Prostat Kanseri Biyobelirteçlerinin Tayini İçin Nanoplazmonik Platformların Hassasiyetinin Arttırılması

ABSTRACT ENHANCING THE SENSITIVITY OF NANOPLASMONIC PLATFORMS FOR DETECTING PROSTATE CANCER BIOMARKERS Semih ÇALAMAK Doctor of Philosophy, Department of Nanotechnology and Nanomedicine Supervisor: Prof. Dr. Kezban ULUBAYRAM JUNE 2018, 148 pages Early detection of cancer biomarkers in body fluids has significant importance for early diagnosis of cancer. LSPR technologies are the most powerful optical biosensors that can be used for label-free detection of biomolecules at ultra-low concentrations (ag/mL). Despite these advantages, the detection limits for many biomolecules are not at the desired levels. Especially biomarkers with low molecular weight can not be detected with LSPR sensors. The aim of the thesis is to develop the easy and cost-effective way to improve the sensitivity of nanoplasmonic platforms to detect low molecular weight biomarkers with enhanced plasmon coupling and in-situ gold nanoparticle growth method under static and dynamic conditions (in microfluidic platforms). In the first part of the thesis theoretical analysis of the electric field interactions of gold nanoparticles were investigated to determine the most suitable gold nanoparticle size and configurations for more precise measurement. The electric field enhancements on gold nanoparticles (20, 50, 80 and 100 nm) were investigated using Mie theory and the highest electric field enhancement was observed on the gold nanoparticle, which has the size of 50 nm. After that, double, triple and quadruple gold nanoparticle (50 nm) arrays were assembled and the highest electric field enhancement was calculated for quadruple nanoparticle array with 40.85 V/m electric field and 11.10 electric field enhancement factor. In the second part of the thesis, gold nanoparticles were functionalized on PS surface via polyethyleneimine (PEI). It was found that the nanoplasmonic iv surfaces showed the sharpest LSPR signal on the PS surfaces modified with 1 mg/mL PEI at 548 ± 1.5 nm maximum wavelength. In the third part of the thesis, a cost-effective new approach has been developed to increase the sensitivity of nanoplasmonic platforms. In this new approach, gold nanoparticles which were functionalized on PS surface were grown (in-situ) under static and dynamic (laminar and dynamic flow) using microfluidic platforms. In microfluidic chips with laminar and turbulence flow regimes, gold nanoparticles were grown more homogeneously and single row sequences on PS surface with increasing LSPR signal. Gold nanoparticles, which have 50 nm of particle size reached 110 ± 14, 123 ± 12 and 175 ± 6 average particle size in static media, laminar flow, and turbulence flow media after in-situ particle growth, respectively. The maximum wavelengths of nanoplasmonic surfaces were shown red shifts from 548 ± 4 nm to 569 ± 3, 570 ± 2 and 577 ± 4 nm for static in-situ, laminar in-situ and turbulence in-situ nanoplazmonik surfaces, respectively. Furthermore, after in-situ particle growth, turbulence in-situ nanoplasmonic surfaces showed significant red shifts in maximum wavelength along with an increase in extinction intensity in the LSPR signals three times more compared to the standard nanoplasmonic surface. In the last part of the study, detection studies of prostate cancer biomarkers (BSA (66 kDa), TGF-β1 (12.8 kDa) and BMP-2 (13 kDa)) with various molecular weights were carried out on standard, static in-situ and turbulent in-situ nanoplasmonic surfaces. Turbulent insitu nanoplasmonic surfaces were found more sensitive than standard nanoplasmonic surfaces and static in-situ nanoplasmonic surfaces from 1 pg/mL concentration of high (BSA) and low molecular weight (TGF-β1 and BMP-2) prostate cancer biomarkers. These results have shown that the nanoplasmonic platforms integrated into the microchips are reliable, accurate, reproducible and applicable.İÇİNDEKİLER DİZİNİ ÖZET ........................................................................................................................ i ABSTRACT ............................................................................................................ iii TEŞEKKÜR ............................................................................................................. v İÇİNDEKİLER DİZİNİ ............................................................................................ vii ÇİZELGELER DİZİNİ .............................................................................................. xi ŞEKİLLER DİZİNİ .................................................................................................. xii SİMGELER VE KISALTMALAR .......................................................................... xxv 1. GİRİŞ .............................................................................................................. 1 1.1. LSPR Tabanlı Plazmonik Sensörler ............................................................ 2 1.1.1.Temel İlkeler ...................................................................................... 2 1.1.2. Nanoparçacıkların Plazmonu ve LSPR Teorisi ................................ 4 1.1.3. LSPR Tabanlı Plazmonik Sensörlerin Uygulama Alanları ................ 7 1.1.4. LSPR tabanlı sensörlerin hassasiyetini artırmak için kullanılan yaklaşımlar ......................................................................................................... 9 1.4.4.1. Enzimatik yüzey arttırımı ....................................................... 9 1.4.4.2. Plazmonik nanopartikül eşleşmesine dayalı sinyal arttırılması ...................................................................................................................... 10 1.2. Altın Nanoparçacıkların Elektrik Alan Etkileşimlerinin Teorik Analizi ......... 13 1.2.1.Teorik Modelleme ............................................................................ 15 1.2.1.1. Kısmı Statik Yaklaşım .......................................................... 16 1.2.1.2. Mie Teorisi ........................................................................... 17 1. 2.2. Plazmon Eşleşmesi ve Elektrik Alan Arttırımı ................................ 19 1.3. Altın Nanoparçacıkların Sentezi ve Nanoplazmonik Özellikleri ................. 21 viii 1.3.1. Altın Nanomalzemelerin Üretiminde Aşağıdan-Yukarı (Bottom-Up) ve Yukarıdan (Top- Down) Aşağı Üretim Teknikleri .......................................... 21 1.3.1.1. Altın nanopartiküllerin sentezinde çekirdek büyütme (Seed and Growth) yöntemi ..................................................................................... 24 1.3.1.2. Altın nanopartikül sentezinde fotokimyasal yöntemler ......... 24 1.3.2. Altın Nanopartiküllerin İşlevselleştirilmiş Yüzeylere İmmobilizasyonunu ........................................................................................... 25 1.4. Mikroakışkan Sistemler ve Sensör Teknolojilerindeki Yeri ........................ 26 1.4.1. Mikroakışkan sistemlerde akış rejimleri .......................................... 27 1.4.2. Türbülans akış rejiminin partikül büyümesi üzerine etkisi ............... 29 1.5. Prostat Kanseri Biyobelirteçleri ve Teşhisindeki Zorluklar ......................... 29 1.5.1. Prostat Kanseri Biyobelirteçleri ...................................................... 31 1.5.1.1. Sığır serum albümin (BSA) .................................................. 31 1.5.1.2. Transforme edici büyüme faktörü beta 1 (TGF-β1) ............. 31 1.5.1.3. Kemik morfojenetik proteini 2 (BMP-2) ................................ 32 1.5.2. Kanser Teşhisinde Mikroakışkan Çipler ......................................... 33 2. MATERYAL VE METOD ............................................................................... 35 2.1. Teorik Modelleme Basamakları ................................................................. 35 2.1.2. Altın nanopartikül dizilerinin elektrik alan etkileşimlerinin teorik analizi ............................................................................................................... 36 2.1.3. Mikroakışkan çiplerin modellenmesi ve akış rejimleri ..................... 38 2.2. Altın Nanoyapıların Sentezi ....................................................................... 39 2.2.1. Farklı boyutlarda altın nanopartiküllerin sentezi ............................. 39 2.2.2. Altın nanoçubukların sentezi .......................................................... 41 2.2.3. Altın nanoyapıların karakterizasyonu ............................................. 41 2.3. Nanoplazmonik Platformların Geliştirilmesi ............................................... 42 ix 2.3.1. Altın nanopartiküllerin polistiren yüzeylere direkt immobilizasyonu ile nanoplazmonik yüzeylerin hazırlanması ........................................................... 42 2.3.2. Nanoplazmonik yüzeylerin mikrokakışkan çiplere entegrasyonu ... 43 2.3.2.1. Mikroakışkan çiplerin hazırlanması ...................................... 43 2.3.2.2. Altın nanopartiküllerin PS yüzeylerde kontrollü olarak büyütülmesi (In-Situ) ..................................................................................... 46 2.3.3. Plazmonik Yüzeylerin Analizi ......................................................... 48 2.4. Geliştirilen Nanoplazmonik Platformlarda Prostat Kanser Biyobelirteçlerinin Tayini .................................................................................................................... 50 2.4.1.Prostat Kanser Biyobelirteçlerinin Hazırlanması ............................. 50 2.4.2. Prostat Kanseri Biyobelirteçlerinin Nanoplazmonik Platformlarla Etkileştirilmesi ................................................................................................... 51 2.4.3. Nanoplazmonik Yüzeylerin Karakterizasyonu ve LSPR Sinyallerinin Ölçülmesi .......................................................................................................... 51 2.4.3.1. UV-Vis görüntüleme ............................................................ 51 2.4.3.2. Data Analizi ......................................................................... 53 2.5.İstatik Analizi .............................................................................................. 54 3. BULGULAR VE TARTIŞMA .......................................................................... 55 3.1. Altın Nanopartikül Boyut ve Dizilimlerinin Elektrik Alan Etkileşimlerine Etkisi ............................................................................................................................. 55 3.2. Plazmonik Yüzeyler için Sentezlenen Altın Nanoyapıların Özellikleri ve Yüzey Plazmon Rezonansı Üzerine Etkileri ......................................................... 67 3.2.1. Altın nanopartiküller ....................................................................... 67 3.2.2. Altın Nanoçubuklar ......................................................................... 73 3.3. Geliştirilen Nanoplazmonik Platformların Değerlendirilmesi ...................... 75 3.3.1. Altın nanopartiküllerin polistiren yüzeylere direkt immobilizasyonu ile hazırlanan plazmonik yüzeyler.......................................................................... 75 x 3.3.2. Altın nanopartiküllerin “in-situ” olarak PS yüzeylerde büyütülmesiyle geliştirilen nanoplazmonik yüzeyler .................................................................. 83 3.3.3. Mikroçip sistemlerde akış dinamiklerinin nanoplazmonik yüzeylere etkisi ................................................................................................................. 91 3.3.4. Prostat kanseri biyobelirteçlerinin nanoplazmonik yüzeylerde tayini .......................................................................................................................... 99 3.3.4.1. Standart nanoplazmonik yüzeylerde prostat kanseri biyobelirteçlerinin tayini ............................................................................... 100 3.3.4.2. Altın nanopartiküllerin PS yüzeylerde in-situ olarak büyütüldüğü nanoplazmonik yüzeyler ......................................................... 113 4. SONUÇ .......................................................................................................... 140 KAYNAKLAR ...................................................................................................... 143 ÖZGEÇMİŞ ........................................................................................................ 149ÖZET PROSTAT KANSERİ BİYOBELİRTEÇLERİNİN TAYİNİ İÇİN NANOPLAZMONİK PLATFORMLARIN HASSASİYETİNİN ARTTIRILMASI Semih ÇALAMAK Doktora, Nanoteknoloji ve Nanotıp Anabilim Dalı Tez Danışmanı: Prof. Dr. Kezban Ulubayram Haziran 2018, Sayfa 148 Vücut sıvılarından kanser biyobelirteçlerinin tayini erken teşhis açısından büyük önem taşımaktadır. Lokalize yüzey plazmon rezonans (LSPR) bazlı sistemler hiçbir işaretleyici ajana gerek duymadan ultra-düşük (ag/mL) konsantrasyonlarda biyomoleküllerin tayininde kullanılan en güçlü optik biyosensör sistemleridir. Bu avantajlarına rağmen birçok biyomolekül için tespit limitleri istenilen seviyelerde değildir. Özellikle düşük moleküler ağırlına sahip belirteçler tespit edilememektedir. Bu tez çalışmasının amacı nanoplazmonik platformların hassiyetinin arttırılması ve düşük molekül ağırlıklı belirteçlerin tayini için altın nanopartiküllerin dinamik koşullarda (mikroakışkan platformlarda) “in-situ” olarak büyütürek plazmonik eşleşmelerin arttırılması ve böylece hassasiyeti arttırılmış, kolay ve maliyetsiz nanoplazmonik platformlar geliştirmektir. Tezin ilk bölümünde altın nanopartiküllerin elektrik alan etkileşimlerinin teorik analizleri yapılarak daha hassas bir ölçüm için en uygun altın nanopartikül boyutu ve konfigürasyonu incelenmiştir. Bu amaçla farklı partikül boyutuna sahip altın nanopartiküllerin (20, 50, 80 ve 100 nm) Mie teorisi yöntemi kullanılarak altın nanopartiküllerin yüzeylerinde meydana gelen elektrik alanlar incelenmiş ve en yüksek elektrik alan oluşturan nanopartikül boyutunun 50 nm olduğu bulunmuştur. Daha sonra 50 nm partikül boyutuna sahip altın nanopartikülün ikili, üçlü ve dörtlü dizileri oluşturulmuş en yüksek elektrik alan arttırımının 40.85 V/m ile dörtlü nanopartikül dizisinde olduğu ve 11.10 artış ii faktorüne (enhancement factor) sahip olduğu gösterilmiştir. Çalışmanın ikinci bölümünde ise elde edilen teorik veriler ışığında farklı partikül boyutuna sahip altın nanopartiküllerin polistiren (PS) yüzeylere polietilenimin (PEI) aracılığıyla immobilize edilerek yüzeylerin nanoplazmonik özellikleri incelenmiş ve nanoplazmonik yüzeylerin en keskin LSPR sinyalini 548±1.5 nm ile 1 mg/mL PEI ile immobilize edildiği yüzeylerin gösterdiği bulunmuştur. Tezin üçüncü bölümünde ise nanoplazmonik platformların hassasiyetinin arttırılması için maliyetsiz yeni bir yöntem geliştirilmiştir. Bu yöntemde PS yüzeye immobilize edilmiş altın nanopartiküller (50 nm) mikroakışkan platformlara entegre edilerek statik ve farklı akış rejimleri gösteren dinamik ortamlarda (laminar ve türbülans akış) “in-situ” olarak büyütülmüştür. Laminar ve türbülans akış rejiminin olduğu mikroakışkan çiplerde altın nanopartiküller artan LSPR sinyaliyle birlikte PS yüzeylerde daha homojen büyüdüğü ve tek sıra halinde diziler oluştuğu gözlenmiştir. “In-situ” partikül büyümelerinden sonra yüzeye başlangıçta 50 nm olarak immobilize edilen altın nanopartiküller statik ortam, laminar akış ve türbülans akış ortamlarında sırasıyla 110±14, 123±12 ve 175±6 ortalama partikül boyutuna ulaşmıştır. Ayrıca “in-situ” partikül büyütmelerinden sonra türbülans “in-situ” nanoplazmonik yüzeylerin LSPR sinyallerindeki sönüm yoğunluklarında 3 kata kadar artışla beraber maksimum dalga boyunda anlamlı kaymalar (kırmızı) gözlemlenmiştir. Tezin son bölümünde ise farklı molekül ağırlığına sahip prostat kanser biyobelirteçleri (BSA (66 kDa), TGF-β1 (12.8 kDa) ve BMP-2 (13 kDa) standart, statik (in-situ) ve türbülans (in-situ) nanoplazmonik yüzeylerde analiz edilmiştir. Türbülans (in-situ) nanoplazmonik yüzeylerin yüksek (BSA) ve düşük molekül ağırlıklı (TGF-β1 ve BMP-2) prostat kanseri biyobelirteçlerinin tayininde 1 pg/mL konsantrasyonundan itibaren standart olarak hazırlanan nanoplazmonik yüzeyler ve statik (in-situ) nanoplazmonik yüzeylere göre daha hassas olduğu gösterilmiştir. Bu sonuçlar, mikroçip içine entegre edilmiş nanoplazmonik platformun güvenilir, doğru, tekrarlanabilir ve uygulanabilir olduğunu göstermiştir

In situ silver nanoparticle synthesis on 3D-printed polylactic acid scaffolds for biomedical applications

An ultraviolet (UV) irradiation-based in situ silver nanoparticle (AgNP) synthesis approach has drawn significant attention for functionalizing a great variety of biomaterials. Here, we designed an AgNP-functionalized 3D-printed polylactic acid (PLA) composite scaffold with a green physical approach by employing the UV irradiation (1, 2, and 3 h) method without using any reducing agent or heat treatments. In situ AgNP synthesis was performed under different UV exposure times. The zeta sizer analysis results demonstrated that AgNPs were highly monodisperse with the particle size of 20 +/- 2.2, 30 +/- 3.6, and 50 +/- 4.8 nm under various UV light exposure times. In situ synthesis of AgNPs on 3D-printed PLA scaffolds significantly changed the surface hydrophilicity of the 3D-printed scaffolds. These results showed that UV irradiation-based in situ AgNP synthesis on 3D-printed PLA scaffolds can be useful in various biomedical applications, such as cell culture scaffolds, biosensors, and wound healing applications

Immobilization of heparin on chitosan-grafted polyurethane films to enhance anti-adhesive and antibacterial properties

Infections caused by bacteria adhering to implant surfaces are one of the main reasons for the failure of the implants. In this study, polyurethane (PU), which is the most commonly used polymer in the production of medical devices, was synthesized and surfaces of polyurethane films were modified by chitosan (CH) grafting and heparin (Hep) immobilization in order to enhance anti-adhesiveness and antibacterial properties. Functional groups present on the surface, topographical shapes, and free energies of the polyurethane films were determined. Pristine polyurethane, chitosan-grafted polyurethane (PU-CH), and heparin immobilized polyurethane (PU-CH-Hep) films demonstrated high anti-adhesive efficacy against bacteria in the given order, where PU-CH-Hep was the most effective one. When PU-CH-Hep samples were incubated with different bacteria, complete death was observed for Pseudomonas aeruginosa (Gram negative), Staphylococcus aureus (Gram positive), and Staphylococcus epidermidis (Gram positive). Some living Escherichia coli (Gram negative) were observed after 24h of incubation. Pristine and modified polyurethane samples demonstrated no adverse effect on proliferation of L929 fibroblast cells and were found to be biocompatible according to MTT cytotoxicity tests