APPROCCI DI PROTEOMICA E GLICOMICA NELL'EPATOCITA NORMALE E PATOLOGICO

2004/2005In questo lavoro si è cercato di fornire gli strumenti per l'analisi del proteoma della membrana plasmatica con particolare interesse nei confronti delle glicoproteine e delle eventuali modificazioni della loro componente oligosaccaridica, nell'ambito deii'HCC, con lo scopo di individuare nuovi marker glicoproteici da utilizzare in diagnostica e terapia. La componente oligosaccaridica delle glicoproteine di membrana viene coinvolta e continuamente rimaneggiata in diversi processi biologici, che vanno dalla regolazione del sistema immunitario alla comunicazione cellulare, dallo sviluppo embrionale alla capacità patogenetica degli agenti infettivi, dal ripiegamento della catena lineare dei polipeptidi fino allo sviluppo dei tumori e di altre importanti patologie[1J. La limitata disponibilità di dati sperimentali di riferimento per quanto riguarda un approccio di proteomica della membrana plasmatica, ha reso ardua l'interpretazione di molti dei risultati ottenuti riportati in questo lavoro di Tesi. In via preliminare si è reso necessario mettere a punto la maggior parte dei protocolli sperimentali atti ad ottenere il maggior grado di informazioni possibile in merito all'espressione differenziale delle glicoproteine di membrana. Questa fase propedeutica ma indispensabile ha impegnato gran parte del tempo richiesto per lo sviluppo di questo progetto di ricerca. L'approccio sperimentale ha previsto l'utilizzo di due modelli di linea epatocitaria. La linea CHANG, derivante da tessuto di fegato normale, mostra una notevole somiglianza con le cellule normali di fegato ed è citata spesso in letteratura come modello di epatocita in condizione fisiologica[2J. Le cellule HepG2 sono una linea cellulare stabilizzata in coltura derivata da cellule di un epatocarcinoma umano. In primo luogo è stato necessario mettere a punto un metodo di estrazione, confrontando e modificando alcune delle metodofogie già esistenti, al fine di sviluppare una strategia che permettesse di ottenere i risultati migliori in termini di purezza e arricchimento del campione proteico4 Più precisamente, tra queUe disponibili, due sono state messe a confronto e svituppate a seconda detre nostre esigenze . Analizzando i campioni di proteine estratte secondo la strategia differenziate proposta da MoUoyf31 dopo separazione etettroforeticai si è osservato un potenziale arricchimento in proteine dl membrana,. ma la contaminazione da parte della componente dtopfasmatica o proveniente dalle membrane degli organe Ui è. risultata essere ancora troppo a.fta .. Al metodo appena lndicato si è prefertto· queflo che prevede fa marcatura con un derivato della biotina e Ja successiva purificazione su colonna funzionalizzata con avidina[4l: si .è dimostrato, infatti, che attraverso questo metodo estrattivo si possono ottenere proteine che presentano un peso molecolare elevato e che per la maggior parte appartengono alla classe deHe glicoproteine, essendoci una buona corrispondenza tra n profiJo proteico rivelato in colorazione argentica e quello rivelato con un metodo di colorazione specifico per le glicoproteine (ProQ Emerald 300). Inoltre, tramite analisi di immunocitochimica, in fase pre-estrattiva, e di western blot si è verificato che tutte le proteine estratte sono biotinilate; infine, dai gel bidimensionali ottenuti sono evidenziabili le caratteristiche tipiche delle glicoproteine, che si presentano come trenini di spot costituiti delle diverse glicoforme esistenti, differenti tra loro sia per pi che per massa relativa. l'osservazione di questi risultati ci ha fatto ragionevolmente supporre che il metodo di estrazione e purificazione prescelto portasse, effettivamente, ad un arricchimento in proteine di membrana. Successivamente l'analisi comparativa eseguita sulle mappe prote;che relative alta linea· cellulare· CHANG ed HepG2 ha messo in luce numerose differenze, dì tipo proteìco, esistenti a livello della membrana cellulare, ma ha evidenziato anche aJcune somigJianze degne di nota. s; è sceJto dì cominciare l'identificazione delle proteine da quelle che risultavano comuni ad entrambe le linee cellulari e che, ad una prima osservazione dei gel, si presentavano come treni di spot associabili a diverse glicoforme di una glicoproteina. Le analisi di spettrometria di massa hanno fornito risultati interessanti·; anche se inaspettati.. Di particolare importanza è il ritrovamento di segnali attribuibili a proteine con funzioni di Chaperoninei4J .. Tra queste sono state identificate, costantemente:: GR.P78/Bip, HSP60, MTHSP75, HSP90, gp96/GRP94 per entrambe le linee cellulari., mentre POI è stata identificata nelle HepG2. Ed è stata proprio " l' inusualità " di .questo dato che ci ha stimolato a proseguire su una nuova linea interpretativa e a verificare fa possibilità che effettivamente queste proteine fossero presenti su una membrana plasmatica dei modelli cellulari studiati1 da un lato per vatidare le metodologie sviluppate, dall'altro per sfruttare il potenziale informativo fornito da un dato che, seppure anomalo, rimane comunque estremamente interessante. La particolarità di questo risultato risiede nella "anomala" localizzazione topografica di questa dasse di proteine che, normalmente, hanno una tipica.. ma non esclusiva.. localizzazione citoplasmatica o collocazione a livello di reticolo endoplasmatico. Per molte di queste chaperonine si è cercato di dare un interpretazione all'inconsueta localizzazione. In questo lavoro sono state analizzate in maniera più dettagllatate proteine che, tra quelle identificate, presentavano aspetti interessanti sia da.t punto di v.ista funzionale (HSP90 e GRP78) che glicobiologico (gp96). Caratteristica di· tutte- le- proteine- con localizzazione· a llveflo· def- RE, come- GRP94 e GRP78, è la presenza, nella porzione C-terminale, di una particolare sequenza amminoacidica KDEL {lys-Asp-Giu-Leu) che ne garantirebbe la· permanenza a- livello- del· REr51.. Nonostante questa peculiarità, esistono diversi riscontri sperimentali che dimostrano la localizzazione dì GRP78 e gp96 anche a livello della membrana plasmatìca dove sì. assocerebbero con altre proteine in alcuni casi non ancora identificate, per formare complessi di diverse dimensioni.. I meccanismi molecolari chiamati in causa per spiegare la "fuga" di proteine KDEL dal RE alla superficie della membrana plasmatica sono diversi. Ad esempio alcuni dati sembrerebbero attribuire questo evento ad una saturazione dei recettori per KDEL con conseguente perdita di alcune proteine che sarebbero in grado di migrare verso la membrana plasmatica. In altri casi il difetto nel sistema di ritenzione potrebbe essere dovuto alla presenza di .forme tronche delle proteine o difettive del dominio di riconoscimento. Un'altra ipotesi prevede che l'associazione delle proteine KDEL con proteine che sono destinate ad essere esportate verso la membrana plasmatica possa bloccare stericamente H dominio KDEL, impedendone l'interazione con il· rispettivo recettore e comportando la comigrazione verso la membrana plasmatica. Queste ossetvazioni, per quanto interessanti, rappresentano comunque solo interpretazioni finalistiche di un comportamento- che, alla fuce dei risultati riportati in questo favoro e di· quelli in letteratura, potrebbe essere molto più importante e di maggior significato biologico: non è un caso che tutti i dati più significativi e, al momento,. più. c.ompJeti. riguardano forme ceJJuJari associate a. trasformazioni neoplastiche .. Su HSP90, in letteratura, sono state fatte le considerazioni più interessanti. Dati recenti attestano la sua localizzazione sulla superficie cellulare in particolare sulla -membrana -dei -neuroni nelle fasi .precoci delt.o sviluppo de.l sistema nervoso: si ipotizza che questa chaperonina sia coinvolta nella migrazione cellulare[6J. Inoltre, è stato proposto che, sulla superficie cellulare, .HSP90 svolgesse un .ruolo attivo, in questo caso ln senso migratorio, partecipando a qualche meccanismo che· porta la cellula a· staccarsi dalla matrice extracellulare e dalle cellule vicine. Questo dipenderebbe dalla stretta relazione che esiste tra HSP90 e MMP2, enzima. coinvolto nel rimodellamento-della-matrice extracellulare[7l. Dal punto dì vista dì un approccio glicomico alla trasformazione neoplastìca e facendo salvo il concetto ormai accettato e dimostrato della stretta associazione tra. Ja trasformazione neo.pJastica e la: modificazione dei. pattem di glicosilazione appare piuttosto interessante l'osservazione secondo la quale alcune di queste proteine vengano attivate ad alti livelli in presenza di inibitori della glicosilazione. Le alterazioni della glicosilazione potrebbero essere, entro certi limiti, assimilate agli effetti prodotti dal trattamento con inibitori della glicosilazione. Non bisogna dimenticare, inoltre, che questi chaperone molecolari sono deputati al controllo e alla successiva eliminazione di proteine non correttamente ripiegate e/o glicosilate: una loro alterata funzionalità potrebbe risolversi in una mancata eliminazione o sequestramento detta proteina non funzionale con conseguente trasporto della stessa al compartimento di competenza. La presenza, quindi, di proteine non correttamente gticosilate sulla membrana plasmatica potrebbe essere· dovuta a meccanismi di· eliminazione alterati a livello del RE- e del· Golgi. Certamente questa è semplice considerazione ipotetica che, in ogni caso, potrebbe costituire una buona base di partenza per ulteriori e più a-pprofonditi. studi. In questo lavoro si è cercato non solo di ottenere gli strumenti per facilitare la comprensione del proteoma di membrana ma anche. porre. te basi per lo studio e ·la caratterizzazione degli N-glicani associati a questo compartimento. Quest'ultimo aspetto sperimentale è piuttosto rilevante: la possibilità di sviluppare una gUcoproteomica in senso stretto- si è sempre scontrata con .ta sostanziale incompatibilità dei metodi disponibili in letteratura, che comportavano o la perdita della componente saccaridica o n· sacrificio di quella proteicarsJ. Fintanto che l'approccio glicoproteomico era rivolto esclusivamente all'identi.ficazione de.l complessQ delle proteine espresse da una cellula; ciò· non· ha mai costituito un problema; quando· invece si rende necessaria un'analisi di un compartimento esclusivo come quello della membrana plasmatica, dove la componente glicoproteica è poco rappresentata, il discorso è diverso. In taf senso, f'ottimìzzazìone degfi approcci sperimentali di 2-DE che consentono la simultanea caratterizzazione della porzione oligosaccaridica e di quella proteica è auspicabile se non indispensabile... Proprio in quest'ottica risiede l'importanza dei risultati ottenuti in questo ·lavoro, ossia nell'aver messo a punto un efficiente metodo di degli cosilazione in gelr9J in associazione alla separazione 20-E, che permettesse di mantenere integra ed analizzabile sia la componente oligosaccaridica che quella proteica, per lo sviluppo di una completa glicomica della membrana plasmatica.XVIII Ciclo1974Versione digitalizzata della tesi di dottorato cartacea

"The good, the bad and the ugly" of chitosans

The objective of this paper is to emphasize the fact that while consistent interest has been paid to the industrial use of chitosan, minor attention has been devoted to spread the knowledge of a good characterization of its physico-chemical properties. Therefore, the paper attempts to critically comment on the conflicting experimental results, highlighting the facts, the myths and the controversies. The goal is to indicate how to take advantage of chitosan versatility, to learn how to manage its variability and show how to properly tackle some unexpected undesirable features. In the sections of the paper various issues that relate chitosan properties to some basic features and to advanced solutions and applications are presented. The introduction outlines some historical pioneering works, where the chemistry of chitosan was originally explored. Thereafter, particular reference is made to analytical purity, characterization and chain modifications. The macromolecular characterization is mostly related to molecular weight and to degree of acetylation, but also refers to the conformational and rheological properties and solution stability. Then, the antimicrobial activity of chitosan in relation with its solubility is reviewed. A section is dedicated to the formulation of chitosan biomaterials, from gel to nanobeads, exploring their innovative application as active carrier nanoparticles. Finally, the toxicity issue of chitosan as a polymer and as a constructed nanomaterial is briefly commented in the conclusions

Deep Learning Using Preoperative AS-OCT Predicts Graft Detachment in DMEK.

PurposeTo evaluate a novel deep learning algorithm to distinguish between eyes that may or may not have a graft detachment based on pre-Descemet membrane endothelial keratoplasty (DMEK) anterior segment optical coherence tomography (AS-OCT) images.MethodsRetrospective cohort study. A multiple-instance learning artificial intelligence (MIL-AI) model using a ResNet-101 backbone was designed. AS-OCT images were split into training and testing sets. The MIL-AI model was trained and validated on the training set. Model performance and heatmaps were calculated from the testing set. Classification performance metrics included F1 score (harmonic mean of recall and precision), specificity, sensitivity, and area under curve (AUC). Finally, MIL-AI performance was compared to manual classification by an experienced ophthalmologist.ResultsIn total, 9466 images of 74 eyes (128 images per eye) were included in the study. Images from 50 eyes were used to train and validate the MIL-AI system, while the remaining 24 eyes were used as the test set to determine its performance and generate heatmaps for visualization. The performance metrics on the test set (95% confidence interval) were as follows: F1 score, 0.77 (0.57-0.91); precision, 0.67 (0.44-0.88); specificity, 0.45 (0.15-0.75); sensitivity, 0.92 (0.73-1.00); and AUC, 0.63 (0.52-0.86). MIL-AI performance was more sensitive (92% vs. 31%) but less specific (45% vs. 64%) than the ophthalmologist's performance.ConclusionsThe MIL-AI predicts with high sensitivity the eyes that may have post-DMEK graft detachment requiring rebubbling. Larger-scale clinical trials are warranted to validate the model.Translational relevanceMIL-AI models represent an opportunity for implementation in routine DMEK suitability screening

SARS-CoV-2 RNA Recovery from Air Sampled on Quartz Fiber Filters: A Matter of Sample Preservation?

The airborne route of transmission of SARS-CoV-2 was confirmed by the World Health Organization in April 2021. There is an urge to establish standardized protocols for assessing the concentration of SARS-CoV-2 RNA in air samples to support risk assessment, especially in indoor environments. Debates on the airborne transmission route of SARS-CoV-2 have been complicated because, among the studies testing the presence of the virus in the air, the percentage of positive samples has often been very low. In the present study, we report preliminary results on a study for the evaluation of parameters that can influence SARS-CoV-2 RNA recovery from quartz fiber filters spotted either by standard single-stranded SARS-CoV-2 RNA or by inactivated SARS-CoV-2 virions. The analytes were spiked on filters and underwent an active or passive sampling; then, they were preserved at −80 °C for different numbers of days (0 to 54) before extraction and analysis. We found a mean recovery of 2.43%, except for the sample not preserved (0 days) that showed a recovery of 13.51%. We found a relationship between the number of days and the recovery percentage. The results presented show a possible issue that relates to the quartz matrix and SARS-CoV-2 RNA recovery. The results are in accordance with the already published studies that described similar methods for SARS-CoV-2 RNA field sampling and that reported non-detectable concentrations of RNA. These outcomes could be false negatives due to sample preservation conditions. Thus, until further investigation, we suggest, as possible alternatives, to keep the filters: (i) in a sealed container for preservation at 4 °C; and (ii) in a viral transport medium for preservation at a temperature below 0 °C.This research was funded by University of Trieste Atheneum Fund for scientific research (2021) and IRCCS Burlo Garofolo (RC47/20)

Polymer Conjugates of Antimicrobial Peptides (AMPs) with d-Amino Acids (d-aa): State of the Art and Future Opportunities

In recent years, antimicrobial peptides (AMPs) have enjoyed a renaissance, as the world is currently facing an emergency in terms of severe infections that evade antibiotics’ treatment. This is due to the increasing emergence and spread of resistance mechanisms. Covalent conjugation with polymers is an interesting strategy to modulate the pharmacokinetic profile of AMPs and enhance their biocompatibility profile. It can also be an effective approach to develop active coatings for medical implants and devices, and to avoid biofilm formation on their surface. In this concise review, we focus on the last 5 years’ progress in this area, pertaining in particular to AMPs that contain d-amino acids, as well as their role, and the advantages that may arise from their introduction into AMPs

Galectin-1 in cartilage: expression and influence on chondrocytes growth and interaction with ECM components

Galectin-1 is a 14 kDa beta-galactoside binding protein, capable of forming lattice-like structures with glycans of cellular glycoconjugates and inducing intracellular signaling. The expression of Galectin-1 in porcine cartilage is described in this work for the first time. Immunocytochemical methods revealed distinct distribution patterns for both articular and growth plate cartilage. In articular cartilage, the highest reactivity for Galectin-1 was found in all chondrocytes at the superficial zone and in most of those at the lower layer of the middle zone. In the growth plate, marked reactivity was seen in chondrocytes at the proliferative zone and reached a maximum level for the column-forming cells at the hypertrophic zone. In addition, different Galectin-1 distribution patterns were observed at the subcellular level. With regards to the metabolic effects of Galectin-1, the results in vitro seem to indicate an inhibitory effect of Galectin-1 on articular chondrocyte anabolism (i.e. inhibition of cell proliferation and anabolic gene expression) and a stimulation of catabolic processes (i.e. induction of matrix degradation and hypertrophy marker expression). These data represent a starting point for the understanding the molecular mechanisms underlining ECM\u2013Galectin-1 interaction and the subsequent signaling\u2013cell transduction processes involving cartilage formation and maturation

\u201cAlginate/Hydroxyapatite Biocomposite For Bone Ingrowth: A Trabecular Structure With High And Isotropic Connectivity\u201d

Alginate/hydroxyapatite composite scaffolds were developed using a novel production design. Hydroxyapatite (HAp) was incorporated into an alginate solution and internal gelling was induced by addition of slowly acid hydrolyzing D-gluconic acid \u3b4-lactone (GDL) for the direct release of calcium ions from HAp. Hydrogels were then freeze-casted to produce a three-dimensional isotropic porous network. Scanning electron microscopy (SEM) observations, confocal laser scanning microscopy (CLSM) and microcomputed tomography (\u3bc-CT) analysis of the scaffolds showed an optimal interconnected porous structure with pore sizes ranging between 100 and 300 \u3bcm and over 88% porosity. Proliferation assay and SEM observations demonstrated that human osteosarcoma cell lines were able to proliferate, maintain osteoblast-like phenotype and massively colonize the scaffold structure. Overall, these combined results indicate that the novel alginate based composites efficiently support the adhesion and proliferation of cells showing at the same time adequate structural and physical-chemical properties for being used as scaffolds in bone tissue engineering strategies

Microwave-Assisted Cyclization of Unprotected Dipeptides in Water to 2,5-Piperazinediones and Self-Assembly Study of Products\uad and Reagents

Dipeptides and their cyclized 2,5-piperazinedione (or diketopiperazine, DKP) derivatives are attractive building blocks for supra\uadmolecular hydrogels. The Phe-Phe, (p-nitro)-Phe-Phe, and Phe-Val dipeptides and their corresponding DKPs are studied for self-assembly in water. The DKPs were obtained in high yields by microwave-assisted cyclization\uad of the dipeptides in water, demonstrating that use of their methyl ester derivatives as reported in the literature is not necessary for successful cyclization. Single-crystal XRD structures are reported for two DKPs as well as stable hydrogels at neutral pH