumorais, apenas verificamos aumentos nas taxas proliferativas in vivo, não conseguindo demonstrar um efeito directo do colesterol sobre as células de melanoma, in vitro. Tendo em conta os resultados obtidos neste estudo, podemos concluir que elevados níveis de LDL em circulação potenciam uma maior progressão tumoral num ambiente cujas células são negativas para o receptor que faz a remoção dessa lipoproteina da circulação. Para além disso, constatámos também que num ambiente sem LDLR, e havendo excesso de LDL em circulação, surgem mais canais vasculares compostos por células endoteliais intercaladas com células tumorais (Vasos Mosaico).In this work, we investigated the role of host Low-Density Lipoprotein Receptor (LDLR) in the progression of Melanoma. By using an LDLR knockout mice model (with higher levels of Low-density lipoprotein (LDL) in circulation) and LDLR positive melanoma tumor cells, we tested if the absence of receptor in the tumor microenvironment has influence in tumor volume, vascular density or tumor cell proliferation. Paraffin or Frozen Tumor samples were used to perform immunohistochemistry and immunofluorescence analysis. We also performed in vitro experiments to see the behavior of melanoma tumor cells in he presence of elevated levels of LDL-cholesterol. Our results showed that in the LDLR knockout mice tumors were bigger than in wild-type mice and there are also more tumor cell proliferation in these mice. However, in vitro, we could not demonstrate that LDL-cholesterol per se promotes melanoma cell proliferation. We sought to explore the mechanisms by which cholesterol might favor melanoma progression; for this purpose we analysed the angiogenic phenotype of tumors grown on LDLR KO or wild type mice. Surprisingly, we didn’t find differences in the number of endothelial vessels between these two models. In contrast, we observed the presence of more mosaic vessels (tumor channels are composed by the intercalation of endothelial and tumor cells) and a small tendency for vascular mimicry (blood carrying channels formed by tumor cells only) occurrence in tumors from LDLR knockout mice. In conclusion, our study supports the idea that the absence of LDLR in the tumor microenvironment may enhance the formation of mosaic vessels and this way favor tumor growth

Exploring bioinformatics tools and databases to decipher the proteome of Candida glabrata biofilm matrix

Candida glabrata is a clinically relevant human pathogen with ability to form high recalcitrant biofilms, which produce an extracellular matrix suggested to have structural, virulent and protective roles. Thus, elucidation of matrix components, their function and regulation, is crucial to disclose matrix role in C. glabrata pathogenesis. As such, this study aimed to reveal, the matrix proteome of C. glabrata biofilms and to characterize it exploring bioinformatics tools. For that, extracted C. glabrata matrix proteins were analyzed through LC-MS/MS and identified using UniProt database. The functional distribution of the matrix proteins found was assessed using FungiFun tool and FunCat database. This analysis revealed an enrichment of proteins involved in carbohydrate-metabolism, which have a potential role in the delivery of carbohydrates into the matrix. Virulence-related functions were also found to be enriched among matrix proteins. Additionally, the predictive secretory nature of proteins was analysed using the Fungal Secretome Database and the Fungal Secretome KnowledgeBase. These analyses revealed that many matrix proteins have unconventional secretory pathways. Furthermore, orthologous proteins, identified with PathoYeastract database, were searched in Candida Genome Database using the keywords extracellular region and biofilm matrix. High overlap between C. glabrata matrix proteins and those secreted by other Candida spp, especially those of Candida albicans biofilm matrix was confirmed. Finally, using PathoYeastract platform, Pdr1 was indicated to be a potential regulator of matrix proteome and STRING analysis revealed high molecular interaction, either direct or indirect, between Pdr1 target-proteins. This study provides a unique resource for further functional investigation of matrix proteins, contributing to the identification of potential targets for the development of new therapies against C. glabrata biofilms.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

longINg_nano: efeitos de exposição longa e multigeracionais de nanomateriais em invertebrados terrestres

Till today, the expectations for the international market of engineered nanomaterials (NMs) are a continuous exponential grow. This is partly due to the number of applications that continues to increase. Inevitably this usage poses a risk for humans and the environment. The terrestrial compartment is at particular risk due to the presence of these materials in biosolids, remaining as a sink. Over the last decades progress has been made to improve the knowledge of NMs hazard and environmental risk assessment (ERA). Overall from the research made it was clear that results provided by most standard tests, that covered short term effects were not enough to evaluate effects of NMs. Hence data from long term exposures was urgently needed. Multigenerational exposures were highly recommended once they can provide information on post-generational and transgenerational effects. On the other hand, there was a continuously increase in the number of evidences that NMs can affect epigenetic mechanisms, and that epigenetics could help to explain multigenerational effects. So, epigenetics came as an important tool to include on the evaluation of NMs hazard and ERA. The aim of this thesis was to develop new ecotoxicity assays for the soil invertebrate standard model species Enchytraeus crypticus, to evaluate long term effects of NMs. Further it was aimed to investigate epigenetic effects, and other stress responses at different levels of biological organization, incurring from the long term exposures to NMs. Finally, it was intended to integrate all the data and build onto an adverse outcome pathway (AOP) framework. To cover long term effects, full life cycle (FLC) and multigenerational (MG) tests were developed for E. crypticus. Organisms were exposed to silver (Ag) NMs, coper oxide (CuO) NMs, Nanostructured Tungsten Carbide Cobalt (WCCo) and the corresponding ionic forms (for comparison). FLC exposures showed life stage effects which were specific for the NMs in relation to the ionic form. MG exposures showed different organisms´ responses between NMs and the ionic form, however for both forms there was transference of effects to subsequent exposed generations and unexposed generations, indicating transgenerational effects. Moreover, evaluation of epigenetic toxicity from these MG exposures was positive for both NMs and ionic form. Finally the integration of (eco)toxicoepigenetics data, at the several levels of biological organization, into the AOP framework proved to be very useful to distinguish different molecular initiating and key events, between NMs and the ionic form. In sum the research done during this thesis provided a stepping stone for the long term assessment effects of NMs in soil, and for the inclusion of evaluation of epigenetics in soil ecotoxicology.Ainda nos dias de hoje as expectativas para o mercado internacional de nanomateriais (NMs) projectados é de um crescimento exponencial contínuo. Isto é em parte devido ao facto de que o número de aplicações para estes NMs continua a crescer. Inevitavelmente este uso acarreta risco para o ser humano e para o ambiente. Para o ambiente terrestre existe um risco acrescido devido á presença destes materiais em biossólidos, que permanecem como uma fonte de NMs. Nas últimas décadas tem-se feito progressos no sentido de melhorar o conhecimento sobre o perigo dos NMs e a avaliação do risco ambiental. Sobre a investigação realizada até então ficou claro que os resultados fornecidos pelos testes padrão, que incluíam efeitos de curta duração, não eram suficientes para avaliar os efeitos dos NMs. Assim sendo, dados sobre exposições de longa duração eram necessários urgentemente. Exposições multigeracionais eram particularmente recomendadas, uma vez que fornecem informação sobre os efeitos nas pósgerações e efeitos transgeracionais. Por outro lado, existia um aumento contínuo sobre o número de evidências que reportavam que os NMs podem afectar mecanismos de epigenética, ao mesmo tempo, a epigenética poderia ajudar a explicar os efeitos multigeracionais. Assim, a epigenética tornou-se uma ferramenta importante a incluir na avaliação do perigo e do risco ambiental dos NMs. O objectivo desta tese foi desenvolver novos ensaios de ecotoxicidade para o invertebrado de solo Enchytraeus crypticus, que é uma espécie modelo padronizada, para avaliar efeitos de longa duração dos NMs. Para além disso, tinha-se como objectivo investigar efeitos de epigenética e outras respostas gerais de stresse, nos diferentes níveis de organização biológica, que decorriam destas exposições de longa duração aos NMs. Finalmente pretendia-se também integrar todos os dados no formato de via metabólica adversa (VMA). Para a inclusão de efeitos de longa duração, testes de ciclo de vida completo (CVC) e multigeracionais (MG) foram desenvolvidos para o E. crypticus. Os organismos foram expostos a NMs de prata (Ag), NMs de óxido de cobre (CuO), carboneto de tungsténio e cobalto (WCCo) nanoestruturado e os correspondentes compostos na forma iónica (para comparação). As exposições de CVC mostraram efeitos específicos para os NMs em relação á sua forma iónica. As exposições MG mostraram diferentes respostas dos organismos para os NMs em relação á sua forma iónica, contudo para ambas as formas houve uma transferência de efeitos para as subsequentes gerações expostas e gerações não expostas, estas indicando efeitos transgeracionais. Para além disso, a avaliação da toxicidade epigenética nestas exposições MG foi positiva para os NMs e respectiva forma iónica. Finalmente a integração dos dados de (eco)toxicoepigenética, nos diferentes níveis de organização biológica, no formato de VMA, provou ser muito útil para distinguir entre NMs e a forma iónica, eventos moleculares e eventos chave. Em suma a investigação feita durante esta tese providenciou um suporte importante para a avaliação de efeitos de longa duração dos NMs no solo e, para a inclusão da avaliação epigenética na ecotoxicologia de solo.Programa Doutoral em Biologi

O impacto das perceções de liderança servidora nos níveis de job burnout dos colaboradores

In the current work context, constantly changing and increasingly demanding, in which employees’ well-being is often at risk, leaders have become increasingly important. In this context, a positive leadership style, such as servant leadership, which postulates that the leader is a source of resources and support, and that the main priority are employees’ needs, might contribute to decreasing the negative effects of job burnout, both on the individual and organisational levels. Therefore, this research aims at studying the impact that servant leadership perceptions have on employees’ job burnout levels. The sample is composed of 79 participants from different organisations and sectors. The results show that servant leadership perceptions have a negative impact on employees’ job burnout levels, being that impact stronger when the leader is male. The results not only confirm the importance of leadership within the organisational environment and to employees’ well-being, but also add to the literature about the impact of servant leadership on employees’ well-being and the influence of the gender of the leader in such relationship.No atual contexto laboral, fortemente sujeito a mudanças e de exigência crescente, onde o bem-estar dos colaboradores é, muitas vezes, posto em causa, os líderes assumem um papel cada vez mais importante. Nesta conjuntura, um estilo de liderança positiva, como o de liderança servidora, na qual o/a líder é fonte de recursos e suporte, colocando as necessidades das suas pessoas em primeiro lugar, poderá contribuir para mitigar os efeitos negativos do job burnout, a nível pessoal e organizacional. Assim, esta investigação tem como objetivo estudar o impacto das perceções de liderança servidora nos níveis de job burnout dos colaboradores. A amostra é constituída por 79 participantes de diversas organizações e setores. Os resultados mostram que as perceções de liderança servidora têm um impacto negativo nos níveis de job burnout dos colaboradores, sendo que esse impacto é mais forte quando o líder é do género masculino. Os resultados obtidos corroboram a importância da liderança na vida organizacional e no bem-estar dos colaboradores, e contribuem para a literatura sobre o impacto que a liderança servidora tem no bem-estar dos colaboradores e a influência do género do líder nessa relação.Mestrado em Gestã