Kinetics of casein hydrolysis by peptidase from Bacillus thuringiensis var. israelensis

The kinetics of enzyme reaction is generally studied using the Michaelis-Menten equation and various methods of its linearization. Each method has its advantages and drawbacks, so their comparison for determining the kinetics of new enzymes action is topical. The aim of this work was to study the kinetics of casein hydrolysis catalyzed by new peptidase from Bacillus thuringiensis var. israelensis IMB B-7465 using several methods of enzyme activity assessment and Michaelis-Menten equation linearization. The satisfactory agreement between kinetic constants values obtained by the methods of Lineweaver-Burk, Hanes, Eadie-Hofstee, Cornish-Bowden-Eisenthal was established. The Lineweaver-Burk method was shown to be optimal for determining Km and Vmax of casein hydrolysis. Estimation of caseinolytic activity with the use of ortho-phthalic dialdehyde allowed more accurate Vmax determination compared to the use of Anson and Kunitz methods

Лізоцимвмісний препарат для сльозозамінної терапії: фармакотерапевтична ефективність

Introduction. The prospective method of dry eye syndrome (DES) is the tear-substitutive therapy with the help of eye drops, among which there are absent such with enzyme lysozyme (EC 3.2.1.17), possessing bacteriolytic,immunostimulating, anti-inflammatory, regenerating, analgetic activity and have the protective function of lacrimal liquid. Because we had developed the preparation with lysozyme, timely for application in such direction and itsophthalmosafety was shown, the investigation of it’s pharmacotherapeutic effectiveness was advisable.The aim of the study – investigation of the pharmaco-therapeutic effectiveness of eye drops “artificial tear” with lysozyme as a potential drug for the dry eye syndrome treatment.Research Methods. The study of the anti-inflammatory and regenerative properties of the produced eye drops with lysozyme was conducted on 6 sexually mature healthy rabbits of the Chinchilla strain with modelled traumatickeratitis.Results and Discussion. Basing on the previously obtained experimental data, the stable, highly active, sterile eye drops “artificial tear” with lysozyme were made for their pharmaco-therapeutic effectiveness investigation on the Chinchilla rabbits with modelled traumatic keratitis. It was shown, that instillations of eye drops "artificial tear" with lysozyme in the treatment of traumatic keratitis have an anti-inflammatory and regenerative effect, helping the more quick liquidation of the inflammation and acceleration of the epithelization process compared with control.Conclusions. For conduction of preclinical research, the highly-active, stable, sterile eye drops “artificial tear” with lysozyme were made. The instillations of the obtained eye drops at treatment of traumatic keratitis renders anti-inflammatory and regenerative effect, helping the more quick liquidation of inflammation and the acceleration of the epithelization process.Вступление. Перспективным методом лечения синдрома сухого глаза является слезозаменительная терапия с помощью глазных капель, среди которых отсутствуют таковые с энзимом лизоцимом (КФ 3.2.1.17), имеющим бактериолитическое, иммуностимулирующее, противовоспалительное, регенерирующее, обезболивающее действие и выполняющим защитную функцию слезной жидкости. Поскольку мы разработали препарат с лизоцимом, актуальный для использования в данном направлении, показали его офтальмобезвредность, целесообразно изучить его  фармакотерапевтическую эффективность.Цель исследования – изучить фармакотерапевтическую эффективность глазных капель “искусственная слеза” с лизоцимом как потенциального препарата для лечения синдрома сухого глаза.Методы исследования. Противовоспалительные и регенераторные свойства изготовленных глазных капель с лизоцимом изучали на 6 половозрелых здоровых кроликах породы Шиншилла с моделированнымтравматическим кератитом.Результаты и обсуждение. На основе ранее полученных экспериментальных данных были изготовлены стабильные, высокоактивные, стерильные глазные капли “искусственная слеза” с лизоцимом для исследования их фармакотерапевтической эффективности на кроликах породы Шиншилла с моделированным травматическим кератитом. Показано, что инстилляции глазных капель “искусственная слеза” с лизоцимом при лечении травматического кератита оказывают противовоспалительное и регенера торное действие, способствуя более быстрой ликвидации воспаления и ускорению процесса эпителизации по сравнению с контролем.Выводы. Для проведения доклинических исследований изготовлены стабильные, высокоактивные, стерильные глазные капли “искусственная слеза” с лизоцимом. Инстилляции полученных глазных капель при лечении травматического кератита оказывают противовоспалительное и регенераторное действие, способствуя более быстрой ликвидации воспаления и ускорению процесса эпителизации.Вступ. Перспективним методом лікування синдрому сухого ока є сльозозамінна терапія за допомогою очних крапель, серед яких відсутні такі з ензимом лізоцимом (КФ 3.2.1.17), що має бактеріолітичну, імуностимулювальну, протизапальну, регенерувальну, знеболювальну дію і виконує захисну функцію слізної рідини. Оскільки ми розробили препарат з лізоцимом, актуальний для використання в даному напрямку, показали його офтальмобезпечність, доцільно вивчити його фармакотерапевтичну ефективність.Мета дослідження – вивчити фармакотерапевтичну ефективність очних крапель “штучна сльоза” з лізоцимом як потенційного препарату для лікування синдрому сухого ока. Методи дослідження. Протизапальні та регенераторні властивості виготовлених очних крапель з лізоцимом вивчали на 6 статевозрілих здорових кролях породи Шиншила з модельованим травматичнимкератитом. Результати й обговорення. На основі раніше отриманих експериментальних даних було виготовлено стабільні, високоактивні, стерильні очні краплі “штучна сльоза” з лізоцимом для дослідження їх фармакотерапевтичної ефективності на кролях породи Шиншила з модельованим травматичним кератитом. Показано, що інстиляції очних крапель “штучна сльоза” з лізоцимом при лікуванні травматичного кератиту чинять протизапальну і регенераторну дію, сприяючи більш швидкій ліквідації запалення таприскоренню процесу епітелізації порівняно з контролем.Висновки. Для проведення доклінічних досліджень виготовлено стабільні, високоактивні, стерильні очні краплі “штучна сльоза” з лізоцимом. Інстиляції отриманих очних крапель при лікуванні травматичного кератиту чинять протизапальну і регенераторну дію, сприяючи більш швидкій ліквідації запалення та прискоренню процесу епітелізації

USAGE OF MUSHROOM AGARICUS BISPORUS TYROSINASE FOR SEPARATION OF PHENOLIC COMPOUNDS MIXTURES

The new method of phenolic compounds mixtures separation in solutions was developed, based on the oxidation of one of the mixture component using immobilized in PVC partially purified tyrosinase and the next removal of the oxidation products with a help of potassium alum. The biocatalyst obtained had carried out oxidation of phenol or pyrocatechol (0,5-10 mmol/dm3) with quantitative degree of bioconversion in the presence of resorcinol, hydroquinone or p-nitrophenol, which are not oxidized, with reservation of their initial concentrations (35-65 mmol/dm3) in solution, during 4 cycles in batch reacto

SEARCH OF NEW SYNTHETIC INHIBITORS OF TYROSINASE

Melanin pigmentation of skin plays the most important role in the protection of organism against UV-irradiation, but the excessive accumulation of melanin brings to toxic melanodermia, melasma, lentigo and other skin lesions. Tyrosinase is the key enzyme of skin melanin pigment biosynthesis. In spite of certain progress in investigation of natural and synthetic tyrosinase inhibitors, actuality of such studies is of a high level, because the existing inhibitors are in some cases unstable, expensive, toxic, requires complex methods of synthesis or isolation from natural sources. The aim of the work is screening of new tyrosinase inhibitors, using the enzyme, isolated from Agaricus bisporus. Tyrosinase was isolated from Agaricus bisporus mushrooms by a modified method. It was found, that the introduction of polyethylene glycol 4000 in the extraction process promotes 3-fold reduction of polyphenol content, which leads to increase purity of enzyme with an increase in its activity by 25%. A search for new tyrosinase inhibitors among a wide range of compounds, including derivatives of 3-chloro-1,4-naphthoquinone, isatin, 3-hydroxy-2-naphthoic acid, etc was conducted. The studied substances did not displayed inhibitory effect at concentration of 0,1-0,5 mmol/dm3

БЕНЗИЛІДЕНАНІЛІНИ І СПОРІДНЕНІ СПОЛУКИ ЯК ІНГІБІТОРИ ТИРОЗИНАЗИ

Excessive accumulation of melanin leads to a number of skin diseases and cosmetic problems, namely toxic and medicinal melanoderma, melasma, lentigo, etc. The leading role in the formation of melanin belongs to tyrosinase, an enzyme of the class of oxidoreductases (ЕС 1.14.18.1), which catalyzes the first stages of pigment formation. Therefore, to prevent or treat hyperpigmentation of the skin, agents containing tyrosinase inhibitors, are used. To date, many inhibitors of enzyme are known. However, existing compounds have significant drawbacks, such as instability, inefficiency, toxicity, complex methods of synthesis or isolation from natural sources. The aim of this work was to study benzylidenaniline, its derivatives and related compounds as tyrosinase inhibitors. It was shown that benzylidene-2-aminophenol and benzylidene-4-aminophenol are effective inhibitors of tyrosinase monophenolase activity (IC50 of 7.8 and 31.2 μmol/dm3, respectively) and significantly exceeds the standard inhibitor - kojic acid by inhibitory ability. It was found, that benzylideneanilines studied reduced only the monophenolase activity enzyme and did not affect the diphenolase activity. It was found, that unsubstituted benzylideniline is also a tyrosinase inhibitor (IC50 110.4 μmol/dm3), although it is significantly inferior in efficiency to hydroxy derivatives and kojic acid. The influence of other aldimines on enzyme activity was studied. It has been shown that compounds, containing a naphthalene fragment, a heteroatom in the aniline ring, and a carbon bridge between the aromatic rings are not tyrosinase inhibitors. It was found, that 3-(2-hydroxyphenylimino)-1,3-dihydroindol-2-one exhibited a significant inhibitory ability (8.8 μmol/dm3) close to such of benzylidene-2-aminophenol.Показано, що бензиліден-2-амінофенол і бензиліден-4-амінофенол є ефективними інгібіторами монофенолазної активності тирозинази (ІС50 7,8 і 31,2 мкмоль/дм3, відповідно), і значно перевищують стандартний інгібітор – койєву кислоту за інгібуючою здатністю. Досліджений вплив інших альдімінів на активність ензиму. Показано, що сполуки, які містять нафталіновий фрагмент, гетероатом у ароматичному фрагменті аніліну, а також біс-альдіміни (в концентраціях 2 – 250 мкмоль/дм3) не є інгібіторами тирозинази. Виявлено, що 3-(2-гідроксифеніліміно)-1,3-дигідроіндол-2-он проявив значну інгібуючу здатність (8,8 мкмоль/дм3), близьку до такої бензиліден-2-амінофенолу

SEARCH OF NEW SYNTHETIC INHIBITORS OF TYROSINASE

Melanin pigmentation of skin plays the most important role in the protection of organism against UV-irradiation, but the excessive accumulation of melanin brings to toxic melanodermia, melasma, lentigo and other skin lesions. Tyrosinase is the key enzyme of skin melanin pigment biosynthesis. In spite of certain progress in investigation of natural and synthetic tyrosinase inhibitors, actuality of such studies is of a high level, because the existing inhibitors are in some cases unstable, expensive, toxic, requires complex methods of synthesis or isolation from natural sources. The aim of the work is screening of new tyrosinase inhibitors, using the enzyme, isolated from Agaricus bisporus. Tyrosinase was isolated from Agaricus bisporus mushrooms by a modified method. It was found, that the introduction of polyethylene glycol 4000 in the extraction process promotes 3-fold reduction of polyphenol content, which leads to increase purity of enzyme with an increase in its activity by 25%. A search for new tyrosinase inhibitors among a wide range of compounds, including derivatives of 3-chloro-1,4-naphthoquinone, isatin, 3-hydroxy-2-naphthoic acid, etc was conducted. The studied substances did not displayed inhibitory effect at concentration of 0,1-0,5 mmol/dm3.Melanin pigmentation of skin plays the most important role in the protection of organism against UV-irradiation, but the excessive accumulation of melanin brings to toxic melanodermia, melasma, lentigo and other skin lesions. Tyrosinase is the key enzyme of skin melanin pigment biosynthesis. In spite of certain progress in investigation of natural and synthetic tyrosinase inhibitors, actuality of such studies is of a high level, because the existing inhibitors are in some cases unstable, expensive, toxic, requires complex methods of synthesis or isolation from natural sources. The aim of the work is screening of new tyrosinase inhibitors, using the enzyme, isolated from Agaricus bisporus.Tyrosinase was isolated from Agaricus bisporus mushrooms by a modified method. It was found, that the introduction of polyethylene glycol 4000 in the extraction process promotes 3-fold reduction of polyphenol content, which leads to increase purity of enzyme with an increase in its activity by 25%. A search for new tyrosinase inhibitors among a wide range of compounds, including derivatives of 3-chloro-1,4-naphthoquinone, isatin, 3-hydroxy-2-naphthoic acid, etc was conducted. The studied substances did not displayed inhibitory effect at concentration of 0,1-0,5 mmol/dm3. It is known, that the natural substrate of mushroom tyrosinase is 1,8-dihydroxynaphthalene, thus it was supposed that the 2,7-dihydroxynaphthalene may be prospective inhibitor of enzyme activity. It was shown, that the concentration of half-maximal inhibition of tyrosinase monophenolase activity by 2,7-dihydroxynaphthalene is close to that of kojic acid – classic inhibitor of melanogenesis. It was found, that 2,7-dihydroxynaphthalene exerts inhibitory action only on monophenolase activity of tyrosinase in contrast to kojic acid, which inhibits both monophenolase and diphenolase enzyme activity

BENZYLIDENANILINES AND RELATED COMPOUNDS AS TYROSINASE INHIBITORS

Excessive accumulation of melanin leads to a number of skin diseases and cosmetic problems, namely toxic and medicinal melanoderma, melasma, lentigo, etc. The leading role in the formation of melanin belongs to tyrosinase, an enzyme of the class of oxidoreductases (ЕС 1.14.18.1), which catalyzes the first stages of pigment formation. Therefore, to prevent or treat hyperpigmentation of the skin, agents containing tyrosinase inhibitors, are used. To date, many inhibitors of enzyme are known. However, existing compounds have significant drawbacks, such as instability, inefficiency, toxicity, complex methods of synthesis or isolation from natural sources. The aim of this work was to study benzylidenaniline, its derivatives and related compounds as tyrosinase inhibitors. It was shown that benzylidene-2-aminophenol and benzylidene-4-aminophenol are effective inhibitors of tyrosinase monophenolase activity (IC50 of 7.8 and 31.2 μmol/dm3, respectively) and significantly exceeds the standard inhibitor - kojic acid by inhibitory ability. It was found, that benzylideneanilines studied reduced only the monophenolase activity enzyme and did not affect the diphenolase activity. It was found, that unsubstituted benzylideniline is also a tyrosinase inhibitor (IC50 110.4 μmol/dm3), although it is significantly inferior in efficiency to hydroxy derivatives and kojic acid. The influence of other aldimines on enzyme activity was studied. It has been shown that compounds, containing a naphthalene fragment, a heteroatom in the aniline ring, and a carbon bridge between the aromatic rings are not tyrosinase inhibitors. It was found, that 3-(2-hydroxyphenylimino)-1,3-dihydroindol-2-one exhibited a significant inhibitory ability (8.8 μmol/dm3) close to such of benzylidene-2-aminophenol

КІНЕТИКА ГІДРОЛІЗУ КАЗЕЇНУ ЗА ДОПОМОГОЮ ВІЛЬНОЇ І ІММОБІЛІЗОВАНОЇ ПЕПТИДАЗИ BACILLUS THURINGIENSIS VAR. ISRAELENSIS ІМВ В-7465

In the process of proteases immobilization, their conformation, affinity of enzymes to the substrate, as well as other properties, may change. Therefore, their comprehensive study, including the reaction rates, affinity to the substrate and the determination of the mechanism of action using kinetic studies of free and immobilized peptidases, is an important task. This work aimed to determine the kinetic parameters of casein hydrolysis catalyzed by free and released from PVA/chitosan films peptidase from B. thuringiensis var. israelensis IMB B-7465. The kinetics of casein hydrolysis of free and released from PVA/chitosan films peptidase from Bacillus thuringiensis var. israelensis IMB B-7465 was studied. It is shown, that only the modified Anson method is applicable for determining the caseinolytic activity of peptidase, released from the matrix. It was revealed, that at relatively low substrate concentrations, the reaction rate of casein hydrolysis catalysed by free and released from PVA/chitosan films peptidase increased proportionally. When substrate concentration increased, the rate value approached its limit, and then began to decrease. That is, in the certain casein concentration range, the enzyme is inhibited by the substrate. The kinetic constants were measured within the ascending part of the curve relating the initial reaction rate and the substrate concentration. It was determined that the entrapment of the enzyme in the PVA/chitosan film does not significantly affect Vmax. of hydrolysis, while Km is increased 1.3-fold. It is associated with decreasing of the affinity of the enzyme to the substrate as a result of conformational changes in the protein globule, or due to the viscosity limitations, caused by polymers of the matrix. Substrate inhibition of free and released from films peptidase was studied. It was shown that the last Kis is 2.3-fold higher, than that of the free enzyme, which allows to hydrolyze higher concentrations of the substrate.Досліджено кінетику гідролізу казеїну вільною і вивільненою з плівок ПВС/хітозан пептидазою з Bacillus thuringiensis var. israelensis ІМВ В-7465. Показано, що тільки модифікований метод Ансона може бути застосований для визначення казеїнолітичної активності вивільненої з матриці пептидази. Визначено, що включення ензиму в плівку ПВС/хітозан істотно не впливає на Vмакс. гідролізу, тоді як Км збільшується в 1,3 рази. Виявлено інгібування вільної і вивільненої з плівок пептидази субстратом. Показано, що Кis останньої у 2,3 рази перевищує таку вільного ензиму, що дозволяє гідролізувати більші концентрації субстрату

Окисление фенола ковалентно иммобилизованной пероксидазой хрена

За модифікованим методом Баха виділено частково очищений препарат пероксидази хрону (RZ = 1,0; активність 100 Од/мг протеїну). Молекулярну масу виділеної пероксидази хрону (42 972 Да) підтверджено методом мас спектрометрії – матрично активованої лазерної десорбції/іонізації. Одержаний препарат був ковалентно іммобілізований шляхом періодатного окиснення полісахаридної мембрани «Діацел» з наступним відновленням боргідридом натрію у масовому відношенні ензим:носій 0,2:1. Отримано біокаталізатор з кількісним зв’язуванням протеїну, зі збереженням 88% активності (масове відношення ензим:носій 0,2:1), розширеними значеннями рН і термооптимумів активності, збільшеною термостабільністю, стійкістю під час зберігання (8 міс). Кінетичні дослідження показали збільшення значень K м за пероксидом водню і пірогалолом, зменшення значень Vmax реакції, яка каталізується іммобілізованою пероксидазою хрону. Розроблений біокаталізатор у реакторі періодичної дії сприяв кількісному окисненню фенолу (1 мМ) упродовж 7 циклів використання та високому рівню його біоконверсії (95–50%) у наступні 15 циклів. Методом лазерної десорбціїї/іонізації вперше визначено молекулярну масу (близько 2 021 Да) нерозчинного у воді і більшості органічних розчинників полімерного продукту пероксидазного окиснення фенолу – поліоксифенілену (розмір частинок 15–75 мкм), що складається з 21 залишку.According to modified Bakh’s method, partially purified horseradish peroxidase preparation (RZ = 1,0; activity 100 U/mg of protein) was isolated. Molecular mass of obtained HPR (42 972 Da) was confirmed by massspectrometry: matrix activated laser desorption/ ionization. The enzyme was covalently immobilized by periodate oxidation of polysaccharide membrane «Diacell», followed by sodium borohydride reduction, at mass ratio enzyme: support 0.2:1. The biocatalyst with quantitative protein coupling, 88% of activity’s pH- and thermooptima, increased termostability, stable at storage (8 months) was obtained. Kinetic studies had shown the increasing of hydrogen peroxide and pyrogallol Kм values and decreasing of Vmax values during immobilized HPR catalyzed reactions. In the batch reactor the biocatalyst developed promoted the quantitative phenol oxidation (1 mmol/dm3) during 7 cycles of usage and high level of it’s bioconversion (95–50%) during the next 15 cycles. Molecular weight (about 2021 Da) of polymer product, insoluble in water and most organic solvent, of peroxidase oxidation of phenol – polioxyfenilene (particle size is from 15 to 75 mm) consisting of 21 units was first determined by laser desorption/ionization.По модифицированному методу Баха выделен частично очищенный препарат пероксидазы хрена (RZ = 1,0; активность 100 Ед/мг протеина). Молекулярная масса выделенной пероксидазы хрена (42 972 Да) подтверждена методом масс спектрометрии – матрично активированной лазерной десорбции / ионизации. Полученный препарат был ковалентно иммобилизован путем перйодатного окисления полисахаридной мембраны «Диацелл» с последующим восстановлением боргидридом натрия в массовом отношении энзим: носитель 0,2:1. Получен биокатализатор с количественным связыванием протеина, с сохранением 88% активности (массовое отношение энзим: носитель 0,2:1), расширенными значениями рН- и термооптимумов активности, увеличенной термостабильностью, устойчивостью при хранении (8 мес). Кинетические исследования показали увеличение значений Kм по пероксиду водорода и пирогаллолу; уменьшение значений V max реакции, которая катализируется иммобилизованной ПОХ. Разработанный биокатализатор в реакторе периодического действия способствовал количественному окислению фенола (1 мМ) в течение 7 циклов использования и высокому уровню его биоконверсии (95–50%) в последующие 15 циклов. Методом лазерной десорбции/ионизации впервые определена молекулярная масса (около 2 021 Да) нерастворимого в воде и большинстве органических растворителей полимерного продукта пероксидазного окисления фенола – полиоксифенилена (размер частиц 15–75 мкм), состоящего из 21 звена